Summary
Hematoencefálica interrupción de la barrera ayuda a la entrega de ciertos medicamentos para el cerebro. Manitol entregado intraarterial células se contrae los vasos sanguíneos circundantes con el fin de perturbar físicamente la barrera.
Abstract
Células endoteliales con uniones estrechas a lo largo de la membrana basal y los pies de astrocitos finales rodean los vasos sanguíneos cerebrales para formar la barrera sangre-cerebro 1. La barrera selectivamente excluye moléculas de cruce entre la sangre y el cerebro en base a su tamaño y carga. Esta función puede impedir el suministro de agentes terapéuticos para trastornos neurológicos. Una serie de fármacos quimioterapéuticos, por ejemplo, no será efectiva cruzar la barrera sangre-cerebro para alcanzar las células tumorales 2. Por lo tanto, mejorar el suministro de fármacos a través de la barrera sangre-cerebro es un área de interés.
Los métodos más frecuentes para intensificar el suministro de fármacos al cerebro son la infusión directa cerebral y la barrera hematoencefálica interrupción 3. Directos garantías infusión intracerebral que las terapias de alcanzar el cerebro, sin embargo, este método tiene una capacidad limitada para dispersar el fármaco 4. Barrera hematoencefálica interrupción (BBBD) allos puntos bajos de medicamentos para fluir directamente desde el sistema circulatorio en el cerebro y así llegar más eficazmente células tumorales dispersas. Tres métodos de alteración de la barrera incluyen alteración de la barrera osmótica, alteración de la barrera farmacológico, y el ultrasonido focalizado con microburbujas. Rotura osmótica, iniciada por Neuwelt, utiliza una solución hipertónica de 25% de manitol que deshidrata las células de la barrera sangre-cerebro, causando que se encojan y alterar sus uniones estrechas. Alteración de la barrera también se puede lograr con compuestos farmacológicamente vasoactivas tales como histamina y bradiquinina 5 6. Este método, sin embargo, es selectiva principalmente para la barrera cerebro-tumor 7. Además, RMP-7, un análogo del péptido bradiquinina, se encontró que era inferior en comparación cabeza a cabeza con BBBD osmótico con 25% de manitol 8. Otro método, ultrasonido focalizado (FUS), en relación con microburbujas agentes de contraste de ultrasonidos, también se ha demostradopara abrir reversiblemente la barrera sangre-cerebro 9. En comparación con FUS, sin embargo, 25% de manitol tiene una larga historia de seguridad en pacientes humanos que hace que sea una herramienta probada para la investigación traslacional 10-12.
Con el fin de lograr BBBD, manitol deben ser entregados a una tasa alta directamente en la circulación arterial del cerebro. En los seres humanos, un catéter endovascular es guiado hasta el cerebro donde se puede flujo rápido, directo logrado. Este protocolo modelos BBBD humana tan estrechamente como sea posible. Después de un corte hacia abajo a la bifurcación de la arteria carótida común, se inserta un catéter retrógrado en el TCE y utilizados para entregar el manitol directamente en la arteria carótida interna (ICA) la circulación. Propofol y N 2 O anestesia se utilizan por su capacidad de maximizar la eficacia de la ruptura de la barrera 13. Si se ejecuta correctamente, este procedimiento tiene la capacidad de forma segura, eficaz y reversible abrir la barrera sangre-cerebro y mejorare la administración de fármacos que normalmente no llegan al cerebro 8,13,14.
Protocol
1. Preparar Animal y Equipo para efectuar el procedimiento
- Antes de comenzar la cirugía, prepare el área quirúrgica y el animal. Hacer que el catéter de la carótida mediante la inserción de una aguja de punta roma de calibre 23-en un extremo de 12 "de tubo de PE50. Cortar un bisel aproximadamente 45 ° en el extremo opuesto del catéter. Esterilizar el equipo antes del procedimiento. Use un capó cabello, máscara quirúrgica y guantes estériles.
- Coloque una almohadilla térmica sobre la superficie donde se realizará la cirugía. Actívalo y deje que se caliente. Cubra el área con una almohadilla absorbente banco.
- Compruebe que tiene 25% de manitol en solución sin cristales. Si hay cristales, que se disuelvan colocando el vial en un baño de agua caliente a 80 ° C y agitando periódicamente.
- Registrar la masa del animal.
- Hacer una dilución de propofol para la entrega a 0,8 mg / kg / min a una velocidad de 0,1 ml / min.
- Coloque la rata en la caja de la inducción durante 3 min. Configuración: 5% de isoflurano, 2 L / minCaudal ventilador.
- En la parte superior de una toalla desechable, afeitarse el cuello y los muslos internos.
2. Intube la Rata
- Volver a colocar el animal en el cuadro de la inducción durante 3 min.
- Prepare el tubo endotraqueal con un catéter intravenoso. Para este tamaño y raza de ratas, se utiliza un catéter de calibre 18. El tubo debe ser suficientemente grande para permitir la circulación de aire adecuada, pero lo suficientemente pequeño para encajar en la tráquea sin causar daños. Tire de la aguja fuera del catéter plástico con cuidado y romper la aguja aprox. 1 cm de su punta afilada. La aguja tocada será su lápiz. Vuelve a colocar la aguja en el catéter.
- Colgar la rata por los dientes en una superficie inclinada.
- Enciende una luz directamente sobre el cuello del animal y alineados entre sus orejas.
- Inserte una pequeña espátula aprox. 3 cm en la orofaringe. Levante hacia arriba mientras tira suavemente la lengua fuera de la boca.
- Visualizar la apertura de la tráquea. Lo harás síea agujero pequeño abierto y cercano con cada respiración.
- Inserte suavemente catéter en el orificio. A veces se puede sentir el plástico entrar en el cartílago de la tráquea. La tráquea es sensible. No fuerce el catéter.
- Ajuste el ventilador a 1 L / min y 60 lpm y el isoflurano al 2%.
- Conectar el catéter al ventilador y el tubo de cinta a la superficie de operación.
- Verificar que el animal es anestesiado mediante la realización de un sujetador del pie.
3. Establecer anestesia Propofol IV
- Asegure la rata con cinta adhesiva las cuatro extremidades y la cola a la superficie de operación.
- Frote el cuello afeitado y sitios de la ingle con clorhexidina jabón tres veces. Luego frote con clorhexidina enjuague tres veces.
- Conecte una jeringa de propofol a un conjunto de extensión IV. Monte la jeringa en una bomba de infusión.
- Con un escalpelo, cortar a través de la piel del muslo rasurada. Evite cortar el músculo.
- Abra la incisión con fuerzaps para visualizar la vena femoral.
- Tire el tejido sobre la arteria para exponer el recipiente.
- Inserte un 26 ga Monoject veterinario catéter IV en la vena. Cuando la aguja perfora la pared de la vena se siente que son más fáciles de empujar. Retraer la aguja y empuje el catéter en el vaso.
- Iniciar la infusión de propofol a 0,1 ml / min.
- 3-5 min después de comenzar la infusión de propofol, cambiar el gas de la anestesia a una mezcla de 50% O 2 y 50% N O 2 y apagar el isoflurano.
4. Exponer la bifurcación de la arteria carótida común
- Hacer una incisión en la línea media del cuello con hoja de bisturí.
- Cortar entre las dos grandes glándulas salivales con tijeras o bisturí.
- Diseccionar tejido lateral a la línea media para exponer la arteria carótida. Utilice unas pinzas para abrir capas de tejido. Usted puede utilizar tijeras para retirar las piezas que lo expongan con las pinzas y determinar que minimally vascular. Controlar el sangrado con una gasa, hisopos de algodón, y cauterización si es necesario.
- Inyectar 3 ml de solución salina IP si ha habido sangrado moderado a fuerte.
- Utilice separadores para extraer el tejido fuera de la carótida. Encuentra la bifurcación.
- Exponer la arteria occipital, justo distal a la bifurcación. Cauterize que entre pinzas y separarlo con un electrocauterio.
- Use pinzas para exponer completamente la bifurcación de la carótida y como mucho de la ECA como sea posible.
- Exponer la arteria tiroidea superior se desvía la ECA distal a la arteria occipital. Cauterize que entre pinzas y separarlo con un electrocauterio.
5. Cateterización de la arteria carótida externa
- Coloque dos trozos de 4/0 seda bajo el ACA.
- Coge un trozo de sutura con su pinza hemostática y retraer la ECA atrás caudalmente (hacia los pies de la rata).
- Tomar la otra sutura y atar en la medida de cranealmente (hacia la boca de la rata) como sea posible won un nudo de cirujano. Esto forma una ligadura permanente a sacrificar la ECA.
- Retire la pinza hemostática primero (el que se aplica la tensión caudal) y coge la otra sutura (la que se anuda alrededor de la ECA) y aplique una ligera tensión craneal con la pinza hemostática.
- Atar nudo otro cirujano suelta (no aseguran - dejar apenas atado) distal a la bifurcación y proximal a la ligadura permanente.
- Irrigar con lidocaína al 1% para relajar la arteria.
- Llenar el catéter con solución salina heparinizada.
- Colocar una grapa de vaso temporal lo más cerca posible a la bifurcación. Place grapa de vaso en un ángulo para maximizar el espacio para la cateterización. Deslice el nudo flojo hacia el clip.
- Hacer una arteriotomía pequeña (corte) en la CEPA justo proximal a la ligadura usando micro tijeras. No debe haber sangrado y si el clip de ligadura son seguras.
- Utilizando pinzas para controlar las paredes de ECA, alimentar el extremo biselado del catéter en el vaso. Fijar el catéter con el nudo de sutura sueltos. Ate la arteria alrededor del catéter.
- Retire el clip y limpiar la zona con un bastoncillo de algodón.
- Avanzar el catéter a aproximadamente 1 mm distal a la bifurcación. Mantener la arteria con fórceps proximales al nudo para asegurar el recipiente se inmoviliza.
6. Administre Manitol
- Llenar un 8 "juego de extensión IV y una jeringa de 6 ml con manitol sin crear burbujas de aire en la tienda de esta incubadora a 37 ° C. Nota: el trabajo rápidamente con el manitol -, será fácil de precipitar de la solución a temperatura ambiente..
- Para visualizar BBBD, puede administrar colorante azul de Evans y verlo entrar en las áreas del cerebro donde se ha interrumpido la barrera. Para ello, dar al animal 2 ml / kg de Evans 2% Blue a través de un nuevo sitio IV en la pierna contralateral a la infusión de propofol.
- Conecte el juego de extensión a un filtro de 5 micras y llenarlo con manitol para eliminar el aire bubbles. A continuación, conecte esta a la llave de paso sin crear burbujas.
- Administrar manitol a 0,09 ml / seg para 25 seg. Reloj para el manitol para alcanzar el equilibrio con el flujo en la carótida común en un punto justo proximal a la ICA. Se debería aparecer a pulso con una frecuencia cardiaca de la rata. Si el manitol simplemente fluye hacia el corazón que hayas superado la presión arterial de la rata. Esto puede causar complicaciones potencialmente mortales y BBBD pobres.
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Representative Results
Figura 1. Visualización de sangre-cerebro alteración de la barrera a través de la extravasación de azul de Evans colorante. Colorante azul de Evans es un pigmento que se une a la albúmina y no es extravasada en el cerebro en condiciones fisiológicas. La interrupción de la barrera sangre-cerebro en un lado del cerebro permite azul de Evans para entrar y mancha el azul hemisferio interrumpido mientras que el hemisferio no perturbado se mantiene sin cambios. Por lo tanto, es un marcador útil de la alteración de la barrera sangre-cerebro. Figura 1A es un ejemplo de un cerebro sin alteración de la barrera sangre-cerebro. Figura 1B es un ejemplo de un cerebro azul manchada después de BBBD osmótica usando 25% de manitol. Tenga en cuenta que uno de los hemisferios se tiñe de azul, mientras que el otro permanece sin mancha. Algunos azul ha entrado en el hemisferio izquierdo, cerca de la fisura longitudinal medial como resultado de la mezcla del flujo de sangre en tél Círculo de Willis.
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Discussion
Hay unos pocos medios para aumentar al máximo la eficacia de BBBD. Es importante minimizar el sangrado durante la fase de corte hacia abajo. La presión arterial y el ritmo cardíaco puede ser afectada por hemorragia significativa y estos factores se sabe que afectan el grado de BBBD 13. El sangrado puede ser reducido mediante el uso de suturas para ligar vasos importantes, tales como la tiroidea superior y las arterias occipital, que deben ser divididas. Además, la electrocauterización puede ser utilizado para dividir vasos y diseccionar las áreas que tienen un rico suministro de sangre. También es importante para mantener el aire y los sólidos de todas las líneas colocadas en el animal - en particular el catéter de la carótida. Trabajando rápidamente con el manitol ayuda a asegurar que los cristales no se forman en el interior de la jeringa o tubo.
Es importante utilizar una velocidad de flujo de manitol que es eficaz para el tamaño y la cepa de rata usado en este experimento. La velocidad de flujo de la infusión de manitol debe coincidir con la presión en caroti común de la ratad arteria de tal manera que una alta concentración de los flujos de manitol en la ICA sin que fluye hacia abajo de la carótida común en el corazón y los pulmones, lo que puede causar daños. Los investigadores elección de un tamaño diferente y cepa de rata que el utilizado en este estudio debe llevar a cabo experimentos para encontrar la velocidad correcta de flujo de manitol.
Una de las limitaciones de este procedimiento es que requiere el sacrificio de la ECA. Una vez que la ECA se cateteriza, se hace difícil y poco fiable para la cateterización de nuevo. Así, este procedimiento no se puede realizar dos veces en el mismo hemisferio. Además, los compuestos dados a raíz BBBD debe ser cuidadosamente probados para la neurotoxicidad. Algunos fármacos que son ordinariamente seguro llegar a ser peligroso una vez que cruzan la barrera sangre-cerebro.
A pesar de estas limitaciones, BBBD se ha utilizado ampliamente para estudiar la mejora de la quimioterapia para tumores cerebrales 8,15-18. También puede ser útil para otras aplicaciones terapéuticas en wHICH un fármaco no es efectivo para cruzar la barrera sangre-cerebro y la administración de manitol se sabe que es seguro.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación JB Marshall.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Long Evans rat | Harlan Laboratories | 210-250 g, male | |
| PE 50 Tubing | Beckton-Dickinson | ||
| 18 gauge x 2.5" IV catheter | Terumo | For ET tube | |
| 30" IV extension sets | Abbott | ||
| 26 gauge veterinary IV catheter | Monoject | ||
| Evans blue dye | Sigma | E2129 | |
| Bipolar | Codman | ||
| Filter, 5 μm | Braun |
References
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