Un metodo semplice per ottenere e mantenere spermatogoni staminali e linee di cellule progenitrici da topi adulti è presentato qui. Il metodo utilizza cellule di alimentazione provenienti dal compartimento delle cellule somatiche del testicolo di topo adulto. Questa tecnica è applicabile ai ceppi di topi comuni, tra cui transgenici, knock-out e knock-nei topi.
Staminali spermatogoni e cellule progenitrici (SSC) del testicolo rappresentano un classico esempio di cellule staminali di mammifero e preservare la fertilità per quasi tutta la vita dell'animale. Mentre i precisi meccanismi che governano self-renewal e la differenziazione in vivo sono difficili da studio, vari sistemi sono stati sviluppati in precedenza per propagare SSC murini in vitro utilizzando una combinazione di terreni di coltura e le cellule specializzate alimentazione 1-3.
La maggior parte di incursioni in vitro sulla biologia della SSC hanno linee cellulari derivate da neonati, probabilmente a causa della difficoltà di ottenere linee di cellule adulte 4. Tuttavia, il testicolo continua a maturare fino a ~ 5 settimane di età in ceppi maggior parte dei mouse. Nel primo periodo post-natale, si verificano cambiamenti drammatici nell'architettura dei testicoli e nella biologia delle cellule somatiche e sia spermatogenesi, incluse alterazioni nei livelli di espressione di cellule staminali numerosi correlatageni. Pertanto, neonatale-derivati linee SSC potrebbero non ricapitolare la biologia della SSC adulti che persistono dopo che il testicolo adulto ha raggiunto uno stato stazionario.
Diversi fattori hanno ostacolato la produzione di linee per adulti SSC storicamente. In primo luogo, la proporzione di cellule staminali funzionali può diminuire durante l'età adulta, a causa di fattori intrinseci o estrinseci 5,6. Inoltre, come con altre cellule staminali adulte, è stato difficile per arricchire SSCs sufficientemente da cellule adulte totale testicolari senza utilizzare una combinazione di immunoselezione o altre strategie di smistamento 7. Strategie comunemente impiegati comprendono l'uso di topi criptorchidi come fonte di cellule del donatore a causa di un alto rapporto di cellule staminali per altri tipi di cellule 8. Basata sull'ipotesi che la rimozione di cellule somatiche dalla coltura iniziale interrompe interazioni con la nicchia delle cellule staminali che sono essenziali per la sopravvivenza SSC, abbiamo precedentemente sviluppato metodi per derivare l adultoines che non richiedono immunoselezione o donatori criptorchidi ma piuttosto impiegano arricchimento di serie SSC nella cultura, di seguito denominata SESC 2,3.
Il metodo descritto di seguito comporta una semplice procedura per derivare adulti linee SSC dissociandosi adulto donatore tubuli seminiferi, seguito da placcatura su linee di cellule comprendenti una linea di cellule stromali testicolare (JK1) 3. Attraverso seriale passaging, fortemente aderente, contaminando le cellule germinali non sono esaurite dalla coltura con arricchimento concomitante di SSC. Culture prodotti in questo modo contengono una miscela di spermatogoni a diversi stadi di differenziazione, che contengono SSCS, basato su lungo termine capacità di rinnovamento del sé. Il punto cruciale del metodo SESC è che consente CSS per rendere la difficile transizione da self-renewal in vivo a lungo termine di auto-rinnovamento in vitro in un microambiente radicalmente diverso, produce a lungo termine linee SSC, libero di contaminarecellule somatiche, e consentendo in tal modo la successiva manipolazione sperimentale di SSC.
Questo metodo per derivare SSC adulti con adulti testicolo derivate da cellule di alimentazione è robusto ed è riuscita quando comuni background genetico (ad esempio FVB, C57Bl6 e misti 129SV/C57Bl/6) e diversi ceppi mutanti sono stati impiegati 2,3,7,14. Infatti, il microambiente creato dal sistema di coltura è sufficiente a superare alcune delle barriere genetiche per mantenere SSCs adulti in vivo (ad esempio nel caso di PLZF – / – animali) 7. Mentre impieghiamo JK…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal New York State Department of Health (C026878). MS è stato a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Sostenuto in parte da assegno di ricerca n ° 5-FY11-571 dal March of Dimes Foundation.
Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | – | |
Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
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DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
Table 2. Dissociation buffer | |||
StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
Additional supplements** | |||
Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
Table 3. Stem cell medium | |||
*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. |