Rotte modell av blod-hjerne barrieren avbrudd i Tillat Målrettet nevrovaskulære Therapeutics

Summary

Blod-hjerne barrieren avbrudd hjelpemidler levering av visse medisiner til hjernen. Mannitol levert intra-arterially krymper celler rundt blodårene for å fysisk forstyrre barriere.

Abstract

Endotelceller med tett veikryss sammen med basalmembran og astrocyte end føtter surround cerebrale blodkar for å danne blod-hjerne barrieren ^1. Barrieren ekskluderer selektivt molekyler fra krysset mellom blodet og hjernen basert på deres størrelse og kostnad. Denne funksjonen kan hindre levering av terapi for nevrologiske lidelser. En rekke kjemoterapeutiske medikamenter, for eksempel, ikke vil effektivt krysse blod-hjerne-barrieren for å nå tumorceller ^2. Således, forbedre levering av legemidler over blod-hjerne-barrieren er et område av interesse.

De mest utbredte metoder for å øke tilførsel av medisiner til hjernen er direkte cerebral infusjon og blod-hjerne barrieren avbrudd ^3. Direct intracerebrale infusjonstider garanterer at terapier nå hjernen, men har denne metoden en begrenset evne til å dispergere medikamentet ^4. Blod-hjerne barrieren avbrudd (BBBD) allows narkotika for å strømme direkte fra sirkulasjonssystemet inn i hjernen og dermed mer effektivt nå dispergerte tumorceller. Tre metoder for barriere avbrudd omfatter osmotisk barriere avbrudd, farmakologisk barriere avbrudd, og fokusert ultralyd med mikrobobler. Osmotisk avbrudd, utviklet av Neuwelt, bruker en hyperton løsning av 25% mannitol som dehydrates cellene i blod-hjerne barrieren forårsaker dem til å krympe og forstyrre deres trange veikryss. Barriere avbrudd kan også oppnås farmakologisk med vasoaktive forbindelser som histamin ⁵ og bradykinin ^6. Denne metoden er imidlertid selektiv primært for hjerne-tumor barrieren ^7. I tillegg ble RMP-7, en analog av peptid bradykinin, funnet å være dårligere sammenlignet head-to-head med osmotisk BBBD med 25% mannitol ^8. En annen metode, fokusert ultralyd (FUS) i forbindelse med mikrobobleutskillere ultralyd kontrastmidler, er også blitt vistå reversibelt åpne blod-hjerne barrieren ^9. I forhold til FUS, men har 25% mannitol en lengre historie av sikkerhet hos mennesker som gjør det til et velprøvd verktøy for translasjonell forskning ^10-12.

For å oppnå BBBD må mannitol leveres med en høy hastighet direkte inn i hjernens arterielle sirkulasjon. Hos mennesker er en endovaskulær kateter føres til hjernen hvor rask, direkte flyt kan oppnås. Denne protokollen modeller menneskelig BBBD så tett som mulig. Etter en cut-ned til bifurkasjonen av den felles halsarterie, er et kateter inn retrograd inn ECA og brukes til å levere mannitol direkte inn i den indre halsarterie (ICA) sirkulasjon. Propofol og N ₂ O anestesi blir brukt for deres evne til å maksimere effektiviteten av barrieren avbrudd ^13. Hvis utført på riktig måte, har denne prosedyren evnen til sikkert, effektivt, og reversibelt åpne blod-hjerne barrieren og improve levering av legemidler som vanligvis ikke når hjernen ^8,13,14.

Protocol

1. Forbered Animal og utstyr for Prosedyre

1. Før du begynner kirurgi, forberede kirurgiske området og dyr. Gjør carotid kateteret ved å stikke en 23-gauge stump nål i en ende av 12 "av PE50 slange. Skjær en ca 45 ° skråkant i den motsatte enden av katetret. Steriliser utstyret før prosedyren. Wear et hår panser, kirurgiske maske , og sterile hansker.
2. Plasser en varmepute på overflaten der operasjonen blir utført. Aktivere den og la den varmes. Dekke området med et absorberende benk pad.
3. Kontroller at du har 25% mannitol i løsningen uten krystaller. Hvis krystaller er til stede, oppløse dem ved å plassere beholderen i et varmt vannbad ved 80 ° C og agitering jevne.
4. Registrere massen av dyret.
5. Foreta en propofol fortynning for levering på 0,8 mg / kg / min ved en hastighet på 0,1 ml / min.
6. Plasser rotte i induksjon boksen i 3 min. Innstillinger: 5% isofluran, 2 l / minstrømningshastighet på ventilator.
7. På toppen av en disponibel håndkle, barbere nakken og begge innsiden av lårene.

2. Intubere Rat

1. Plasser dyret tilbake i induksjon boksen i 3 min.
2. Forberede endotrakealtube med en IV kateter. For denne størrelsen og belastning av rotte, bruker vi en 18 ga kateter. Røret må være store nok til å tillate tilstrekkelig luftgjennomstrømning, men små nok til å passe inn i luftrøret uten å forårsake skade. Trekk kanylen ut av plast kateteret og nøye brekke nålen ca. 1 cm fra sin skarpe spissen. Den bunted nål vil være din pennen. Sett nålen tilbake inn i kateteret.
3. Heng rotte av sine tenner på en vinklet overflate.
4. Skinne et lys direkte mot dyrets nakke og stilt opp mellom ørene.
5. Sett inn en liten slikkepott ca. 3 cm inn i orofarynx. Løft oppover mens du forsiktig trekker tungen ut av munnen.
6. Visualisere åpningen av luftrøret. Du vil seea lite hull åpne og lukke med hvert åndedrag.
7. Forsiktig inn kateter inn i hullet. Du kan noen ganger føle plast inn brusken i luftrøret. Luftrøret er sensitiv. Ikke tving kateteret.
8. Still respiratoren til 1 L / min og 60 bpm og isofluran til 2%.
9. Koble kateteret til respiratoren og tape røret til operasjonsstuen overflaten.
10. Kontroller dyret er bedøvet ved å utføre en tå klype.

3. Etablere Propofol IV anestesi

1. Fest rotte ved taping alle fire lemmer og halen til operasjonssalen overflaten.
2. Skrubb barbert nakke og lyske områder med klorheksidin såpe tre ganger. Deretter skrubbe med klorheksidin skyll tre ganger.
3. Fest en sprøyte med propofol til en IV forlengelse sett. Monter sprøyten på en infusjonspumpe.
4. Ved hjelp av en skalpell, skjære gjennom huden av barbert låret. Unngå å kutte muskel.
5. Åpne snittet med kraftps å visualisere femoralvenepunksjon.
6. Trekke unna vev over arterien å eksponere fartøyet.
7. Sett en 26 ga monoject veterinær IV kateter inn i venen. Når nålen punkteringer veggen av venen du vil føle det bli lettere å presse. Trekke nålen og skyv kateteret inn i beholderen.
8. Start propofol infusjon ved 0,1 ml / min.
9. 3-5 minutter etter begynnelsen propofol infusjon, bytte anestesi gass til en blanding av 50% O ₂ og 50% N ₂ O og steng isofluran.

4. Utsett Bifurcation av Common Carotisar

1. Gjør en midtlinjesnitt i halsen med skalpell blad.
2. Skjær mellom de to store spyttkjertler med saks eller skalpell.
3. Dissekere bort vev lateralt for midtlinjen for å avsløre halspulsåren. Bruk pinsett ved åpne vevslag. Du kan bruke saks til å fjerne brikker som du utsetter med pinsett og bestemme seg for å være minimally vaskulær. Kontrollere blødning med gasbind, bomullspinner, og cautery om nødvendig.
4. Injisere 3 ml saltvann IP hvis det har vært moderat til kraftig blødning.
5. Bruk sårhaker å trekke vev bort fra carotis. Finne bifurkasjonen.
6. Eksponer occipital arterien bare distalt til bifurkasjonen. Cauterize det mellom tang og skille det med en electrocautery.
7. Bruk pinsett for å fullt avsløre carotis bifurcation og så mye av ECA som mulig.
8. Utsett overlegen skjoldbruskkjertelen arterien forgrening av ECA distalt for occipital arterie. Cauterize det mellom tang og skille det med en electrocautery.

5. Kateteriserer den eksterne Carotisar

1. Plasser to lengder på 4/0 silke under ECA.
2. Grab en lengde på sutur med pinsetten din og trekk ECA tilbake caudally (mot rotte føtter).
3. Ta den andre sutur og knytte så langt cranially (mot rat munn) som mulig wed en kirurg knute. Dette danner et permanent ligatur å ofre ECA.
4. Fjern den første pinsetten (den som var å bruke caudal strekk) og ta tak i andre sutur (den som knyttes rundt ECA) og påfør forsiktig spenning cranially med pinsetten.
5. Knyt en annen kirurgens knuten (ikke sikrer - la knapt bundet) distalt for bifurkasjon og proksimalt for den permanente ligatur.
6. Skyll med 1% lidokain å slappe av arterien.
7. Fyll ditt kateter med heparinisert saltvann.
8. Plasser en midlertidig fartøy klipp så nært som mulig til bifurkasjon. Sted fartøy klipp i en vinkel for å utnytte plassen for kateterisering. Skyv løs knute mot klippet.
9. Lag en liten arteriotomy (cut) i ECA bare proksimalt for ligatur hjelp microscissors. Det bør ikke være noen blødning hvis klippet og ligatur er sikre.
10. Bruke pinsett å kontrollere ECA veggene, mate det skråskårne ende av kateteret inn i beholderen. Fest kateteret med løs sutur knute. Knyt arterien rundt kateteret.
11. Fjern klippet og rengjør området med en bomullspinne.
12. Advance kateteret til omtrent 1 mm distalt for bifurkasjon. Hold arterien med pinsett proksimalt til knuten å sikre fartøyet immobiliseres.

6. Administrer Mannitol

1. Fyll en 8 "IV forlengelsesslangen og en 6 ml sprøyte med mannitol uten å skape luftlommer Oppbevar i inkubator ved 37 ° C. Merk: arbeide raskt med mannitol - det vil lett felle ut av løsningen ved romtemperatur..
2. For å visualisere BBBD, kan du administrere Evans blått fargestoff og se den gå inn de områdene av hjernen hvor barrieren er brutt. For å gjøre dette, gi dyret 2 ml / kg av 2% Evans Blue gjennom et nytt IV nettsted på benet kontralateralt til propofol infusjonen.
3. Fest forlengelsesslangen til en 5 mikrometer filtrere og fylle det med mannitol å fjerne luft bubker. Deretter fester dette til vannkranen uten å skape bobler.
4. Administrer mannitol på 0,09 ml / sek for 25 sek. Se for mannitol for å nå likevekt med flyten i felles carotis ved et punkt like proksimalt til ICA. Det skal vises til puls med rotte hjertefrekvens. Hvis mannitol bare renner ned mot hjerte du har overvunnet rotte blodtrykk. Dette kan føre til livstruende komplikasjoner og dårlig BBBD.

Representative Results

Figur 1. Visualisering blodhjernebarrieren avbrudd via Evans blått fargestoff ekstravasasjon. Evans blå fargestoff er et pigment som binder til albumin og er ikke ekstravasert inn i hjernen under fysiologiske betingelser. Forstyrrelse av blod-hjerne-barrieren på én side av hjernen tillater Evans blå for å angi og flekken forstyrret halvkule blå mens den ikke-forstyrret halvkule forblir uendret. Således, er det en nyttig markør for blod-hjerne barrieren avbrudd. Fig. 1A er et eksempel av en hjerne uten blod-hjerne barrieren avbrudd. Figur 1B er et eksempel av en hjerne blåfarget etter osmotisk BBBD bruker 25% mannitol. Legg merke til at en halvkule er farget blå, mens den andre står unstained. Noen blå har inngått venstre hemisfære nær mediale langsgående sprekken som et resultat av blanding av blodstrømmen ved than Circle of Willis.

Discussion

Det er noen få middel for å maksimere effekten av BBBD. Det er viktig å minimere blødning under cut-down fasen. Blodtrykk og hjertefrekvens kan påvirkes av betydelig blødning og disse faktorer er kjent for å påvirke graden av BBBD ^13. Blødning kan reduseres ved å bruke suturer å ligere store skip, for eksempel overlegen skjoldbruskkjertelen og occipitale arterier, som må deles. Tillegg kan elektrokirurgi brukes til å dele fartøyer og dissekere områder som har en rik blodtilførsel. Det er også viktig å holde luft og faste stoffer ut av alle linjer plassert i dyret - spesielt carotis kateteret. Arbeide raskt med mannitol bidrar til å sikre at krystallene ikke danner inne i sprøyten eller slangen.

Det er viktig å bruke en mannitol strømningshastighet som er effektivt for størrelsen og belastning av rotte anvendt i dette forsøk. Strømningshastigheten av den mannitol infusjon må samsvare med trykket i rotte felles carotid arterien slik at en høy konsentrasjon av mannitol strømmer inn i ICA uten strømmer ned den felles carotis inn i hjertet og lungene, noe som kan forårsake skade. Forskere velger en annen størrelse og belastning av rotte enn den som brukes i denne studien bør gjennomføre eksperimenter for å finne den riktige mannitol strømningshastighet.

En av begrensningene i denne prosedyren er at det krever offer ECA. Når ECA er kateterisert, blir det vanskelig og upålitelig å kateterisere nytt. Dermed kan denne prosedyren ikke utføres to ganger på samme halvkule. I tillegg må forbindelser gitt etter BBBD nøye testet for nevrotoksisitet. Noen medikamenter som vanligvis sikker bli farlig når de krysser blod-hjerne barrieren.

Til tross for disse begrensningene, har BBBD blitt brukt mye til å studere bedre levering av kjemoterapi til hjernesvulster ^8,15-18. Det kan også være nyttig for andre terapeutiske anvendelser i which et stoff ikke effektivt krysse blod-hjerne barrieren og administrasjon mannitol er kjent for å være trygg.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Long Evans rat	Harlan Laboratories		210-250 g, male
PE 50 Tubing	Beckton-Dickinson
18 gauge x 2.5" IV catheter	Terumo		For ET tube
30" IV extension sets	Abbott
26 gauge veterinary IV catheter	Monoject
Evans blue dye	Sigma	E2129
Bipolar	Codman
Filter, 5 μm	Braun