Summary
phagokinetic 운동성 트랙 분석은 세포의 움직임을 평가하는 데 사용되는 방법입니다. 특히, 분석은 양적 방식으로 시간이 지남에 chemokinesis (임의의 셀 운동성)을 측정합니다. 검정은 콜로이드 골드 코팅 coverslips에 미치는 운동의 측정 트랙을 만들 수있는 세포의 능력을 활용합니다.
Abstract
세포 운동성은 단세포 및 다세포 생물 모두에게 중요한 생물학적 과정입니다. 그것은 영양소 나 거리에 적합 조건뿐 아니라 조직 개발, 면역 감시 및 상처 치유에 대한 다세포 생물에서와 같이, 단 몇 역할을 하나, 둘, 셋을 언급하는의 근원에 대한 단세포 생물의 움직임에 필수적입니다. 이 과정의 규제 완화는 심각한, 신경 심혈관 및 면역 질환뿐만 아니라 악화 종양 형성으로 이어질와 4,5 확산 될 수 있습니다. Molecularly, 고를 중합 및 수용체 재활용이 셀 6,7,8의 전진 운동을 유도 세포의 확장 (lamellipodia)를 만드는 중요한 역할을 재생 표시되어 있습니다. 그러나, 세포 마이그레이션하는 것에 대한 많은 생물 질문받지 않은 남아 있습니다.
인간의 건강과 질병의 세포 운동성의 중심 역할은 특정 멕을 이해의 중요성을 강조hanisms이 과정에 참여, 특히 중요한 세포 운동성을 평가하는 정확한 방법을합니다. 현미경은 일반적으로 세포의 움직임을 시각화하는 데 사용됩니다. 그러나, 세포는 운동성 세포의 정량 시간이 실효 영화를 만들 고가의 카메라와 소프트웨어를 필요로하는 리소스를 소모 과정을 세포 이주의 양적 측정을, 오히려 천천히 이동합니다. 따라서, 비용 효율적인 비 힘드는, 그 일반적인 실험실 장비를 활용합니다 세포 이주의 양적 측정을 수행 할 수있는 능력은 많은 연구자를위한 훌륭한 필요합니다.
phagokinetic 트랙 운동성 분석은 콜로이드 골드 코팅 유리 coverslip 9,10에 측정 트랙을 만들 수는 경로에서 금 입자를 삭제하는 이동 셀의 능력을 활용합니다. 자유롭게 사용할 소프트웨어의 사용으로 여러 트랙이 통계 요구 사항을 달성하기 위해 각 치료를 평가 할 수 있습니다. 검정은 평가하기 위해 활용 될 수있다이러한 암 세포 11,12, 섬유 아세포 9, 호중구 13, 골격근 세포 14, keratinocytes 15, trophoblasts 16, 내피 세포 17와 단핵 세포 10,18-22 많은 세포 유형의 운동성. 프로토콜은 나트륨 구연산의 chloroauric 산 (호주 3 +)의 감소에 의해 생성 된 금 나노 입자 (호주 °)으로 코팅 슬라이드의 생성을 포함한다. 이 방법은 1951 23인치 Turkevich 외에 의해 개발 된 후 Frens 외하여 1970 년대 향상되었습니다. 24,25. 이 화학 감소 단계의 결과로, 금 입자 (직경 10-20 nm 정도)는 반응 혼합물로부터 침전 및 셀룰러 마이그레이션 분석 9,26,27에서 사용하기위한 다음 준비가되어 유리 coverslips에 적용 할 수 있습니다.
일반적으로 phagokinetic 트랙 운동성 분석 세포 운동성의, 빠른 양적 쉽게 측정하기위한 한 방법입니다. 또한,시간이 실효 영상뿐만 아니라 연구자의 필요에 따라 다른 용도 의무가없는 세포 유형에 사용할 수 있도록 간단한 높은 처리량 분석으로 활용 될 수있다. 함께 양적 비싼 현미경 및 소프트웨어 필요없이 여러 세포 유형의 세포 운동성을 측정 할 수있는 능력은 일반적인 실험실 장비와 화학 물질의 사용과 함께, 휴대을 이해 phagokinetic 트랙 운동성 분석에게 관심이있는 과학자를위한 견고한 선택을 운동성.
Protocol
1. 젤리 - 코팅 Coverslips의 작성
- 멸균 플라스틱 100mm 요리 (ES)의 장소 산 세척 유리 coverslips (직경 15mm). 요리 당 8-9 coverslips을 놓고 서로가 서로를 만지거나 요리의 측면 있지 않은지 확인 ...
참고 : Coverslips, 바늘과 핀셋이 가능한 오염 미생물뿐만 아니라, 운동성 등의 세포 기능에 영향을 미칠 것입니다 endotoxins을 제거 할 무균 있어야합니다.
- 젤라틴 가루를 무게 0.5 g/300 ML의 최종 농도와 젤라틴 솔루션을 만들기 위해 탈 이온수의 분말을 resuspend. 다음, 젤라틴 솔루션은 autoclaved해야합니다.
- 피펫 2-3 각 coverslip에 젤라틴 (~ 100-150 ML)로 떨어.
참고 : 젤라틴은 접시를 터치하거나 요리에서 coverslips을 제거 할 수 없습니다 허용하지 않도록주의하십시오.
- 10 분 동안 90 ° C에서 오븐에 100mm 요리에 젤라틴 코팅 coverslips을 구워.
- 부드러운 pipetting하여 초과 젤라틴을 제거합니다.
- 45 분에 70에서 오븐에 100mm 요리 ° C에서 coverslips를 말린다.
- 일단 건조, 살균, 독소 - 무료 바늘과 핀셋을 (needle을 부드럽게 제거 부드럽게 핀셋에 액세스 할 수 있도록 coverslip을 자극하는 데 사용)를 사용하여 100mm 요리에서 coverslips를 제거합니다.
- 24 잘 접시 별도의 우물로 개별 젤라틴 코팅 coverslips를 놓습니다.
2. 콜로이드 금 코팅 Coverslips의 작성
- chloroauric 산 (tetrachloroauric 산 trihydrate, HAuCl 4 · 3H 2 O)의 적절한 양을 무게 후 최종 14.5 MM 솔루션을 (독성) 준비하기 위해 무균 탈 이온수에 resuspend. 8-9 coverslips 당 솔루션의 1.5 ML를 준비합니다.
경고 : Chloroauric 산 반장님입니다한 이름 삼킨 경우는 심각한 피부 화상 및 눈 손상을 원인과 알레르기 피부 반응을 일으킬 수 있습니다. 독성 삼킨 경우.
- 나트륨 구연산의 적절한 양의 무게 (trisodium dihydrogen 2-hydroxypropane-1 ,2,3-tricarboxylate, 오세영 3 C 6 H 5 O 7) 한 후 최종 0.5 % 솔루션을 만들기 위해 탈 이온수의 분말을 resuspend. 8-9 coverslips 당 솔루션 1 ML을 준비합니다.
경고 : 나트륨 구연산은 눈과 피부 자극의 원인이 될 수 있습니다. 또한 호흡기 및 소화 기관의 염증을 일으킬 수 있습니다.
- 살균, 독소 - 무료 비커에서 무균 14.5 MM HAuCl 4 솔루션과 살균 탈 이온수의 13.5 ML의 1.5 ML을 결합하고, 결과는 희미한 노란색 솔루션을 얻을 수 있습니다. 앞서 언급 한 권 한 할 8-9 콜로이드 골드 coverslips을 허용합니다.
- 지속적으로 교반 동안은 B로 시작 때까지 핫 플레이트에 솔루션을 가열오일.
경고 : 증기는 유독 / 유해 할 수 있으므로 솔루션의 가열가 연기 후드에서 수행해야합니다. 증기는 점액을 분비하는 세포막과 상부 호흡기 기관의 조직 파괴합니다.
- 핫 플레이트에서 비커를 제거합니다.
- 교반 동안 0.5 % 나트륨 구연산 솔루션의 0.7 ML를 추가합니다. 앞서 언급 한 볼륨이 만들어 질 수있는 8-9 콜로이드 골드 coverslips을 허용합니다.
- 약 2 분이 결합 된 솔루션을 교반 유지 (참고 : 솔루션의 색상이 점점 드디어 레드 와인에 도달하기 전에, 깊은 보라색으로, 보라색으로, 회색으로, 삭제하거나, 바람직하게는, 녹 색, 희미한 노란색에서 변경됩니다) . 이 제품은 콜로이드 금 솔루션입니다.
- 1-2 분 (콜로이드 금 솔루션이 추가 될 때 녹는에서 coverslip에 젤라틴 층을 유지하기 위해)에 대한 10 ML 피펫의 콜로이드 금 솔루션을 냉각 한 후 colloida의 1.0-2.0 ML을 추가참조 - 이전에 24 잘 요리 (ES) (당신이 젤라틴 코팅 coverslips에 추가 콜로이드 금 솔루션의 양이 금 입자가 용액에 시켰던 얼마나 잘에 따라 달라집니다에 배치 각 젤라틴 코팅 coverslip로 난 금 솔루션 아래에 덧글).
참고 : 금 입자 강수량의 효율성의 변화가있을 수 있기 때문에, 그것은 먼저 젤라틴 코팅 coverslips에 콜로이드 금 솔루션의 0.5-1 ML을 추가하고 0.5 시간 동안 보육에 24 잘 접시를 배치 할 것이 좋습니다 . 이 부화 시간 후, coverslips는 coverslips에 금 입자의 적절한 밀도의 빛 현미경으로 확인해야합니다. 금 입자를 너무 낮게하고 너무 높은 농도의 예 20x 현미경 이미지를 그림 1을 참조하십시오. 금 입자 (적어도 단핵 세포와 함께 사용하기위한)의 이상적인 농도의 40x 현미경 이미지에 대한 그림 2를 참조하십시오. 선택다른 세포의 특성이 coverslips에 운동의 힘을 지시하므로 슬라이드의 금 나노 입자의 imal 밀도는 실험적으로, 사용되는 각 세포 유형에 대한 결정해야합니다. 금 입자의 농도가 부족한 경우, 젤라틴 코팅 coverslips에 콜로이드 금 솔루션의 추가 0.5-1 ML를 추가합니다.
셀의 크기에 따라, 금 입자의 적절한 농도는 다를 수 있으며, 따라서 궁극적으로 운동성에 대한 검사 셀의 크기에 따라 달라집니다. 예를 들어, 소형 전지 (~ 10-20 μm 28) 인간 단핵 세포와 금 입자의 높은 농도는 우리의 분석이 필요했습니다. 금 나노 입자의 적절한 배포 쉽고 효율적으로 세포 트랙의 가장자리를 구별 할 수있는 능력을 가진 연구자를 제공합니다. 너무 높은 금 입자의 농도가 정확하게 측정하는 것이 이동하는 세포의 능력을 바구니자신의 운동성 반면, 운동성의 정확한 트랙을 윤곽을 그리다가 너무 낮은 제한 사람의 능력입니다 금 입자의 농도.
중요 참고 : 금 나노 입자의 합성이 문제가있는 경우, 합성 금 나노 입자가 5 nm의에서 400 nm의에 크기 상업적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 형광 마이크로은 세포 운동성 29 연구에서도 사용되었습니다. 그러나, 이러한 마이크로의 사용은 세포 이주의 분석을위한 형광 현미경이 필요합니다.
- 37 보육의 콜로이드 금으로 덮인 coverslips과 24 잘 접시를 놓고 1 시간에서 하룻밤을 ° C 및 품다.
- 부화 후 린스 / (PBS, pH를 7.4) 생리 버퍼 멸균 인산에 coverslips을 (3 배) 찍어하여 언 바운드 금을 제거합니다.
- PBS를 포함하는 깨끗한 12 잘 요리 (ES)에서 이러한 콜로이드 골드 코팅 coverslips를 놓습니다.
- 4 번 ° C까지 해당 coverslips를 저장 할 준비가(parafilm 냉장고에 넣어 전에 판)을 사용합니다.
중요 참고 : 항상 금 입자는 coverslips에서 플레이크 마를 허용되는 경우 할 수있는 액체 / 미디어의 일부 유형의 콜로이드 골드 코팅 coverslips를 유지. 콜로이드 골드 coverslips는 그들이 만든 된 날짜 2-3개월 내에서 사용되어야합니다.
품질 관리 : 단일 phagokinetic 트랙 운동성 분석에서는 금 입자의 비슷한 농도에 의해 특징입니다 coverslips를 사용하는 것이 중요합니다. 이 간단한 점은 치료가 아닌 콜로이드 골드 코팅 coverslips의 물리적 특성의 성격에 전적으로 인해 할 샘플 사이의 세포 운동성의 양적 차이가있게됩니다. 우리가 금 나노 입자의 밀도만큼 오래가 동일한 것으로 나타났습니다하지만 우리는 각각의 실험에서 같은 시간에 한에서만 coverslips를 사용하여 선호, coverslips의 사용다른 준비에서 적합합니다.
3. 세포 운동성 분석
- 관심 세포에 적절한 세포 미디어에서 콜로이드 골드 코팅 coverslips를 놓습니다.
- 24 잘 요리 (ES)에 배치 콜로이드 골드 코팅 coverslips에 적절하게 치료 세포를 전송
참고 : 하나의 잘으로 전송 세포의 수는 각 세포 유형은 공부에 대한 결정해야합니다. 이상적으로, 세포는 동등 결과적으로 하나의 셀에 의해 생성 만 트랙의 통계 분석을 위해 수 콜로이드 골드 코팅 coverslip에 배포해야합니다. 세포가 너무 높은 농도에 도금하는 경우, 그것은 여러 세포의 중복 트랙이 보이는 것을 매우 가능성이된다. 중복 트랙이 정확하게 quantitated 할 수 없으며, 따라서, 그것들은 테스트 세포의 움직임의 최종 분석에서 고려 할 수 없습니다. 의 결과로 트랙을 중복여러 셀의 참여은 일반적으로 쉽게 관찰되며, 두 개 이상의 셀이 동일한 연속 해제 지역에서 관찰 할 수있는 트랙을 (분석 분야의) 합병 또는 교차 있습니다.
- 37 품다 ° 24 시간을위한 C / 5 % CO 2 (또는 적절한 시간에, 우리는 6 시간 및 12 시간 후 치료 24 시간 후 치료 및 내피 세포 사이의 단핵 세포 운동성를 분석 한 예를). 셀 타입 공부하고, 따라서 실험적으로 각 셀 타입 (- 12 시간 게시물 트리트먼트 좋은 출발점은 그러나, 6이다)에 대해 결정해야와 세포 운동성을 결정하고 측정하기위한 최적의 시간 프레임이 달라집니다.
참고 : 실험 콜로이드 골드 코팅 coverslips는 나중에 저장 및 / 또는 분석해야하는 경우, 셀 및 금 나노 입자가 coverslips에 고정해야합니다. 이 고정 단계 달성하기 위해, 다음과 같은 단계 3.3 처음 세탁은 1X와 함께 조심스럽게 2 번 coverslipsPBS은 (coverslips에서 금 나노 입자의 제거가 피할 수해야하기 때문에 coverslips의 찍어 것은 바람직하다), 그러한 상온 3 % paraformaldehyde로 부화 등의 표준 셀 고정 방법을 사용합니다. 15 분 부화 후, 3 % paraformaldehyde가 제거되어야하며 coverslips는 1X PBS로 조심스럽게 3 번 씻어. 고정 coverslips는 냉장고에 저장 될 수 있습니다.
- 가벼운 현미경 사용하여, 하나의 이동 셀 (: 확실히 조사중인 세포 유형에 따라 달라집니다 휴대 트랙의 사진을 찍어하는 데 사용되는 배율 주)에서 만든 트랙의 이미지를 캡처합니다. 콜로이드 골드 코팅 coverslips에 비 운동성 및 운동성 세포에 의해 생성 세포 트랙의 예는 그림 2에 표시됩니다.
참고 : phagokinetic 트랙 운동성 분석에 사용되는 크기의 금 나노 입자가 세포 30에 완전히 독성이 발견되었습니다. 필요한 경우, 심사 세포의 생존 능력은 trypan 파란색으로 얼룩에 의해 평가 또는 세포 생존 능력의 다른 마커에 대한 검사를 할 수 있습니다. 하나는이 단계를 수행해야하는 경우, 계정에 고정 등의 고정, 유형에 대한 필요성을해야합니다.
- 이러한 ImageJ 소프트웨어 (등 자유롭게 사용 가능한 소프트웨어 사용 http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) 또는 NIH 이미지 ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/ 에서 개발), 모두 보건 국립 연구소, 또는 ImageTool ( http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html는 ) 산 안토니오 (San Antonio)에서 텍사스 건강 과학 센터에 의해 삭제 콜로이드 금의 평균 면적 (임의의 단위)의 대학에서 개발 10-20 이상 세포 (샘플 당) 캡처 된 이미지에서 각 실험 팔에 결정됩니다. 통계는 다음 t를 수행 할 수 있습니다그는 결과를 수집. 예를 들어, 결과는 의미로 역모를 할 수 있습니다 ± 샘플 사이의 통계적 유의미성의 척도로 사용 학생의 t 수행 검사, 및 P 값이 <0.05과 수단 (SEM)의 표준 오류를.도 3 및도 4 쇼 단계 세포에 의해 삭제 콜로이드 금의 지역의 분석.
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Representative Results
표시는 하나의 셀 (우리의 실험에서 단핵 세포는 그림 2에 표시되어 있습니다)에 의해 삭제 트랙 영역을 표시하는 가벼운 현미경으로 촬영 한 사진의 예입니다. 비 운동성 세포는 특성 작고, 타원형 또는 이들 unstimulated 세포 (그림 2A와 2B)에 대한 운동의 낮은 기저 수준을 나타내는 스스로 주위에 원 모양의 책자를 만들 수 있습니다. 반면, 높은 운동성 세포 [시스템에서 인간 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV)에 감염된 세포는] 가늘고 긴 트랙 영역으로 그림 2C와 2D를에 표시된 방향 움직임을 특징으로하고 있습니다. 40x 목적으로 역 현미경을 사용하여 트랙 영역의 여러 사진을 취득 후, 총 트랙 영역은 ImageJ 소프트웨어 (그림 3)를 사용하여 표시했습니다, 유사한 결과는 다른 소프트웨어 응용 프로그램과 함께 얻을 수 있습니다. 는 무료이며 사용하기 쉽게 때문에 우리는 ImageJ 소프트웨어를 선호. 운동성 세포는 표준, 기하학적 모양의 트랙을 두를 생성하지 않습니다움직임을 쳐, 따라서 분석 할 수있는 영역을 표시 할 수있는 편리한 방법은 이동 셀 (그림 3)에 의해 생성 트랙의 모양을 표시하기 위해 ImageJ 소프트웨어의 프리 핸드 도구를 선택하는 것입니다. 데이터의 양적 측정이 ImageJ 메뉴 모음에서 "분석"을 클릭하고 풀다운 메뉴에서 "측정"을 선택하여 수행, 분석 할 트랙 영역을 구분 말했습니다. 그림 3에 제시된 데이터를 수집 휴대 트랙 영역을 분석하여 얻은 임의의 단위로 결과의 샘플 그림 4A에 표시됩니다. ImageJ 소프트웨어에서 수집 된 결과는 다음 그림 4B와 같이 셀 당 지워 평균 추적 영역의 계산을 할 수 있도록 선택의 스프레드 시트에서 분석 할 수 있습니다.
우리의 경험에서 프로토콜의 가장 문제 단계는 콜로이드 골드 코팅 coverslips의 생산이며 우려의 문제는 g입니다금 나노 입자 (이 문제와 관련된 문제가 위의 2.8에 나와있는)의 균일 한 커버리지와 coverslips의 eneration. coveslip에 금 나노 입자의 적절한 균일 한 커버리지는 그림 2에 표시됩니다. (인물 1C 및 1D)이 너무 조밀 (그림 1A와 1B) 또는 너무 희박한입니다 범위는 세포 이주를 방지하거나 크기와 트랙 지역의 형상의 재현 분석을 변경합니다. 위의 3.2에 나와있는 두 번째 핵심은, 도금 세포의 밀도 및 다중 셀에서 트랙을 중복 또는 합병을 방지 할 필요가 있습니다.
1 그림. Coverslips에 콜로이드 골드의 밀도있는 잠재적 인 문제.이 그림에 표시를하거나 (너무 높은 패널과 콜로이드 골드 코팅 coverslips의 예입니다
그림 2. 비 운동성에 의해 생성 트랙의 예 (패널 A 및 B) 및 콜로이드 골드 코팅 coverslips에 운동성 (패널 C와 D) 세포. 바이러스 무료 바이러스 입자를 포함하는 미디어 (모의에 감염된) 또는 미디어 (HCMV에 감염된)이었다 절연 peripher에 추가알 혈액 단핵 세포 10,18-22. 단핵 세포는 37 incubated ° C / 5퍼센트 37 24 시간을위한 콜로이드 골드 코팅 coverslips로 1 시간 후 도금 ° C / 5퍼센트 CO 2에 대한 CO 2.했다 사진은 40x 목표를 사용하여 촬영 된 것입니다. 흰색 화살표는 최종 위치에 단핵 세포를 표시합니다. 우리가 이전에 10,18-22 증명 한 바와 같이 HCMV에 감염된 세포가 높은 운동성의 특성을 표시하는 동안 감염되지 않은 단핵 세포는 운동성의 낮은 기저 레벨을 특징으로하고 있습니다. 크기 막대의 길이는 25 μm에 해당합니다.
그림 3. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 세포 트랙의 영역을 표시하는 중입니다. 표시 예입니다 이미지 J 소프트웨어 (비 운동성 (패널 A와 B)과 운동성에 의해 생성 된 트랙의 분석 기간 동안 사용 된있는 트랙의 스냅 샷 패널 C와D) 콜로이드 골드 코팅 coverslips (주에 대한 세포 : 운동은 ImageJ의 프리 핸드 도구)를 사용하여 흰색 선으로 원하고 있습니다. 샘플 사진, 그림 2에 표시된 동일은 하나의 세포에 의해 삭제 트랙 영역을 측정 할 수이 그림에 사용되었습니다. 이는 모의과 HCMV에 감염된 단핵 세포의 대표적인 이미지입니다 그러나, 보통 10-20 이미지는 샘플 당 분석하고 있습니다. 크기 막대의 길이는 25 μm에 해당합니다.
4 그림. ImageJ 소프트웨어 및 스프레드 시트를 사용하여 세포 운동성의 수량 평가. A) 세포에 의해 삭제 측정 트랙 영역 등 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 샘플 사진 (도 2 및도 3)에 묘사. 계산 결과 # 1, # 2, # 3, # 4 패널에 해당 B, C 및도 2 및도 3에서 D, 평균 지역의 B) A 그래픽 표현 (수단;. 임의의 단위) 세포에 의해 삭제 및 ImageJ 소프트웨어 분석했다. 예에서 복제의 부족 번호가 분석되기 때문에이 예에서 평균의 표준 오차는 표시되지 않습니다. 참고 : ImageJ 소프트웨어는 임의의 단위로 트랙의 측정 영역을 제공하므로,이 같은 배율에서 촬영 트랙의 사진을 비교하는 것이 중요합니다. 별도의 실험의 결과를 비교하는 가장 간단한 방법은 검사 샘플 사이의 배 변경 사항을 비교하는 것입니다.
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Discussion
이 문서에서 제시 phagokinetic 트랙 운동성 분석은 세포 이주의 정량 분석을위한 간단하고 매우 효과적인 방법입니다. 여러 셀 타입은 9-17을 분석 할 수 있기 때문에,이 방법은 여러 분야에 걸쳐 잠재적 인 폭 넓은 사용이 있습니다. 콜로이드 골드 코팅 유리 coverslips의 사용은 움직이는 세포에 의해 삭제 트랙 영역의 측정 할 수 있습니다. 검정은 세포 운동성에 (ECM의 리간드, 바이러스, 박테리아를 정화 즉, 성장 요소) 다른 자극의 효과를 측정 할 수 있습니다. 또한, 셀 고정에 대한 요구의 부족은 다른 실험 시간 지점에서 세포 마이그레이션 모니터링 할 수 있습니다. 또한, 분석은 표준 광 현미경, CCD (전하 결합 소자) 이미지 센서와 자유롭게 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 표준 카메라가 필요합니다. 따라서 정교한 현미경과 카메라가 필요하거나 특별한 소프트웨어 스위트 아르되지 않습니다. 비록 엉덩이에불안은 디자인 간단하다, 그것은 통계적으로 실험 조건의 다양한에서는 여러 세포 유형의 운동성을 연구 할 수있는 강력한 도구입니다. 예를 들어,이있어서, 검정 효과적으로 실험 샘플의 작은 숫자를 공부뿐만 아니라 효율적으로 높은 처리량 검사 분석 역할을 할 수 있습니다. coverslips는 고정되지 않은 검사를 할 수 있기 때문에 분석도 동봉 humidified, 온수 CO 2 인큐베이터와 현미경 필요없이 시간이 지남에 따라 세포를 이동 분석 할 수 있습니다. 형광 - 스테인드 세포의 photobleaching이 콜로이드 금을 기반 운동성 분석에 덜 우려이기 때문에 또한, phagokinetic 트랙 운동성 분석은 시간 경과 영상 의무가없는 세포의 운동성을 공부에 도움이됩니다. 다른 소프트웨어를 사용할 수 있지만 하나의 셀에 의해 삭제 트랙 영역의 양적 평가는, 자유롭게 사용 가능한 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 달성된다. 또한, 전체 도형리터 및 통계 분석은 기본적인 계산에 대한 지식, 스프레드 시트 및 통계 만 필요 얻었다.
그것은 원래의 방법은 유리 coverslips 9 가리 (BSA) 소 혈청 알부민의 사용을 설명 있다는 것을 알아야한다. 그러나 BSA의 사용은 균일 한 금 콜로이드 monolayer 27를 허용 할 수있는 대리인으로 신뢰할 수없는 것으로되었다. BSA에 대한 젤라틴의 대체는 coverslip의 코팅으로 coverslip에 금 나노 입자의 준수를 증가했습니다. 스콧 외에 의해 도입 추가 수정. 27 프로토콜에 크게 금 nanoparticle 코팅의 질을 향상. 그럼에도 불구하고, 우리는 Turkevich 외에 따라 발견했습니다. 23, 환원제와 같은 나트륨 구연산의 사용은 금 나노 입자의 가장 균일 한 monolayer를 만든. 따라서, 우리는이 방법을 선호하고 같은, 그것은 우리의 프로토콜에 설명되어 있습니다.
아를 허용하려면분석의 재현성의 고등학교 학위는 그 편차가 강하게 최종 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 엄격하게, 볼륨 및 프로토콜에 표시된 온도를 수행하는 것이 중요합니다. 위의 논의, phagokinetic 트랙 운동성 분석의 사용 기술 장애물 중 하나는 금 솔루션 나노 입자 후 황금의 적절한 균일 한 농도를 얻기에 coverslip에 나노 입자의 생산을 포함한다. 금 nanoparticle의 침전 단계는 재현하더라도 따라서, 우리는 시켰던 금 나노 입자의 최종 솔루션의 색상을 평가에 중점을 배치합니다. 또한,이 경우 coverslips에 금 입자 (추가 솔루션을 추가 할 수있는 능력을의 밀도와 균일 성을 평가 한 후 0.5 시간 후, 각 coverslips에 최종 솔루션의 정상적인 볼륨의 절반을 추가하고 위해 우리 근거입니다 ) 나중에 필요했습니다. 이러한주의 사항은 어디 t 상태를 만드는 피하기 위해 이동합니다그는 coverslips가 너무 높은 (그림 1A와 1B) 또는 유리 coverslips에 금 나노 입자의 농도 (인물 1C 및 1D)이 너무 낮아 보여줍니다.
전반적으로, phagokinetic 트랙 운동성 분석은 세포의 움직임을 분석 할 수있는 간단한 방법입니다. 이 세포는 정의 된 기간 동안 이동 한 거리의 스냅 샷을 (마지막 트랙 영역을 통해)를 제공합니다. 또한, 분석은 여러 자극에 매우 의무이며, 세포 치료 다양한 옵션에서 테스트 할 수 심사하게된다. 예를 들어, 단핵 세포 실험에서 우리는 급속도로 이루어질에 감염된, 시토 킨 - 처리, 성장 인자-대우, mitogen-처리 및 LPS-처리 단핵 세포의 운동성을 테스트했습니다. 또한, 우리는 기능적으로 다양한 생화학 / 분자 경로는 단핵 세포 운동성에서 재생 역할을 조사 할 억제제 / 억제 다양한 조건에서 이러한 활성 단핵 세포를 테스트하고 있습니다. 상처 치유 분석 31 measurin 달리셀 chemotactic의 운동성의 대량 분석을 수 있도록 세포 증식 및 마이그레이션 또는 Boyden 챔버 (횡단도) 마이그레이션 분석 32의 GA 누적 효과는 phagokinetic 트랙 운동성 분석은 단일 세포의 이주를 평가합니다. 측정 할 수있는 대량 chemotactic 효과에 대한 필요, 생체 조건에서 아래에 평가되는 3 차원 마이그레이션 / 침략, 세포 운동의 자세한 분석, 또는 셀 운동의 분석이있는 경우 그러나,이 프로토콜 겠지 충분하고 횡단 잘 마이그레이션 분석, matrigel의 침공 분석 33, 라이브 시간이 실효 현미경 / 사진 34,35과 같은 추가 방법의 사용은, 등이 고려 될 필요가 없습니다.
phagokinetic 트랙 운동성 분석은 간단하고 정량 평가 / 분석에 고가의 현미경 및 소프트웨어를 사용하기위한 필요없이 마이그레이션 할 수 세포의 능력을 비교 한 것입니다. 그것은 rese에 해결됩니다간단한 높은 처리량 분석의 가능성을 제공, 세포 운동성을 수량화 할 수있는 빠르고 쉽게하지만, 신뢰할 수있는 방법을 필요로하는 궁수.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원 (AI050677, HD-051998, 그리고 GM103433), 말콤 Feist 심장 혈관 연구 교제, 그리고 미국 심장 협회 predoctoral 휄로 십 (10PRE4200007)에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Coverslips (15mm) | Fisher Scientific | 12-545-83 | |
| Gelatin 300 Bloom | Sigma-Aldrich | G-1890 | |
| Tetrachloroauric Acid Trihydrate | Fisher Chemical | G54-1 | 14.5 mM (a final working solution) |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | BP327-500 | 0.5% (a final working solution) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042 | 3% (a final working solution) |
| 100 mm Tissue Culture Dish | Sarstedt | 83.1802 | |
| 12-Well Plates | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 24-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| Techne Oven Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | The standard laboratory oven will suffice |
| 10 ml Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipet-Aid Filler/Dispenser | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 Single-Channel Manual Pipette | Rainin | PR-200 | |
| 200 ml Barrier Tips | CLP | BT200 | |
| ImageJ software | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | License: Public Domain | |
| Nikon Eclipse TE300 with a photometrics CoolSNAPfx monochrome 12-bit CCD camera | Nikon | Discontinued; The most comparable specification has Nikon Eclipse Ti, but a lower end Nikon 80i will be suitable as well. Other brands also provide comparable microscopes. | |
| Note: The reagents and equipment listed below have been utilized by us in our various studies. Other supplies, suppliers, reagents, and equipment can be used, as long as they have similar specifications. | |||
References
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