電気化学センサを用いた細菌検出＆識別
Summary
我々は、迅速な菌の検出および同定のための電気化学センサの測定方法を説明する。アッセイは、リボソームRNA（rRNAの）種特異的配列のためのDNAオリゴヌクレオチド捕捉プローブで官能化されたセンサアレイを含む。捕捉プローブと西洋ワサビペルオキシダーゼ連動DNAオリゴヌクレオチドの検出プローブでターゲットのrRNAのサンドイッチハイブリダイゼーションは、測定電流測定電流を生成する。
Abstract
電気化学センサが広く血糖の迅速かつ正確な測定のために使用され、検体の多種多様な検出のために適合させることができる。電気化学センサは、有用な電気信号に生体認識イベントに形質導入することによって動作する。シグナル伝達は、電流測定電極に酸化還元酵素の活性を結合することによって起こる。センサの特異性は、酵素の固有の特性、グルコースセンサの場合、グルコースオキシダーゼ、又は酵素及び抗体又はプローブ間のリンケージの積である。
ここでは、直接細菌を検出し、識別するための電気化学センサの測定方法を説明する。いずれの場合も、ここで説明するプローブは、DNAオリゴヌクレオチドである。この方法は、標的リボソームRNA（rRNAの）とキャプチャーと検出プローブのサンドイッチハイブリダイゼーションに基づいています。検出プローブがhに連結されている間に捕捉プローブは、センサー表面に固定されているorseradishペルオキシダーゼ（HRP）。例えば、3,3 '、5,5' – テトラメチルベンジジン（TMB）などの基板は、その表面に結合した捕捉対象検出器複合体を有する電極に追加されると、基板は、HRPにより酸化され、作用電極によって低減される。電極で電流の流れを作り出す、電極からHRPに基板による電子の往復でこの酸化還元サイクル結果。
Introduction
細菌の検出および同定のための標的分子としてのrRNAを使用すると、多くの利点を有する。細菌細胞内のrRNAの存在量が標的増幅1を必要とせずにミリリットルあたり250バクテリアの低感度限界のために用意されています。細菌のリボソームRNAは、DNAプローブとのハイブリダイゼーションにアクセス可能なユニークな種特異的な配列を含む。これにより、電気化学センサのアレイは、各センサが異なる種特異的捕捉プローブで官能化されている未知の細菌を同定するために用いることができる。ポジティブコントロールセンサーは、 "ブリッジ"捕捉および検出プローブが内部校正信号を作成するために合成オリゴヌクレオチド標的のために含まれるべきである。
電気化学センサーは、基本的な研究および翻訳の幅広い用途を有する。例えば、ここに記載されたアッセイを正確E.の効果を測定するために使用されているRRN上の大腸菌増殖期細菌の生理学2に興味を持って研究者に大きな関心であると事前rRNAのコピー数、。電気化学センサアッセイの感度は、信号対雑音比によって決定される。信号増幅及びノイズ低減の様々な方法が検討されている。私たちは、センサー表面の化学的性質を改善することは検出プローブおよび/またはHRP酵素の非特異的結合を減少させるための鍵であることがわかります。特に、アルカンジチオール及びメルカプトヘキサノールとの混合単分子膜は、標的ハイブリダイゼーション3に対して捕捉プローブのアクセス可能性を保持しながらより完全に電極表面を被覆することによってバックグラウンドを低減することが見出された。これらの表面化学処理は、複雑な生物学的サンプルを伴うアッセイのために特に重要である。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する電気化学センサアッセイは、核酸標的の迅速な検出を可能にする。感度および特異性は、順番に長さ及び捕捉および検出プローブのGC含有量に依存するターゲットプローブハイブリダイゼーションの自由エネルギーに部分的に依存する。我々は一般的に、周囲温度（〜20℃）5、6でのハイブリダイゼーションの手順を実行します。チップを含有する被覆チャンバ内に配?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究では、アレルギーと国立感染症研究所からと小児泌尿器科研究の卓越性のためのウェンディとケンルビー基金協力協定賞AI075565（DAHに）によってサポートされていました。 BMCは、小児泌尿器科でジュディスとロバート·ウィンストンの椅子です。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. |
Riferimenti
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