En enkel metode for å utlede og vedlikeholde spermatogonial stilk og progenitor cellelinjer fra voksne mus er presentert her. Metoden utnytter mater celler stammer fra det somatiske celle kupé av de voksne mus testis. Denne teknikken gjelder vanlige musestammer, inkludert transgene, knock-out, og knock-i mus.
Spermatogonial stilk og progenitor celler (SSCS) av testis representerer et klassisk eksempel på voksne pattedyrceller stamceller og bevare fruktbarheten for nesten levetiden av dyret. Mens de nøyaktige mekanismene som styrer selvfornyelse og differensiering in vivo er utfordrende å studere, har ulike systemer blitt utviklet tidligere for å spre murine SSCS in vitro ved hjelp av en kombinasjon av spesialiserte kultur media og mater celler 1-3.
De fleste in vitro forays i biologi SSCS har avledet cellelinjer fra nyfødte, muligens på grunn av problemer med å skaffe voksne cellelinjer 4. Men fortsetter testis å modne frem ~ 5 ukers alder i de fleste muselinjer. I den tidlige barsel, dramatiske endringer i arkitekturen av testis og i biologi både somatiske og spermatogenic celler, inkludert endringer i uttrykket nivåer av mange stamcelle-relatertegener. Derfor kan neonatally-avledet SSC linjer ikke fullt rekapitulere biologi voksne SSCS som vedvarer etter at voksen testis har nådd en stabil tilstand.
Flere faktorer har hindret produksjonen av voksne SSC linjer historisk. Først, kan andelen av funksjonelle stamceller minke under voksenlivet, enten på grunn av indre eller ytre faktorer 5,6. Videre, som med andre voksne stamceller, har det vært vanskelig å berike SSCS tilstrekkelig fra total voksne testikkelceller uten å bruke en kombinasjon av immunoselection eller andre sortering strategier 7. Vanligvis benyttes strategier omfatter bruk av cryptorchid mus som en kilde for donorceller grunnet en høyere andel av stamceller til andre celletyper 8. Basert på hypotesen om at fjerning av somatiske celler fra den første kulturen forstyrrer interaksjoner med stamcelleforskningen nisje som er avgjørende for SSC overlevelse, vi tidligere utviklet metoder for å utlede voksen lines som ikke krever immunoselection eller cryptorchid givere, men heller ansette seriell anrikning av SSCS i kultur, heretter kalt SESC 2,3.
Metodene beskrevet under innebærer en enkel prosedyre for å utlede voksen SSC linjer ved dissociating voksen donor seminiferøse tubuli, etterfulgt av plettering av celler på forer består av en testicular stromal cellelinje (JK1) 3. Gjennom seriell passaging, sterkt tilhenger, forurensende ikke-kjønnsceller er oppbrukt fra kultur med samtidig anrikning av SSCS. Kulturer produsert på denne måten inneholder en blanding av spermatogonier på ulike stadier av differensiering, inneholder hvilke SSCS, basert på langsiktig selvtillit fornyelse evne. Crux av SESC metoden er at den gir SSCS ta den vanskelige overgangen fra selvfornyelse in vivo til langsiktig selvfornyelse in vitro i en radikalt annerledes mikromiljøet, produserer langsiktige SSC linjer, uten forurensendesomatiske celler, og dermed setter påfølgende eksperimentell manipulasjon av SSCS.
Denne metoden for å utlede voksne SSCS med voksne testis-avledet mater celler er robust og har lykkes når vanlige genetiske bakgrunn (f.eks FVB, C57Bl6 og blandet 129SV/C57Bl/6) og ulike mutantstammer var ansatt 2,3,7,14. Faktisk er mikromiljøet skapt av kulturen systemet tilstrekkelig til å overvinne noen av de genetiske barrierer til å opprettholde voksen SSCS in vivo (for eksempel ved av plzf – / – dyr) 7. Mens vi bruker JK1 celler som forer, kan ikke-transforme…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av New York State Department of Health (C026878). MS var en New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Støttes delvis av Research Grant No 5-FY11-571 fra March of Dimes Foundation.
Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | – | |
Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
Table 2. Dissociation buffer | |||
StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
Additional supplements** | |||
Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
Table 3. Stem cell medium | |||
*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. |