Summary
يوصف منهج الكيمياء الحيوية في الجسم الحي لتحديد البروتين البروتين التفاعلات (PPI) للبروتينات الغشاء. أسلوب يجمع بين البروتين عبر ربط، وتنقية تقارب ومطياف الكتلة، وقابلة للتكيف مع ما يقرب من أي نوع من الخلايا أو الكائن الحي. مع هذا النهج، وحتى تحديد مثبطات مضخة البروتون عابرة يصبح ذلك ممكنا.
Abstract
بروتينات الغشاء ضرورية لبقاء الخلية، وبالتالي فهي أهداف علاجية هامة 1-3. لأنها تعمل في المجمعات 4، وأساليب لتحديد وتوصيف تفاعلاتها ضرورية 5. تحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير بكتيريا غشاء البروتين تجربة التفاعل، ودعا غشاء العمود الفقري 6. هذا الأسلوب يجمع بين المجراة عبر ربط باستخدام عكسها عبر رابط مع الفورمالديهايد تنقية تقارب من بروتين الطعم غشاء الموسومة بكتيريا. أثناء الإجراء، والبروتينات فريسة عبر ربط والتعاون مع تنقية البروتين الطعم الغشاء ومفصولة الغليان في وقت لاحق. وبالتالي، واثنين من المهام الرئيسية التي يمكن تشغيلها عند تحليل التفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) من بروتينات الغشاء باستخدام غشاء العمود الفقري: أولا، تأكيد وجود شريك التفاعل الذي اقترحه immunoblotting، والثانية، وتحديد الشركاء التفاعل جديدة عن طريق تحليل الطيف الكتلي . وعلاوة على ذلك، حتى لآه تقارب، مثبطات مضخة البروتون هي عابرة كشفها بواسطة هذه التقنية. أخيرا، غشاء العمود الفقري قابلة للتكيف مع ما يقرب من أي نوع من الخلايا، مما يجعلها قابلة للتطبيق كأداة فحص قوية لتحديد مثبطات مضخة البروتون من البروتينات الغشاء.
Introduction
لفهم وظيفة البروتين فمن الضروري أن نعرف شركاء تفاعلها. تتوفر لتحديد الشركاء التفاعل من بروتينات قابلة للذوبان العديد من التقنيات الكلاسيكية. ولكن هذه التقنيات ليست قابلة للتحويل بسهولة إلى غشاء البروتينات نظرا لطبيعة مسعور بهم 4. للتغلب على هذا القيد، وقد وضعنا في غشاء بكتيريا البروتين التفاعل التجربة (غشاء العمود الفقري) 6. لأنه يقوم على طريقة العمود الفقري، والتي كانت مناسبة فقط للبروتينات قابلة للذوبان 7.
فوائد غشاء العمود الفقري من اثنين من المزايا التي تتمتع بها عبر ربط كيل الفورمالديهايد: أولا، والفورمالديهايد يمكن أن تخترق بسهولة الأغشية ويولد لقطة دقيقة من interactome خلية الحية 8 بالتالي. الثانية، والفورمالديهايد عبر وصلات يمكن عكسها من الغليان 9. هنا، يتم استخدام هذه المزايا اثنين لتحديد ليس فقط مثبطات مضخة البروتون دائمة ولكن أيضا عابرة للالمتواجد الغشاء6 الإضافية.
في سطور، وتنصهر في علامة بكتيريا لمحطة سي من البروتين لا يتجزأ الطعم الغشاء. يتم تحضين الخلايا معربا عن البروتين الطعم الغشاء مع الفورمالديهايد التي عبر وصلات البروتينات فريسة للبروتين الغشاء الطعم (الشكل 1). ليست هناك حاجة للبروتينات التعديلات الفريسة. المقبل، وجزء الغشاء مستعدة. لذلك، يتم solubilized البروتينات الغشاء عن طريق العلاج المنظفات والطعم البروتينات هي التعاون مع تنقية البروتينات فريسته باستخدام تنقية تقارب. بعد ذلك، يتم عكس الرابط عبر من الغليان، ويتم فصل الطعم والبروتينات فريسة المشترك مزال من قبل SDS-PAGE. أخيرا، يمكن تحديدها من خلال تحليل البروتينات فريسة طخة مناعية أو مطياف الكتلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: معلومات تفصيلية عن مخازن مشار إليه في البروتوكول متاح في الجدول 1.
1. التثبيت من البروتين البروتين التفاعلات التي كتبها الفورمالديهايد عبر ربط في الخلايا الحية
- لبدء إعداد وسائط النمو، حلول الأسهم وعازلة P1
- إعداد 500 مل المتوسطة: يجب على توفير الظروف المتوسطة التي تدعم التفاعل بين غشاء البروتين الطعم والبروتينات فريسة. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يتم تنفيذ تجربة واحدة في ظل الظروف حيث يتوقع أي تفاعل (على سبيل المثال دون عبر ربط).
ملاحظة: نحن نقارن تفاعلات البروتين البروتين في البكتيريا وشدد وشدد غير. لذلك، نحن نستعد لوريا BERTANI 500 مل (LB) المتوسطة (الجدول 1) أننا تكمل مع وكيل الذي يحفز التوتر (مثل كلوريد الصوديوم 0.5 M) في قارورة 2 لتر مخروطي. للسيطرة، ونحن نستخدم العادي المتوسط LB مع 0.17 M كلوريد الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.0). - إعداد تريس العازلة (20 ملي تريس-Hالبنود؛ درجة الحموضة 8.0) و 0.1 M حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، ودرجة الحموضة 8.0 حل الأسهم (الجدول 1).
- إعداد العازلة P1. حل السكروز إلى تركيز النهائي من 0.5 M في تريس العازلة. تعقيم العازلة P1 عن طريق الترشيح وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد 500 مل المتوسطة: يجب على توفير الظروف المتوسطة التي تدعم التفاعل بين غشاء البروتين الطعم والبروتينات فريسة. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يتم تنفيذ تجربة واحدة في ظل الظروف حيث يتوقع أي تفاعل (على سبيل المثال دون عبر ربط).
- تنمو الخلايا معربا عن البروتين الطعم الغشاء مع محطة C بكتيريا علامة الانصهار من النواقل. لحث على التعبير عن غشاء بروتينات الطعم لفترة كافية.
ملاحظة: نحن لحث على التعبير عن البروتينات البكتيرية الطعم الغشاء في مرحلة مبكرة سجل (A 600 = 0.3) من خلال إضافة 250 ميكرولتر 1 M-الآيزوبروبيل β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى 500 مل المتوسطة (تركيز النهائي: 0.5 ملم) . للسماح التعبير كافية، ونحن احتضان البكتيريا حتى مرحلة سجل في وقت متأخر من (A 600 = 1.2). - الاستعداد لكل ثقافة اثنين الأكواب الطرد المركزي مع الحد الأدنى من حجم 300 مل كل ووضعها على الجليد.
- أداء الفورمالديهايد عبر ربط.
CAUTION: الفورمالديهايد هو شديدة السمية ونحن ننصح بالعمل تحت غطاء الدخان السلامة.- نقل سفينة الثقافة تحت غطاء الدخان السلامة. تقسيم كل عينة إلى قسمين العينات، واحد إهمال عبر ربط (- X) واحد بما في ذلك الفورمالديهايد عبر ربط (+ X). إضافة 4 مل 37٪ محلول الفورمالديهايد إلى 250 مل الثقافة للوصول إلى التركيز النهائي من 0.6٪.
- نقل السفن الثقافة ذهابا وتنمو الخلايا لمزيد من 20 دقيقة كما كان من قبل.
- ملء الثقافات الخاص في أنابيب الطرد المركزي تحت غطاء الدخان السلامة. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 30 دقيقة.
- تجاهل طاف بواسطة pipetting بعناية تحت غطاء الدخان السلامة. جمع طاف السامة المحتوية على الفورمالديهايد والتخلص منها بشكل صحيح.
- من أجل الوصول إلى العائد الأمثل خلال غشاء إعداد البروتين، وإعداد spheroplasts الأولى. هنا، ونحن نقدم بروتوكول لتشكيل الكوراء من البكتيريا سالبة الجرام:
- Preparه عازلة P2 (الجدول 1) من مسحوق مجفف بالتجميد. تذوب بلطف 2 ملغ الليزوزيم في 0.1 M EDTA، ودرجة الحموضة 8، في أنبوب 1.5 مل. إعداد العازلة P2 دائما طازجة لليوم من التجربة.
- إعداد تريس العازلة مع مثبطات الأنزيم البروتيني (العازلة P3). إلى 10 مل من تريس العازلة، إضافة 0.1 مل 1 M phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) (الجدول 1) إلى تركيز النهائي من 10 ملم. استخدام المخزن المؤقت فورا، لضمان وظيفة مناسبة من PMSF كما مثبط البروتياز.
- كريات الخلية resuspend في 10 مل تريس العازلة مع مثبطات الأنزيم البروتيني والحل نقلها إلى أنبوب 15 مل المخروطية.
- إضافة 1 مل العازلة P2 واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- جمع spheroplasts بواسطة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 30 دقيقة، وتجاهل طاف بعناية.
- احتضان الكريات الكوراء بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.
2. تنقية بكتيريا علامة غشاء بروتين (بيت)
- وضع الكوراء بيليه على الجليد. </ لى>
- خلال فترة الكريات الكوراء ذوبان الجليد على الجليد، وإعداد 10 مل العازلة P3 لكل إعداد الكوراء. بلطف حل 1 ملغ DNaseI في 10 مل تريس العازلة. إضافة 0.1 مل 1 M PMSF فقط قبل الاستخدام.
- resuspend الكرية في 6 مل الطازجة P3. يصوتن العينة أربع مرات لمدة 1 دقيقة باستمرار على الجليد مع وقفة 1 دقيقة بين كل انفجار، من أجل تعطيل spheroplasts.
- أجهزة الطرد المركزي في العينة 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة إلى الحصاد الحطام الخلية. نقل طاف باستخدام ماصة إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة.
- بيليه الكسر غشاء على 100،000 x ج لمدة 30 دقيقة. غسل بيليه في تريس بعناية العازلة دون حلها. تجف الأنبوب بمنديل ورق (مثل كلينيكس). تجنب إزعاج بيليه في أي وقت.
- resuspend الكرية (= الأغشية) بعناية في 1 مل تريس العازلة. استخدام قسامة 20 ميكرولتر لتحديد تركيز البروتين مثل BCA الفحص. في هذه الخطوة، والأغشية يمكن صدمة المجمدة في لىالنيتروجين مضغة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
3. تنقية بكتيريا علامة غشاء بيت البروتين وSDS-PAGE
- تطبيع تركيز البروتين من الكسر غشاء إلى 5 ملغ / مل مع تريس العازلة. تأخذ 2.5 مل جزء الغشاء (5 ملغ / مل) في أنبوب نابذة فائقة السرعة وإضافة 0.25 مل من 20٪ تريتون X-100 للوصول إلى تركيز النهائي من 2٪، وذلك لذوبان البروتينات الغشاء. إضافة قضيب مغناطيسي الصغرى ويقلب على الجليد لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: على الرغم من أن بشكل عام لدينا نتائج جيدة باستخدام تريتون X-100 كما المنظفات، فإنه قد يكون من المفيد لتغيير المنظفات من أجل التحسين. في هذا الصدد، لدينا أفضل النتائج مع تلك المنظفات المستخدمة لتنقية وظيفية من البروتين الطعم الغشاء منها. - أثناء أداء الخطوة 3.1، وإعداد 50 مل العازلة W و 5 مل العازلة E من (الجدول 1). ملء 10 مل 5X العازلة W التركيز إلى 50 مل وإضافة 150 ميكرولتر 20٪ تريتون X-100.
- تملأ 1 مل 5X العازلهص E التركيز إلى 10 مل وإضافة 30 ميكرولتر 20٪ تريتون X-100. تتوازن 1 مل بكتيريا-Tactin superflow الجاذبية العمود تدفق مع 8 مل العازلة دبليو
ملاحظة: من الضروري لإضافة المنظفات المستخدمة لالانحلالية في تركيز 10 أضعاف أعلاه تركيز مذيلة الحرجة (CMC) في أي العازلة أثناء إجراء تنقية.
- تملأ 1 مل 5X العازلهص E التركيز إلى 10 مل وإضافة 30 ميكرولتر 20٪ تريتون X-100. تتوازن 1 مل بكتيريا-Tactin superflow الجاذبية العمود تدفق مع 8 مل العازلة دبليو
- إزالة قضيب مغناطيسي الصغرى من العينة الانحلالية ونابذة فائقة السرعة في 100،000 x ج لمدة 30 دقيقة، لتكوير الكسر غشاء غير قابلة للذوبان. إزالة طاف باستخدام ماصة لمزيد من التنقية.
- تحميل طاف إلى العمود. تشغيل العمود فقط مع تدفق الجاذبية. غسل العمود مع 5 مل العازلة دبليو كرر هذه الخطوة غسل 5X.
- أزل غشاء بروتينات الطعم مع 1 مل العازلة E. كرر هذه الخطوة شطف 4X.
- التركيز الكسور شطف 2 و 3 و 4-300 ميكرولتر مع وحدة تصفية الطرد المركزي.
- مزيج 200 ميكرولتر من كل عينة مع 50 ميكرولتر 5X SDS-PAGE صبغ التحميل. تقسيم كل إعداد في 125 ميكرولتر مأخوذة. تغلي قسامة واحدة من كل إعداد لمدة 20 دقيقة في 95 درجة مئوية، وعلى عكس الفورمالديهايد عبر وصلات. دعونا عينات يبرد لRT لمدة 10 دقيقة على الأقل على مقاعد البدلاء أعلى.
- تحميل 30 ميكرولتر من كل عينة إلى حارة واحدة من بولكرلميد هلام مناسبة للimmunoblotting. استخدام prestained الوزن الجزيئي علامة للحصول على أفضل توجيه وتشغيل SDS-PAGE 10.
4. تحليل لطخة مناعية تأكيد الشركاء التفاعل
- مرة واحدة الخطوة 3.8 اكتمال والبروتينات نقل إلى غشاء النيتروسليلوز من قبل مثل شبه الجافة.
- منع غشاء لمنع وضع العلامات غير محددة. إعداد عرقلة العازلة وزنها ألبومين المصل البقري (BSA) لتحقيق 3٪ الوزن لكل وحدة التخزين في المياه المالحة تريس مخزنة تستكمل مع تركيز النهائي من 0.05٪ توين 20 (TBS-T). استخدام حجم كاف من عرقلة العازلة لتغطية الغشاء. منع الغشاء لمدة 1 ساعة على RT.
- تمييع والثانية احتضان الضد محددة الأولى البروتين فريسة كالمعتاد. استخدام الأجسام المضادة المرتبطة كما HRP الضد الثاني.
- تطوير طخة مناعية استخدام عدة الكشف chemiluminescent مع حساسية عالية. رصد إشارة باستخدام إجراء تجهيز الأفلام الكلاسيكية أو معدات التصوير الرقمية.
5. تجارب NanoLC-ESI-MS/MS عالية الدقة لتحديد الشركاء التفاعل
- في حالة عدم وجود الأجسام المضادة المحددة متاح للبروتين فريسة أو الشركاء التفاعل غير معروفة ينبغي أن تحدد واستخدام مطياف الكتلة (MS) لتحديد الهوية. من أجل منع التلوث الكيراتين، واستخدام المواد الهلامية precasted لفصل البروتين.
- الفضة وصمة عار على SDS-PAGE باستخدام عدة تلطيخ-MS متوافقة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تنفيذ كافة الخطوات تلطيخ والغسيل في خزانات زجاجية.
- العصابات المكوس منها وتحليل هذه بواسطة عالية الدقة LC / MS 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحليل الغشاء يسمح العمود الفقري المشارك تنقية البروتينات الغشاء والتفاعل عابر شركاء البروتين. يتم تحقيق تنقية شارك باستخدام عبر ربط كيل الفورمالديهايد. معلمتين حاسمة لمنع غير محددة عبر الروابط التالية: تركيز الفورمالدهايد والوقت عبر ربط. استخدام كافية، ولكن ليست مفرطة من الفورمالديهايد يمكن بسهولة أن يسيطر عليها immunoblotting. يمكن فصل المجمعات البروتين عبر ربط الفورمالديهايد من الغليان ولكن ليس عن طريق العلاج SDS. وبالتالي، فإنها يمكن تصور بعد النشاف للغشاء البروتين الطعم بكتيريا الموسومة كما مسحة في القسم العلوي من لطخة المناعة من عينة المغلي.
ونتيجة ممثل لفحص غشاء العمود الفقري، بما في ذلك جميع الضوابط المطلوبة، ويرد في الشكل 2. كما البروتين الطعم استخدمت يتجزأ CpxA البروتين غشاء كولاي 6،11. CpxA هو كيناز أجهزة الاستشعار ويتكون منمجال الاستشعار N-محطة مع اثنين من المجالات عبر الغشاء (TMD) دمج كبير مجال الاستشعار extracytoplasmic والحفظ للغاية المجال الحفاز حشوية-C محطة 12. بعد التحفيز، وما شابه ذلك CpxA ينشط منظم استجابة CpxR لها. تنشيط CpxR ينشر خارج للتوسط الاستجابة. لغشاء العمود الفقري، وتنصهر في بكتيريا علامة إلى C-محطة من CpxA (CpxA-بكتيريا). CpxA-بكتيريا عبر ربط لبروتينات أخرى أو مجمعات البروتين يتم الكشف عن مسحة في العينة المعالجة الفورمالديهايد المغلي (الشكل 2، خط 1 خط مقابل 3) تشير كافية عبر ربط. علاوة على ذلك، تفاعل المباشر البروتين البروتين من CpxA-بكتيريا مع منظم وما شابه ذلك استجابة البروتين CpxR بصفتها فريسة قابلا للاكتشاف البروتين فقط في وجود الفورمالديهايد (الشكل 2، سطر 2 مقابل خط 4) دعم خصوصية الفورمالديهايد عبر ربط.
ويرد نتيجة ممثل تحليل غشاء العمود الفقري طن الشكل 3. وكانت عينات مماثلة لتلك في الشكل 2 فضية الملون. السهم يمثل الفرقة التي هي محددة لعينة المغلي. ويرجع ذلك إلى الخلفية، حدد تحليل MS أيضا البروتينات الأخرى إلى جانب CpxR 6. وبالتالي، ينبغي دائما أن تحليل العينة غير الفورمالديهايد المعالجة، لتعيين الضوضاء في الخلفية وشريك التفاعل محددة.
الجدول 1: المخازن والكواشف اللازمة لغشاء العمود الفقري.
| العازلة / الكاشف / متوسطة | تعمل تركيز | تعليق | |
|---|---|---|---|
| LB | 10 ز تريبتون 5 ز خلاصة الخميرة 10 جم كلوريد الصوديوم إلى 1 L، ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 | لوريا مرق المتوسطة | |
| IPTG | 1 M-الآيزوبروبيل β-D-thiogalactopyranoside | 0.5 ملي | |
| تريس العازلة | 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8 | ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم | |
| 0،1 M EDTA، ودرجة الحموضة 8 | 0.1 M EDTA | ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم | |
| PMSF | 1 M Phenylmethylsulfonylfluoride في 100٪ كحولالأيسوبروبيل | 10 ملي | PMSF هو مستقر في 100٪ الأيزوبروبانول ولكن ليس في الماء! ويمكن تخزين الحل السهم عند -20 درجة مئوية؛ PMSF يجب أن تتكيف مع درجة حرارة الغرفة قبل تمييع في المخزن؛ PMSF تحتوي على مخازن ينبغي أن تستخدم في غضون 10 دقيقة من التحضير. |
| P1 | 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 0.5 M السكروز | ||
| P2 | 2 ملغ / مل الليزوزيم في 0.1 M EDTA، ودرجة الحموضة 7.5 | ||
| P3 | 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 10 ملي PMSF | استخدام immediately بعد إعداد | |
| منظف | 20٪ تريتون X-100 | 2٪ لالانحلالية | |
| العازلة W | ملء 10 مل 5X التركيز إلى 50 مل إضافة 150 ميكرولتر 20٪ تريتون X-100 | 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 150 ملي مول كلوريد الصوديوم 1 ملم EDTA 0.06٪ تريتون X-100 | 5X التركيز هو جزء من بكتيريا علامة تنقية البروتين مجموعة العازلة (IBA) |
| العازلة E | تملأ 1 مل 5X التركيز إلى 10 مل إضافة 30 ميكرولتر 20٪ تريتون X-100 | 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 150 ملي مول كلوريد الصوديوم 1 ملم EDTA 2.5 ملي Dethiobiotin 0.06٪ تريتون X-100 | 5X التركيز هو جزء من بكتيريا علامة تنقية البروتين مجموعة العازلة (IBA) |
| 5X SDS-PAGE صبغ التحميل | 0.3125 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8 10٪ SDS 0.5 M DTT 50٪ الجلسرين |
الشكل 1. تدفق الرسم البياني الإجراء غشاء العمود الفقري باستخدام بروتين الغشاء القولونية كما البروتين الطعم يعاملون ألف) معربا عن غشاء البكتيريا بكتيريا الموسومة البروتين الطعم مع الفورمالديهايد. الفورمالديهايد يخترق الأغشية وصلات عبر فريسة البروتينات إلى غشاء البروتين الطعم. ب) يتم إعداد جزء الغشاء solubilized والبروتينات الغشاء عن طريق العلاج المنظفات. في وقت لاحق، والبروتينات هي فريسة شارك تنقيته مع البروتين الطعم. يتم عكسها C) الفورمالديهايد عبر وصلات من الغليان ويتم فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE. أخيرا، يتم رصد البروتينات فريسة إما عن طريق immunoblotting (D) أو حددها MS-آناتحلل (E). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. طخة مناعية ممثل تستخدم لمراقبة مؤشر أسعار المنتجين من بروتين الغشاء. البكتيريا المنتجة للCpxA-بكتيريا من البلازميد كما البروتين الطعم الغشاء، كانت تزرع في LB المتوسطة إلى OD 600 من 1 ويتعرضون لالفورمالديهايد (CH 2 O) لمدة 20 دقيقة. وقد أعد جزء الغشاء الداخلي، تم solubilized البروتينات الغشاء عن طريق العلاج والمنظفات وتنقية CpxA-بكتيريا (حارات 1 و 2). البكتيريا المنتجة إما CpxA-بكتيريا دون علاج الفورمالديهايد (الحارات 3 و 4) أو تحمل ناقلات الفارغة مع العلاج الفورمالديهايد (حارات 5 و 5) شغل منصب الضوابط. تم المغلي مأخوذة من كل عينة على 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة(ممرات 2 و 4 و 6) لفصل البروتينات عبر ربط من CpxA-بكتيريا. تم فصل البروتينات في 12.5٪ SDS-PAGE. تم إجراء Immunoblotting وفصلت وصمة عار وفقا لحجم CpxA-بكتيريا (51 كيلو دالتون) والبروتينات فريسة منها CpxR (26 كيلو دالتون). حضنت جزأين من طخة مناعية مع الأجسام المضادة التي أثيرت ضد CpxA وCpxR، على التوالي. في وقت لاحق، تم علاج البقع المزيد مع المضادة للأرنب الحصان (HRP) الأجسام المضادة وتطويرها باستخدام الركيزة SuperSignal الغربية بيكو Chemiluminescent. يصادف رأس السهم المنتجات تدهور CpxA. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. ممثل الملطخة الفضة SDS-PAGE تستخدم لتحديد طشريك nteraction من بروتين الغشاء عن طريق تحليل MS. عينات مماثلة لتلك في الشكل 2 والفضة الملون. السهم يمثل الفرقة التي تم تحليلها من خلال تحليل MS والتي أكدت CpxR كشريك تفاعل CpxA 5. لين 7 عروض تنقية CpxR-6 وصاحب تنقيته حارة 8 عروض CpxA-6 صاحب البروتين. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحليل الغشاء العمود الفقري هو نهج البيوكيميائية التي تمكن واحد لتأكيد وتحديد لهذه النقطة شركاء التفاعل غير معروف من البروتينات الغشاء. غشاء العمود الفقري يجمع في الجسم الحي عبر ربط بواسطة الفورمالديهايد مع تنقية البروتين الطعم غشاء الموسومة بكتيريا. الجمع مع immunoblotting يسهل تأكيد من الشركاء التفاعل وتوقع (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك، فإن الجمع مع تحليل MS يسمح تحديد الشركاء التفاعل غير معروفة (الشكل 3). للتطبيقات، وليس هناك شرط لتعديل البروتين فريسة الخاص بك. علاوة على ذلك، غشاء العمود الفقري هو حساسة بما فيه الكفاية للسماح للكشف عن البروتينات فريسة الذاتية 6.
هنا، نقدم بروتوكول الأمثل للبروتينات غشاء البكتيريا سالبة الجرام. المغلف من البكتيريا سالبة الجرام يفصل السيتوبلازم من البيئة وتمتلك، بالإضافة إلىغشاء هيولي، والغشاء الخارجي وكييس murein. وبالتالي، يتضمن بروتوكول لدينا إزالة الغشاء الخارجي وكييس murein، مما أدى إلى ما يسمى spheroplasts. لأن هذه البروتوكولات هي متاحة لمعظم أنواع الخلايا، يجب أن يكون لدينا بروتوكول قابلة للتكيف لمعظم البروتينات الغشاء. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي النظر في النقاط التالية.
في المقام الأول، عدد نسخة من النواقل المستخدمة لتحفيزه على إنتاج البروتين الطعم الغشاء يجب أن يكون متوازنا بين مستوى عال للسماح غشاء كافية من البروتين وتنقية مستوى منخفض لمنع التفاعلات غير محددة
الثانية، بالنسبة لبعض البروتينات الغشاء الانصهار N-محطة قد تكون أكثر الأمثل من الانصهار-C المحطة. في كلتا الحالتين، ينبغي تأكيد وظائف الانصهار بواسطة العابرة للتكامل.
الثالث، وغيرها من البروتوكولات تنقية تقارب هي أيضا متوافقة مع تحليل لاحقة MS، مثل تنقية FLAG وجنبا إلى جنب تقارب تنقية (وات). نحن نفضل بكتيريا علامة الثاني بسبب صغر حجمه مع الأحماض الأمينية فقط 8 (WSHPQFEK).
رابعا، ينبغي أن يكون الأمثل للتركيز الفورمالدهايد المستخدمة والوقت عبر ربط لمنع غير محددة عبر ربط. A استفادة كافية ولكن ليست مفرطة من الفورمالديهايد يمكن رصدها من قبل immunoblotting العينات المغلي والنسبة بين عبر ربط وnonlinked غشاء البروتين الطعم (الشكل 2). البروتينات عبر ربط الهجرة كما مسحة في الجزء العلوي من طخة مناعية. البروتينات غير مرتبطة تهاجر كما البروتين غير المعالجة. النسبة بين عبر ربط والبروتين غير المرتبطة ينبغي أن يكون حول 3:1.
الخامس، لا يوجد "المنظفات العام" لجميع البروتينات الغشاء لالانحلالية. وبالتالي، في بعض الحالات المنظفات المناسبة لالانحلالية من البروتين الطعم الغشاء لابد من تحديدها. وبالتالي، يجب أن يكون اختيار المنظفات متوافقة مع بكتيريا علامة كولومن.
أخيرا، فإن الإجراء الفضة تلطيخ لديها لتكون متوافقة مع لاحقة تحليل MS. تتوفر مجموعات MS الفضة تلطيخ متوافقة من مختلف الموردين. كنا مختلفة منها مع نتائج جيدة قابلة للمقارنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث GraKo1121، Hu1011/2-1 وSFB940 إلى SH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
References
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
- Bakheet, T. M., Doig, A. J. Properties and identification of human protein drug targets. Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M.
- Daley, D. O. The assembly of membrane proteins into complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).
- Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo. Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).
- Herzberg, C., et al. SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo. Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).
- Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies. Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system. FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).
- Weber, R. F., Silverman, P. M. The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component. J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).
