Rottemodel af blod-hjerne barrieren Disruption at muliggøre målrettede neurovaskulær Therapeutics

Summary

Blod-hjerne barrieren forstyrrelser hjælper levering af visse lægemidler til hjernen. Mannitol leveret intraarterielt krymper celler omgivende blodkar med henblik på fysisk at ødelægge barrieren.

Abstract

Endotelceller med tight junctions sammen med basalmembran og astrocyt ende fødder surround cerebrale blodkar til dannelse af blodhjernebarrieren ^1. Barrieren selektivt udelukker molekyler fra kryds mellem blodet og hjernen baseret på deres størrelse og ladning. Denne funktion kan hindre afgivelse af terapeutika til neurologiske lidelser. Et antal kemoterapeutiske lægemidler, for eksempel, vil ikke effektivt krydser blod-hjernebarrieren for at nå tumorceller ^2. Således forbedre leveringen af ​​lægemidler over blod-hjerne-barrieren er et område af interesse.

De mest udbredte fremgangsmåder til forøgelse af leveringen af lægemidler til hjernen, er direkte cerebral infusion og blod-hjerne-barrieren forstyrrelser ^3. Direkte intracerebral infusion garanterer, at terapier når hjernen, men denne fremgangsmåde har en begrænset evne til at dispergere medikamentet ^4. Blod-hjerne barrieren forstyrrelser (BBBD) alnedture medicin at strømme direkte fra kredsløbssystemet ind i hjernen og således mere effektivt at nå dispergerede tumorceller. Tre metoder til barriere forstyrrelser omfatter osmotisk barriere forstyrrelser, farmakologiske barriere forstyrrelser, og fokuseret ultralyd med mikrobobler. Osmotisk forstyrrelser, udviklet af Neuwelt, anvender en hypertonisk opløsning af 25% mannitol, der dehydratiserer de celler i blod-hjernebarrieren får dem til at krympe og forstyrre deres tight junctions. Barriere forstyrrelser kan også opnås farmakologisk med vasoaktive stoffer, såsom histamin ⁵ og bradykinin ^6. Denne fremgangsmåde er imidlertid selektivt primært til hjerne-tumor barrieren ^7. Endvidere blev RMP-7, en analog af peptidet bradykinin, viser sig at være ringere sammenlignet hoved-mod-hoved med osmotisk BBBD med 25% mannitol ^8. En anden fremgangsmåde, fokuseret ultralyd (FUS), sammenholdt med mikroboble ultralydskontrastmidler, har også vist sigtil reversibelt at åbne blod-hjerne barrieren ^9. I forhold til FUS, selv om 25% mannitol har en længere historie af sikkerhed i menneskelige patienter, der gør det til et gennemprøvet værktøj til translationel forskning ^10-12.

For at opnå BBBD skal mannitol leveres ved en høj hastighed direkte ind i hjernens arterielle kredsløb. Hos mennesker er en endovaskulær kateter styres til hjernen, hvor hurtige, direkte strømning kan opnås. Denne protokol modeller menneskelig BBBD så tæt som muligt. Efter en cut-ned til bifurcatio af den fælles carotidarterie, indsættes et kateter retrograd i ECA og anvendes til afgivelse mannitol direkte ind i den indre carotidarterie (ICA) omsætning. Propofol og _N2O anæstesi anvendes til deres evne til at maksimere effektiviteten af barrieren forstyrrelser ^13. Hvis korrekt udført, denne fremgangsmåde har evnen til sikkert, effektivt, og reversibelt åbne blod-hjernebarrieren og forbedringsprojekte leveringen af lægemidler, der ikke normalt når hjernen ^8,13,14.

Protocol

1. Forbered Animal og udstyr til procedure

1. Før påbegyndelse af kirurgi, forberede det kirurgiske område og dyret. Gøre carotis kateteret ved at indsætte en 23-gauge stump nål i den ene ende af 12 "af PE50 rør. Skær en ca 45 ° affasning i den modsatte ende af kateteret. Steriliseres udstyret forud for proceduren. Bære en hår motorhjelm, kirurgisk maske og sterile handsker.
2. Anbring en varmepude på overfladen, hvor operationen udføres. Aktivere den, og lad den varme. Dæk området med en absorberende bænk pude.
3. Kontroller, at du har 25% mannitol i opløsning uden krystaller. Hvis krystaller er til stede, opløse dem ved at anbringe hætteglasset i et varmt vandbad ved 80 ° C og omrøring periodisk.
4. Optag massen af ​​dyret.
5. Foretag en propofol fortynding til levering på 0,8 mg / kg / min ved en hastighed på 0,1 ml / min.
6. Placere rotten i induktion boksen i 3 minutter. Indstillinger: 5% isofluran, 2 L / minstrømningshastighed på respirator.
7. Oven på en engangsklud, barbering halsen og begge indre lår.

2. Intubere Rat

1. Sende dyret tilbage i induktion boksen i 3 minutter.
2. Forbered din endotrachealrør med en IV kateter. For denne størrelse og stamme af rotte, bruger vi en 18 ga kateter. Røret skal være stor nok til at tillade tilstrækkelig luftstrøm, men lille nok til at passe ind i luftrøret uden at forårsage skade. Træk nålen ud af plastkateter og omhyggeligt knække nålen ca. 1 cm fra den skarpe spids. Den bunted nål vil være din stylus. Sætte nålen tilbage ind i kateteret.
3. Hæng rotten ved sine tænder på en vinklet overflade.
4. Shine et lys direkte mod dyrets hals og foret op mellem sine ører.
5. Indsæt en lille spatel ca. 3 cm ind i oropharynx. Løft opad, mens forsigtigt at trække tungen ud af munden.
6. Visualisere åbningen af ​​trachea. Du vil seea lille hul åbne og lukke med hvert åndedrag.
7. Sæt forsigtigt kateter i hullet. Du kan nogle gange føle plastic ind i brusk af luftrøret. Trachea er følsom. Tving ikke kateteret.
8. Indstille ventilatoren til 1 l / min og 60 bpm og isofluran til 2%.
9. Forbinde kateteret til ventilatoren og tape røret til det transporterende overflade.
10. Kontroller dyret er bedøvet ved at udføre en tå knibe.

3. Etablere Propofol IV Anesthesia

1. Fastgør rotte ved at tape alle fire lemmer og hale til operativsystemet overflade.
2. Skrub barberet nakke og lyske websteder med klorhexidin sæbe tre gange. Så krat med klorhexidin skyl tre gange.
3. Vedhæft en sprøjte af propofol til en IV udvidelse sæt. Monter sprøjte på en infusionspumpe.
4. Under anvendelse af en skalpel, skære gennem huden på barberede låret. Undgå at skære muskel.
5. Åbne indsnit med kraftps at visualisere den femorale vene.
6. Trække væk væv over arterien for at blotlægge fartøjet.
7. Sæt en 26 ga Monoject veterinære IV kateter i en vene. Når nålen punkterer væggen af ​​venen vil føle det bliver lettere at skubbe. Trække nålen og skubbe kateteret ind i karret.
8. Start propofol infusion ved 0,1 ml / min.
9. 3-5 min efter starten af propofol infusion, skifte anæstesi gas til en blanding af _50% O2 og _50% N2 O og slukke for isofluran.

4. Udsætte tvedeling af den fælles carotidarterie

1. Lav en midtlinjeincision ved halsen med skalpelblad.
2. Skær mellem de to store spytkirtler med saks eller skalpel.
3. Dissekere væk vævet lateralt i forhold til midterlinien for at blotlægge halspulsåren. Brug pincet til at åbne lag af væv. Du kan bruge en saks til at fjerne stykker, som du udsætter med pincet og bestemme at være minimally vaskulær. Kontrollere blødning med gaze, vatpinde, og cautery hvis det er nødvendigt.
4. Indsprøjtes 3 ml saltvand IP hvis der har været moderat til kraftige blødninger.
5. Brug retraktorer at trække væv væk fra halspulsåre. Find forgreningen.
6. Udsætte occipital arterie lige distalt for forgreningen. Ætse det mellem tang og adskille det med en elektrokauterisation.
7. Pincet for fuldt ud at blotlægge carotid bifurcation og så meget af ECA som muligt.
8. Expose den overlegne skjoldbruskkirtlen arterie afgrening Revisionsretten distalt for occipital arterie. Ætse det mellem tang og adskille det med en elektrokauterisation.

5. Catheterize den eksterne halspulsåren

1. Placer 2 længder 4/0 silke under Revisionsretten.
2. Grab 1 længde af sutur med dit hæmostat og trække Revisionsretten tilbage caudalt (mod rotte fødder).
3. Tage den anden sutur og binde så langt kranialt (mod rottens mund) som muligt wed en kirurgs knude. Dette danner en permanent ligatur at ofre Revisionsretten.
4. Fjern det første hæmostat (den, der blev anvender caudale spænding) og få fat i den anden sutur (den, der er knudret omkring ECA) og forsigtigt spænding kranialt med arterieklemmen.
5. Bind en anden kirurg knude løst (sikrer ikke - forlade næppe bundet) distalt for forgreningen og proksimalt til den permanente ligatur.
6. Skyl med 1% lidocain til at slappe af arterie.
7. Fyld dit kateter med hepariniseret saltvand.
8. Anbring en midlertidig beholder klip så tæt som muligt på forgreningen. Placer fartøj klip i en vinkel for at maksimere plads til kateterisering. Skub løs knude mod klippet.
9. Lav en lille arteriotomi (cut) i ECA bare proksimalt til ligatur hjælp microscissors. Der bør ikke være nogen blødning, hvis klippet og ligatur er sikre.
10. Ved hjælp af en pincet til at styre ECA vægge, fodre den affasede ende af kateteret ind i karret. Fastgør kateteret med den løse sutur knude. Bind arterien omkring kateteret.
11. Fjern clipsen og rengøre området med en vatpind.
12. Før kateteret til cirka 1 mm distalt for forgreningen. Hold arterien med pincet proksimalt for knuden for at sikre at fartøjet er immobiliseret.

6. Indgiv Mannitol

1. Fyld en 8 "IV udvidelse sæt og en 6 ml sprøjte med mannitol uden at skabe nogen luftbobler Opbevar det i inkubator ved 37 ° C. Bemærk: arbejde hurtigt med mannitol - det vil umiddelbart udfælde fra opløsningen ved stuetemperatur..
2. For at visualisere BBBD, kan du administrere Evans blåt farvestof og se det ind i de områder af hjernen, hvor barrieren er blevet afbrudt. For at gøre dette, give dyret 2 ml / kg 2% Evans Blue gennem en ny IV site på benet kontralateral til propofol infusion.
3. Fastgør forlængelsen indstillet til en 5 um filter og fyld den med mannitol for at fjerne luft bubdehavender. Derefter lægger dette til stophanen uden at skabe bobler.
4. Administrere mannitol til 0,09 ml / sec for 25 sec. Se for mannitolen for at nå ligevægt med strømmen i fælles carotis ved et punkt umiddelbart proksimalt for ICA. Det skal vises til at pulsere med rottens hjertefrekvens. Hvis mannitol blot strømmer ned mod hjertet du har overvundet rottens blodtryk. Dette kan medføre livstruende komplikationer og dårlig BBBD.

Representative Results

Figur 1. Visualisering af blod-hjerne barrieren forstyrrelser via Evans-blåt farvestof ekstravasation. Evans-blåt farvestof er et pigment, som binder til albumin og er ikke ekstravaseret i hjernen under fysiologiske betingelser. En nedbrydning af blod-hjerne-barrieren på en side af hjernen giver Evans blue at komme ind og plette det sprængte halvkugle blå, mens den ikke-brudt halvkugle forbliver uændret. Det er således en nyttig markør af blod-hjerne-barrieren forstyrrelser. Figur 1A er et eksempel på en hjerne uden blod-hjerne-barrieren forstyrrelser. Figur 1B er et eksempel på en hjerne farvet blå efter osmotisk BBBD anvendelse af 25% mannitol. Bemærk, at den ene halvkugle farves blå, mens de andre rester ufarvet. Nogle blå er trængt ind i venstre hemisfære nær den mediale langsgående revne som følge af blanding af blodgennemstrømningen ved than Circle of Willis.

Discussion

Der er nogle få mulighed for at maksimere effektiviteten af ​​BBBD. Det er vigtigt at minimere blødning under cut-down fase. Blodtryk og hjertefrekvens kan påvirkes af betydelige blødning og disse faktorer vides at påvirke omfanget af BBBD ^13. Blødning kan reduceres ved hjælp af suturer at ligere større kar, såsom overlegen skjoldbruskkirtlen og occipital arterierne, som skal opdeles. Derudover kan elektrokirurgi bruges til at opdele fartøjer og dissekere områder, der har en rig blodforsyning. Det er også vigtigt at holde luft og faste stoffer ud af alle linjer anbragt i dyret - især carotis kateter. Arbejde hurtigt med mannitol med til at sikre, at krystaller ikke danner inden i sprøjten eller slange.

Det er vigtigt at anvende en mannitol strømningshastighed, der er effektiv til størrelsen og stamme af rotter anvendes i dette forsøg. Strømningshastigheden af ​​mannitol infusion skal svare til trykket i rottens fælles carotid arterie, således at en høj koncentration af mannitol strømmer ind i ICA uden at strømme ned den fælles halspulsåre i hjerte og lunger, som kan forårsage skader. Forskere vælge en anden størrelse og stamme af rotte end den, der anvendes i denne undersøgelse bør foretage eksperimenter for at finde den korrekte mannitol strømningshastighed.

En af begrænsningerne ved denne procedure er, at det kræver ofring af Revisionsretten. Når ECA er kateteriseret, bliver det vanskeligt og upålidelig at catheterize igen. Således kan denne procedure ikke udføres to gange på samme halvkugle. Desuden skal forbindelserne er angivet efter BBBD omhyggeligt testet for neurotoksicitet. Nogle lægemidler, som normalt sikkert blive farlig, når de krydser blod-hjerne-barrieren.

Trods disse begrænsninger har BBBD vid udstrækning blevet anvendt til at undersøge forbedret tilførsel af kemoterapi til hjernetumorer ^8,15-18. Det kan også være nyttige til andre terapeutiske anvendelser i which et lægemiddel ikke effektivt krydser blod-hjerne-barrieren og administration af mannitol vides at være sikker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Long Evans rat	Harlan Laboratories		210-250 g, male
PE 50 Tubing	Beckton-Dickinson
18 gauge x 2.5" IV catheter	Terumo		For ET tube
30" IV extension sets	Abbott
26 gauge veterinary IV catheter	Monoject
Evans blue dye	Sigma	E2129
Bipolar	Codman
Filter, 5 μm	Braun