Summary
दो प्रकार के पाँवों का कड़ी चमड़ी का पशु Parhyale hawaiensis जलीय भ्रूण विज्ञान और तुलनात्मक Arthropod विकास और विकास के अध्ययन के लिए एक आशाजनक मॉडल जीव है. इस प्रोटोकॉल Parhyale की जल्दी दरार मंच भ्रूण से एकल blastomeres के हाथ से हटाने के लिए एक विधि का वर्णन करता है.
Abstract
दो प्रकार के पाँवों का कड़ी चमड़ी का पशु Parhyale hawaiensis दुनिया भर अंतर्ज्वारिय समुद्री निवास में मिला एक छोटा सा जलीय है. पिछले दशक के दौरान, Parhyale अच्छी तरह से अध्ययन Arthropod मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के लिए एक उपयोगी outgroup तुलना प्रदान करने, विकास की प्रयोगशाला के अध्ययन के लिए एक आशाजनक मॉडल जीव के रूप में उभरा है. ड्रोसोफिला की syncytial चोली के विपरीत, Parhyale के शुरुआती चोली holoblastic हैं. जल्दी blastomeres में इंजेक्शन ट्रेसर रंगों का उपयोग भाग्य मानचित्रण तीनों जनन परतों और रोगाणु लाइन आठ सेल मंच द्वारा स्थापित कर रहे हैं कि पता चला है. इस स्तर पर, तीन blastomeres बाहरी झिल्ली को जन्म दे नसीब कर रहे हैं, तीन mesoderm को जन्म दे नसीब, और शेष दो blastomeres क्रमशः अन्तर्जनस्तर और रोगाणु लाइन के व्यापारियों रहे हैं. हालांकि, प्रसूखण्ड पृथक प्रयोगों Parhyale भ्रूण भी महत्वपूर्ण नियामक capabiliti के अधिकारी पता चला है किआठ सेल मंच पर ablated blastomeres के भाग्य शेष blastomeres में से कुछ के वंशज द्वारा लिया जा सकता है तों, ऐसा है कि. इंजेक्शन और phototoxic रंगों या मैनुअल पृथक के बाद सक्रियण: प्रसूखण्ड पृथक पहले दो तरीकों में से एक ने वर्णित किया गया है. हालांकि, photoablation blastomeres मारता है, लेकिन भ्रूण से मृत सेल शरीर को दूर नहीं करता. विशिष्ट blastomeres की पूरी शारीरिक हटाने इसलिए कुछ अनुप्रयोगों के लिए पृथक से एक पसंदीदा तरीका हो सकता है. यहाँ हम जीवित है और बरकरार शेष blastomeres रखते हुए सेल शरीर की पूरी तरह हटाने के लिए आवश्यक उपकरणों और मैन्युअल प्रक्रिया illustrating, Parhyale भ्रूण की आठ सेल चरण से ही blastomeres के हाथ से हटाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस प्रोटोकॉल आठ सेल स्तर पर, या अन्य जल्दी दरार चरणों की blastomeres के लिए किसी भी Parhyale सेल करने के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, सिद्धांत रूप में इस प्रोटोकॉल जल्दी clea के लिए लागू किया जा सकता हैअन्य holoblastically cleaving समुद्री अकशेरूकीय के vage चरण भ्रूण.
Introduction
दो प्रकार के पाँवों का कड़ी चमड़ी का पशु जलीय Parhyale hawaiensis विकासवादी विकास जीव विज्ञान अनुसंधान 1 में उपयोग के लिए महान क्षमता के साथ एक होनहार मॉडल जीव के रूप में पिछले एक दशक में उभरा है. फल. डी. ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर मक्खी है arthropods के अलावा, सबसे मॉडल प्रणाली कीड़े हैं, और सबसे बड़े पैमाने पर इन का अध्ययन मेलानोगास्टर कीट क्रम Diptera का एक सदस्य है, और basally शाखाओं में कीड़े 2 के उन लोगों के लिए सम्मान के साथ प्राप्त कर रहे हैं कि इस तरह प्रदर्शित करता है कई embryological सुविधाओं के रूप में. इसके अलावा, कीड़े कीड़े pancrustaceans बुलाया लंबे समय से "प्राकृतिक" समूह के भीतर उनके करीबी रिश्तेदार हैं जिसका अर्थ है कि subphylum Pancrustacea 3 नेस्ट, और इस समूह paraphyletic है कि कर रहे हैं. इस अलावा basally कीट मॉडल शाखाओं में बंटी को पता चलता है कि अन्य क्रसटेशियन की पढ़ाई विकासात्मक लक्षण के विकास के इतिहास का एक व्यापक दृष्टि प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं एकइतनी अच्छी तरह से डी में अध्ययन किया गया है कि एन डी आणविक तंत्र मेलानोगास्टर. हालांकि, बहुत कुछ क्रसटेशियन अच्छी तरह से विकास की प्रयोगात्मक प्रयोगशाला विश्लेषण के लिए स्थापित किया गया है. दो प्रकार के पाँवों का कड़ी चमड़ी का पशु पी. hawaiensis प्रयोगात्मक तकनीकों की एक श्रृंखला के लिए उत्तरदायी एक अत्यंत विनयशील प्रयोगशाला मॉडल प्रणाली, है. Amphipods उनके माता - पिता superorder Peracarida (समुद्र तट हॉपर, scuds, और अच्छी तरह से चिंराट) के भीतर कई अनूठी विशेषताओं को प्रदर्शित, और इसलिए अपेक्षाकृत क्रसटेशियन के इस समूह के भीतर प्राप्त करने के लिए लगा रहे हैं. फिर भी, Parhyale द्वारा की पेशकश embryological और कार्यात्मक आनुवंशिक हेरफेर के सापेक्ष कम यह दो प्रकार के पाँवों का कड़ी चमड़ी का पशु मॉडल जीवों की वर्तमान सूची के लिए एक मूल्यवान इसके अतिरिक्त है.
एक प्रयोगशाला पशु, पी. के रूप में hawaiensis कई लाभ प्रदान करता है. पशु तापमान और salinities की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए सहिष्णु हैं, और कृत्रिम समुद्री जल 1 की बड़ी संस्कृतियों में अच्छी तरह से जीवित रहते हैं. यह betw भेद करना आसान हैस्पष्ट रूपात्मक मतभेद, संभोग के दौरान महिलाओं को काबू करने के लिए उपयोग पुरुषों है कि सबसे विशेष रूप से, बड़े, झुका, पूर्वकाल ट्रंक उपांग पर आधारित een पुरुषों और महिलाओं. Embryological और विकास कार्य के लिए, पी. hawaiensis कई बहुत आकर्षक विशेषताएं है. Embryogenesis लगभग 10 दिनों तक रहता है और यौन परिपक्वता के समय 28 डिग्री सेल्सियस पर लगभग छह सप्ताह है (लेकिन Parhyale लगभग 20-30 डिग्री सेल्सियस से लेकर तापमान में अच्छी तरह से बचता ध्यान दें कि, और कहा कि विस्तृत विकासात्मक मचान जानकारी 18 डिग्री सेल्सियस 4 पर उठाया भ्रूण के लिए उपलब्ध है , 25 डिग्री सेल्सियस 4, और 26 डिग्री सेल्सियस 5,6). वयस्क प्रयोगशाला में सभी वर्ष दौर दोस्त, ताकि भ्रूण वर्ष के किसी भी समय पर उपलब्ध हैं. मादा पहले कई पैरों के जोड़े (आंकड़े 1 ए और 1 बी) के बीच स्थित एक उदर बच्चे थैली में निषेचित अंडे (महिला की उम्र पर निर्भर करता है) 2-20 रखना, और यह इन भ्रूण को इकट्ठा करने के लिए संभव हैमहिला की हत्या या भ्रूण (चित्रा 1C) को नुकसान पहुँचाए बिना बहुत जल्दी विकास में है. भ्रूण, अंडे सेने के लिए फ़िल्टर के माध्यम से कृत्रिम समुद्र के पानी में जीवित रहने के बाद जीन अभिव्यक्ति या ऊतकीय विश्लेषण 7 के लिए तय किया जा सकता है, और एक विस्तृत मचान तालिका विकास से 5 तक प्रगति की सटीक पहचान की अनुमति देता है. मजबूत प्रोटोकॉल सीटू संकरण 8-15 या 4,16,17 immunostaining में से जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, शाही सेना के हस्तक्षेप 13,15 या morpholinos 12, और स्थिर रोगाणु लाइन से कार्यात्मक पछाड़ना 18 transgenesis. Transgenesis प्रणाली, inducible अभिव्यक्ति 14 और 19 तरीकों में भी पी. में जीन समारोह की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है बढ़ाने जाल का प्रयोग hawaiensis. एक सार्वजनिक रूप से उपलब्ध जीनोम अनुक्रम वर्तमान में उपलब्ध नहीं है, oogenesis और embryogenesis दौरान उत्पादित टेप युक्त एक transcriptome मधुमक्खी हैएन डी नोवो इकट्ठा किया और 20 एनोटेट, और जीन की खोज की सुविधा, एक खोज डेटाबेस 21 में जमा है. संक्षेप में, पी. hawaiensis विकास को समझने के लिए कई प्रयोगात्मक और आनुवंशिक दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त एक अत्यंत विनयशील मॉडल जीव है.
डी. के शुरुआती syncytial चोली के विपरीत मेलानोगास्टर, पी. hawaiensis भ्रूण holoblastically निषेचन (2A चित्रा) निम्नलिखित फोड़ना. वंश अनुरेखण विश्लेषण तीसरे दरार से, तीसरे दरार blastomeres के प्रत्येक विशेष रूप से तीन रोगाणु परतों में से एक या रोगाणु लाइन 6 (चित्रा 2 बी) को जन्म दे नसीब है कि दिखाया गया है. इन आंकड़ों को एक साथ माइक्रोएरे डेटा 22 के साथ, सेल वंश 6,23 विश्लेषण करती है, और प्रसूखण्ड अलगाव प्रयोगों 4 विकासात्मक क्षमता सीईएल के असममित विरासत से कम से कम किसी तीसरे दरार blastomeres को अलग कर रहे हैं सुझाव दिया है किएल भाग्य निर्धारकों. कोशिकाओं के अभाव के संकेत के रूप तदनुसार, (Parhyale सेल वंश नामकरण 6 में "जी" कहा जाता है) रोगाणु लाइन अग्रदूत आठ सेल स्तर पर हटा दिया गया था, जिसमें प्रसूखण्ड पृथक प्रयोगों में, भ्रूण, बाद में विकास के चरणों 4 पर रोगाणु कोशिकाओं की कमी सबसे मेटाजोअन 24 में एक रोगाणु लाइन मार्कर है जो प्रोटीन वासा, व्यक्त. इसके विपरीत, दैहिक प्रसूखण्ड पृथक प्रयोगों से पता चला है कि पी. hawaiensis भ्रूण भी महत्वपूर्ण नियामक क्षमताओं के अधिकारी आठ सेल मंच पर ablated mesoderm या बाह्य त्वक स्तर अग्रदूत blastomeres के भाग्य शेष blastomeres 25 में से कुछ के वंशज द्वारा लिया जा सकता है कि इस तरह के. कैसे नियामक सेल भाग्य प्रतिस्थापन हो सकता है, और दैहिक blastomeres द्वारा स्वायत्त सेल भाग्य गोद लेने की हद तक अनजान बनी हुई है. ऐसे प्रसूखण्ड पृथक रूप प्रायोगिक embryological तकनीक understan में उपयोगी हो सकता हैडिंग सापेक्ष स्वायत्तता और सेल भाग्य का निर्णय 26,27 के nonautonomy और पी. के अध्ययन में रुचि के इसलिए कर रहे हैं hawaiensis embryogenesis.
बहिर्जनस्तरीय और mesodermal प्रजातियों की नियामक प्रतिस्थापन दिखा दिया कि प्रयोगों में, प्रसूखण्ड पृथक इंजेक्शन 28 और phototoxic रंजक 25 के बाद उत्तेजना द्वारा किया गया था. इस तकनीक इंजेक्शन प्रसूखण्ड (ओं) की हत्या पर प्रभावी है, यह पूरी तरह से भ्रूण से मृत सेल शरीर को दूर नहीं करता. इसके अलावा, मतभेद सेल वंश फ्लोरोसेंट वंश tracers 28,29 साथ blastomeres इंजेक्शन द्वारा embryogenesis के gastrulation चरणों के माध्यम से एकत्र आंकड़ों, और एक ही भ्रूण चरणों 23 के विकास के माध्यम से बेफिक्र blastomeres निम्न द्वारा एकत्र आंकड़ों के बीच मनाया गया है. विशिष्ट blastomeres की पूरी शारीरिक हटाने इसलिए कुछ अनुप्रयोगों के लिए पृथक से एक पसंदीदा तरीका हो सकता है.
हम पहले से सेल वंश के परिणाम प्रकाशित एकल कक्षों मैन्युअल रूप से 23 ablated गया जिसमें भ्रूण का विश्लेषण करती है. हालांकि, जल्दी दरार मंच भ्रूण से एकल blastomeres को दूर करने के लिए आवश्यक नाज़ुक कार्रवाई अभी तक पूरी तरह से वर्णित नहीं किया गया है. यहाँ हम पी. के संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत hawaiensis भ्रूण और एक आठ सेल चरण भ्रूण से एक भी प्राथमिक कोशिका का मार्गदर्शन पृथक. इस पद्धति का लक्ष्य सेलुलर व्यवहार और embryogenesis और बाद भ्रूण विकास के दौरान शेष कोशिकाओं के सेल भाग्य दक्षताओं के अवलोकन की अनुमति, भ्रूण से सेल शरीर की पूरी हटाने को प्राप्त है. हमारे प्रोटोकॉल रोगाणु लाइन अग्रदूत जी (चित्रा -2) को हटाने से पता चलता है, लेकिन या पहले दरार चरणों की blastomeres के लिए, आठ सेल मंच पर किसी भी कक्ष के लिए लागू किया जा सकता है. सिद्धांत रूप में, इस प्रोटोकॉल othe के जल्दी दरार मंच भ्रूण से एकल कक्षों को दूर करने के लिए लागू किया जा सकता हैआर holoblastically समुद्री अकशेरूकीय cleaving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
कुछ कदम को क्रियान्वित करने में मददगार हो सकता है कि टिप्पणियां इटैलिक में संकेत कर रहे हैं.
1. दिन 1: माल की तैयारी
- निम्नलिखित सामग्री (सामग्री और उपकरण की तालिका देखें) तैयार करें:
- 15 सेमी और 22 सेमी पाश्चर pipettes
- हीरा मुंशी
- फ़िल्टर की कृत्रिम समुद्री जल 1 मिलीग्राम / एमएल Amphotericin बी (एक 100 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान के 1:100), 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन और 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (एक शेयर के समाधान के 01:50 युक्त (0.0018-.0020 के बीच लवणता) पेनिसिलिन की 5000 इकाइयों / एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5000 मिलीग्राम / एमएल युक्त)
- additives के बिना फ़िल्टर्ड कृत्रिम समुद्र के पानी (0.0018-.0020 के बीच लवणता)
- आवास जोड़ों के लिए एक बड़े प्लास्टिक कंटेनर (कम से कम 15 सेमी x 15 सेमी x 5 सेमी)
- Sylgard से अटे छोटे (3 सेमी या 5 सेमी) पेट्री डिश
- छोटे (3 सेमी या 5 सेमी) पेट्री डिश
- एक watchglass या ग्लास बहु अच्छी तरह से थाली
- संदंश (उपयोग हम कुंद संदंश fro व्युत्पन्नगलती से हम संदंश के सिरों दोनों दांतों में एक ही लंबाई हैं कि, चिकनी, यह सुनिश्चित करने के लिए पत्थर sharpening एक संदंश का उपयोग, और वे अब है कि द्वारा repurposed है जो अन्य प्रयोगशाला प्रक्रिया में क्षतिग्रस्त हो गया है कि एम पुराने Dumont # 5 संदंश अंक तेज. इस तरह के नए Dumont # 5 संदंश के रूप में अत्यंत ठीक संदंश, वे भ्रूण और / या महिलाओं को घायल कर सकते हैं के रूप में अवांछनीय हैं.)
- अंत के साथ एक पाश्चर पिपेट (नीचे 1.2 चरण देखें) चौड़ी
- एक पाश्चर पिपेट की पतली अंत में एम्बेडेड एक पतली, घुमावदार टंगस्टन तार से मिलकर भ्रूण पुनर्प्राप्ति उपकरण (लागू एक विकल्प के द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, नीचे 1.3 देखें)
- एक छोटे से खोलने के साथ एक मुँह पिपेट (नीचे 1.4 कदम देखें)
- एक खींच लिया गिलास केशिका से बने एक गिलास सुई (नीचे 1.5 कदम देखें)
- फिर चौड़ी पाश्चर पिपेट, पिपेट, एक हीरे मुंशी के साथ संकीर्ण उंगलियों की रक्षा के लिए एक Kimwipe या कागज तौलिया में पिपेट के बने क्षेत्र को लपेटने के लिए शुरू होता है, जहां बिंदु पर एक 15 सेमी पाश्चर पिपेट के आसपास पहले स्कोर, और ध्यान से बनाने के लिए स्कोर लाइन पर सिरे से टूट गया. किनारों सुचारू करने के लिए कई सेकंड के लिए एक लेम्प बर्नर लौ पर पिपेट की टूट अंत पकड़ो. उद्घाटन पिपेट की अधिकतम चौड़ाई की तुलना में थोड़ा संकरा होना चाहिए.
- टंगस्टन तार विदारक उपकरण बनाने के लिए, एक 15 सेमी कांच पाश्चर विंदुक के अंत में एक टंगस्टन तार डालने, और कांच पिघला करने के लिए एक लेम्प बर्नर लौ पर संक्षेप में पकड़ जगह में तार फिक्सिंग. एक झुका आकार में धीरे वक्र तार के अंत संदंश का प्रयोग करें. इस उपकरण के लिए एक उपयुक्त आकार का एक उदाहरण के लिए चित्रा 3 देखें.
- मुंह विंदुक के लिए एक छोटी सी शुरुआत करने के लिए, दो भागों ओवर में एक 22 सेमी पाश्चर पिपेट की पतली अंत खींचएक लौ, और छोटे अंत की नोक बंद तोड़ने एर. मुंह विंदुक धारक के अंत में डालें.
- एक सुई खींचने का उपयोग पृथक प्रक्रिया के दौरान ब्याज की blastomeres पंचर करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि गिलास सुई बनाओ. एक उपयुक्त आकार सुई 4 चित्र में दिखाया गया है. यह सुई 2x मानकों के साथ एक कार्यक्रम का उपयोग कर एक सूटर P97 सुई खींचने पर खींच लिया था (गर्मी = 566, 100 पुल, वेग = 20 = 250, समय) + 1x (गर्मी = 566, खींच = 100, वेग = 100, समय = 250). अभी तक यह भी भ्रूण के जरायु के खिलाफ धक्का दिया जब तोड़ने के लिए नहीं पर्याप्त मजबूत हो, सुई बनाने के लिए इस्तेमाल विशेष कार्यक्रम और साधन भिन्न हो सकते हैं, लेकिन सुई एक अच्छी बात होनी चाहिए.
2. दिन 1: सभा Parhyale संभोग जोड़े
- पी. संभोग इकट्ठा करने के लिए चौड़ी पाश्चर पिपेट (कदम ऊपर 1.2) का उपयोग करें hawaiensis बड़े संस्कृति कंटेनर से जोड़े, और एक अलग कंटेनर युक्त ग के लिए उन्हें स्थानांतरितकृत्रिम समुद्री जल दुबला. यह इस समुद्री जल फिल्टर किया कि आवश्यक नहीं है. यह बाद में दोपहर में संभोग जोड़े इकट्ठा करने और अगली सुबह, सबसे भ्रूण हाल ही में निषेचित और जमा है, और इस प्रकार प्रारंभिक दरार पर किया गया है, ताकि (20-23 डिग्री सेल्सियस) रात भर कमरे के तापमान पर जोड़े को छोड़ने के लिए सबसे अच्छा है के लिए उपयुक्त चरणों पृथक. कुछ महिलाओं के बाद सुबह से जल्दी दरार मंच भ्रूण ले जाने दिया जाएगा कि यह सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 20 संभोग जोड़े को इकट्ठा करो.
3. दिन 2: सभा Parhyale भ्रूण
- अगली सुबह, सीओ 2 के साथ फ़िल्टर्ड कृत्रिम समुद्री जल (FASW) दिखे. महिलाओं के कुछ रात के दौरान उनके पुरुषों से मुक्त swum गया होगा, ये अलग कर महिलाओं को इकट्ठा करने और FASW / सीओ 2 में उन्हें anesthetize. शेष unpaired पुरुषों संभोग जोड़ी कंटेनर से हटा दिया है और बड़े संस्कृति को लौटाया जा सकता है. शेष संभोग जोड़े बाद भ्रूण संग्रह के लिए बचाया जा सकता हैदिन या अगले दिन में.
- FASW / सीओ 2 में एक घड़ी का शीशा भ्रूण ले जाने के लिए एक एकल anaesthetized महिला स्थानांतरण. सब अलग महिलाओं की संभावना महिलाओं के पारदर्शी नितम्बीय प्लेट (चित्रा 1 ए) के माध्यम से गुलाबी रंग पीला या बैंगनी spheroids ही आंख से दिखाई जाएगी, जो अंडे जमा कर दिया जाएगा. भ्रूण जल्दी दरार चरणों में और प्रसूखण्ड पृथक के लिए इस तरह उपयुक्त हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए, शोधकर्ता बच्चे थैली से भ्रूण को हटाने और एक खुर्दबीन के नीचे उन्हें जांच करनी होगी.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत प्रक्रिया को देखना, संदंश के साथ शरीर के एक पक्ष के साथ नितम्बीय प्लेटें समझ. भ्रूण इन नितम्बीय प्लेट (चित्रा 1 बी) के बीच उदर बच्चे थैली में दिखाई जाएगी.
- बच्चे थैली के पीछे के अंत में, और धीरे बच्चे को अलग करने के लिए बच्चे थैली के पूर्वकाल अंत में तार उठा, पतली, घुमावदार तार उपकरण (ऊपर चरण 1.3 चित्रा 3) डालेंथैली (coverings इन 30 oostegites बुलाया उदर उपांग संशोधित कर रहे हैं), थैली खोलने और भ्रूण ढीला. इस झिल्ली अंडा बिछाने के बाद लगभग 2-3 घंटे से गायब हो जाता है, और भ्रूण के लिए बाध्य नहीं कर रहे हैं, सब आसानी से तार उपकरण से बाधित हो जाएगा कि एक बहुत पतली, पारदर्शी झिल्ली के भीतर संलग्न कर रहे हैं रखा जा रहा है के पहले घंटे के भीतर या तो कर रहे हैं कि भ्रूण एक दूसरे के लिए या किसी भी तरह से महिला को embryogenesis दौरान इस बिंदु के बाद से. शोधकर्ताओं ने यह असुविधाजनक या मुश्किल चिंता थैली से भ्रूण को निकालने के लिए घुमावदार तार उपकरण पैंतरेबाज़ी करने के लिए मिल जाए, एक विकल्प के रूप में लंबे समय के आंदोलनों कोमल होते हैं और कोई कठोर दबाव भ्रूण या बच्चे थैली को लागू किया जाता है, के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है लागू. बच्चे थैली से भ्रूण को हटाने के लिए उपयुक्त अन्य उपकरणों पा संदंश या एक मोहरबंद और smoothed अंत के साथ एक गिलास केशिका शामिल हैं.
- टी बाहर धक्का खोला बच्चे थैली के माध्यम से पानी निकलवाने के लिए एक अनछुए 15 सेमी पाश्चर पिपेट का प्रयोग करेंवह घड़ी कांच के नीचे करने के लिए समझौता करना चाहिए, जो भ्रूण. मुख्य संस्कृति को उसके reintroducing से पहले वसूली की अनुमति के लिए (सीओ 2) के बिना FASW साफ करने के लिए महिला स्थानांतरण. एकाधिक महिलाओं को एक ही वसूली डिश में रखा गया है, लेकिन वे अभी भी आंशिक रूप से anesthetized हैं अगर वे अन्य जानवरों द्वारा खाया जा सकता है के रूप में महिलाओं, मुख्य संस्कृति के लिए उन्हें लौटने से पहले पूरी तरह से ठीक करने की अनुमति जा सकता है.
- साफ FASW साथ एक पेट्री डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण, और उनके भ्रूण चरण निर्धारित करने के लिए खुर्दबीन के नीचे देखने के लिए एक अनछुए 15 सेमी पाश्चर पिपेट का उपयोग करें. इस प्रक्रिया के लिए उपयुक्त हैं जो तीसरी दरार (स्टेज 4 5), पर कर रहे हैं कि अलग भ्रूण. यह भी पूर्व रोगाणु डिस्क गठन के लिए किसी भी दरार चरण के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए संभव होना चाहिए (7-8 5 चरणों).
4. दिन 2: ablating एकल कक्ष
- FASW की एक उथले परत के साथ Sylgard लाइन पेट्री डिश भरें. एक अनछुए 15 सेमी पाश्चर पीआई का प्रयोग करेंpette थाली के लिए एक एकल भ्रूण स्थानांतरण करने के लिए.
- कुंद संदंश का प्रयोग, धीरे ablated जा करने के लिए सेल (आंकड़े 2A और 2 बी) की पहचान करने के लिए भ्रूण रोल. रोगाणु लाइन अग्रदूत जी सबसे छोटी macromere MAV के शीर्ष पर बैठता है, जो छोटी से छोटी micromere, के रूप में पहचाना जा सकता है. इसके अतिरिक्त, जी सीधे mesoderm अग्रदूत micromeres मिलीलीटर और श्री हिस्से के रूप में भ्रूण के बीच में एक सेल सीमा. श्री जी के दाईं ओर प्रसूखण्ड है, यह सीधे से भर micromere है, जो एन सेल से संपर्क करें, और नहीं करता मिलीलीटर जी के बाईं ओर micromere है. श्री, एमएल, और एन के बहन macromeres बाहरी झिल्ली व्यापारियों क्रमशः एर, एल, और EP हैं.
- LEF में संदंश के साथशोधकर्ता दाएं हाथ है अगर टी हाथ (या सही हाथ में शोधकर्ता बाएं हाथ है), सही करने के लिए ब्याज की सेल के साथ भ्रूण ओरिएंट (या छोड़ दिया करने के शोधकर्ता बाएं हाथ है), और धीरे इसे स्थिर करने के लिए संदंश के बीच भ्रूण समझ.
- एक खींच लिया गिलास सुई (ऊपर 1.5 कदम, चित्रा 4) का उपयोग करना, धीरे ब्याज की सेल पंचर. पड़ोसी कोशिकाओं में या ब्याज की सेल नीचे सुई धक्का इतना ही नहीं, बहुत दूर सुई डालने मत करो. सुई केवल जरायु और अंतर्निहित कोशिका झिल्ली पंचर है, और ablated जा करने के लिए सेल में गहराई का विस्तार करने की जरूरत नहीं है.
- विनिमय एक ठीक से एक मुँह पिपेट का गिलास अंत के लिए भ्रूण पंचर करने के लिए इस्तेमाल सुई पाश्चर पिपेट टिप (ऊपर 1.4 कदम) खींच लिया. ब्याज की सेल में बनाया छेद के करीब पिपेट की नोक पकड़ो, और बहुत कोमल चूषण लागू होते हैं.
- बहुत धीरे संदंश के साथ भ्रूण दबाओ. Blasto की सामग्री के रूप मेंमात्र, कदम 4.4 में बनाया छेद के माध्यम से जरायु से बाहर धक्का दे दिया भ्रूण के एक unobstructed देखने की अनुमति देने के मुंह पिपेट में यह चूसना है. छेद काफी बड़ा है, तो हवा निकाल सेल के नाभिक के रूप में अच्छी तरह से उभरने के लिए देखा जा सकता है. इस पूरे कक्ष सामग्री हटा दिया गया है और पुनर्जीवित नहीं किया जा सकता बनाना एक अच्छा जांच है.
- ब्याज की प्रसूखण्ड निकाल दिया जाता है के रूप में ध्यान भ्रूण निरीक्षण करते हैं. हवा निकाल सेल की सीमा दिखाई अंतर्निहित कोशिकाओं के चौराहों, जिससे जरायु में छेद करने की दिशा में दूर जाना होगा. ब्याज की प्रसूखण्ड के सभी हटा दिया गया है जब तक दबाव लागू करने के लिए आगे बढ़ें. पक्ष की ओर से भ्रूण रोल संदंश का प्रयोग करें और नेत्रहीन ब्याज की प्रसूखण्ड के सब चले गए है कि इस बात की पुष्टि.
- एक अनछुए 15 सेमी पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, (FASW + 1 मिलीग्राम / एमएल Amphotericin बी, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन और 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन) FASW + साफ करने के लिए भ्रूण स्थानांतरण.
- व्यक्तिगत कुओं में प्रसूखण्ड-ablated भ्रूण उठाएँFASW + में एक स्वच्छ 48 अच्छी तरह से थाली की, दैनिक एंटीबायोटिक पूरक FASW + का 50% बदल रहा है. हमारे हाथों में भ्रूण जीवित है और 18-28 डिग्री सेल्सियस से तापमान की एक श्रृंखला में, अच्छी तरह से भी निम्न पृथक विकसित शोधकर्ताओं वे कम से कम अशांति के साथ भ्रूण को बढ़ाने के लिए जिस पर एक साफ (लेकिन जरूरी बाँझ नहीं) सतह है, जिसके लिए एक के तापमान पर उनके भ्रूण उठाना चाहिए. नियंत्रण के साथ प्रसूखण्ड-ablated भ्रूण में विकास संबंधी घटनाओं के समय की तुलना में सक्षम होने के लिए, हम 18 डिग्री सेल्सियस 4, 25 डिग्री सेल्सियस 4 पर उठाया भ्रूण के लिए उपलब्ध है कि विस्तृत विकासात्मक मचान जानकारी के लिए पाठक उल्लेख है, और 26 डिग्री सेल्सियस 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
एक तिहाई दरार पी. के सफल पृथक के बाद इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में आंशिक रूप से पूर्व ablated प्रसूखण्ड के कब्जे स्थान पर कब्जा करने के लिए इतनी के रूप में hawaiensis micromeres, शेष micromeres धीरे - धीरे थोड़ा उनके पदों पाली. जी निकाल दिया जाता है जब उदाहरण के लिए, blastomeres श्री पड़ोसी और थोड़ा बदलाव और जी के साथ सीधे संपर्क (चित्रा 2A और 2C तुलना) में पूर्व में थे कि पार्श्व सेल सीमाओं साझा करने के लिए आते हैं एमएल. सफल पृथक के बाद, शेष blastomeres चौथे दरार प्रवेश करने से पहले (कम से कम एक घंटे के) कुछ देरी से प्रदर्शित हो सकता है, लेकिन वे तो एक ही दरार पैटर्न और वे कम से कम gastrulation के माध्यम से unmanipulated भ्रूण में प्रदर्शित होता है कि समय 23 चरणों को फिर से शुरू करना चाहिए . चार micromeres, शेष blasto के वंश में से किसी के निम्नलिखित पृथकमेरेस भी "थाली" और gastrulation आंदोलनों 23 की दीक्षा करार दिया एक विशेषता सेलुलर व्यवस्था के गठन सहित सामान्य दरार समय और सेलुलर व्यवहार दिखाना चाहिए. अंडे सेने के माध्यम से पृथक प्रक्रिया और पूरा embryogenesis कि जीवित भ्रूण के अनुपात शुरू में तकनीक के लिए नए एक शोधकर्ता के लिए लगभग 10% के आदेश पर हो सकता है, लेकिन अनुभव के साथ लगभग 50% औसत चाहिए, और 75% के रूप में उच्च किया जा सकता है प्रसूखण्ड पृथक निम्नलिखित भ्रूण के अभ्यास और सतर्क देखभाल के साथ. तालिका 1 ablated भ्रूण की संख्या और है कि जीवित रहने की दर पहले कुछ के लिए आम तौर पर कम से कम 80% कर रहे हैं दिखा एक ही अनुसंधानकर्ता द्वारा प्रदर्शन लगातार पृथक प्रयोगों की एक श्रृंखला, के लिए जीवित रहने की दरों के उदाहरण से पता चलता है दिनों शोधकर्ता के बढ़ते अनुभव के साथ वृद्धि सेने के माध्यम से पृथक है, और है कि जीवित रहने की दरों निम्नलिखित.
अधूरा प्रसूखण्ड हटाने होगाअभी भी भ्रूण के जरायु भीतर स्थित झिल्ली घटकों, कोशिका द्रव्य, या जर्दी granules, शामिल हो सकते हैं जो ablated किया जाना चाहिए था कि प्रसूखण्ड के अवशेष, देखकर इसका सबूत है. दो घंटे से अधिक, या अनियमित दरार पैटर्न या शेष blastomeres के वंश के सेलुलर व्यवहार की चौथी दरार में देरी, भी असफल पृथक संकेत मिलता है. ये घटना पृथक प्रक्रिया के दौरान अन्य blastomeres को होने वाली क्षति का नतीजा हो सकता है. पृथक प्रदर्शन रूपात्मक असामान्यताओं के लिए लक्षित एक या नुकसान तो फिर बिखर अलावा अन्य blastomeres संभावना पृथक प्रक्रिया के दौरान अन्य blastomeres करने का कारण बना दी गई है.
सेल भाग्य मार्कर जिसका भाग्य नियामक प्रतिस्थापन के अधीन नहीं हैं विशिष्ट तीसरे दरार blastomeres के वंशज लेबल करने के लिए उपलब्ध हैं, तो सफल पृथक के तत्कालीन अतिरिक्त पुष्टि उन मार्करों follo के साथ लेबलिंग चालाकी भ्रूण से प्राप्त किया जा सकता हैविंग पृथक. कुछ mesodermal और बहिर्जनस्तरीय प्रदेशों के मार्कर embryogenesis 8,14,15 की देर चरणों के मध्य में वर्णित किया गया है. इन रोगाणु परतों के दोनों उनके संस्थापक blastomeres 25 में से एक के नुकसान पर नियामक प्रतिस्थापन गुजरना कर सकते हैं क्योंकि हालांकि, इन मार्करों असंदिग्ध रूप से पृथक सफल रहा था प्रसूखण्ड या नहीं, यह निर्धारित नहीं हो सकता है. रोगाणु लाइन अग्रदूत जी के मामले में, अपने वंश की सभी वासा प्रतिलेख 12 और embryogenesis दौरान प्रोटीन 4 की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित है, और जल्दी रोगाणु बैंड के लिए कम से कम के माध्यम से कमी जर्म कोशिकाओं ablated गया है जो जी में भ्रूण 4 चरण हैं. जी के सफल पृथक इस प्रकार embryogenesis के बाद के चरणों में पृथक (चित्रा 5) निम्नलिखित वासा अभिव्यक्ति की जांच से इसकी पुष्टि की जा सकती है.
src = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1.jpg" />: के लिए वीं = "5in"
चित्रा 1. वयस्क Parhyale महिला और भ्रूण hawaiensis. (ए) एक वयस्क महिला पी. के पार्श्व दृश्य hawaiensis, नितम्बीय प्लेट (तीर) दिखा, वक्ष उपांग (तीर) और पारदर्शी नितम्बीय प्लेट (नीले बिंदीदार रूपरेखा) के माध्यम से गुलाबी या बैंगनी spheroids के रूप में दिखाई भ्रूण. पूर्वकाल छोड़ दिया है. एक वयस्क महिला पी. (बी) वेंट्रल देखें hawaiensis बच्चे थैली (नीला बिंदीदार रूपरेखा) में दिखाई भ्रूण दिखा. पूर्वकाल छोड़ दिया है. बच्चे थैली से रिहा (सी) भ्रूण FASW में सामान्य रूप से विकसित करना. . S1 से सेने के माध्यम से लेकर चरणों की एक किस्म दिखाए जाते हैं, ब्राउन एट अल 5 स्केल बार = 1 (ए) में मिमी और (बी) के अनुसार मंचन किया, (ग) में 500 माइक्रोन.51073/51073fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. पी. के आठ कोशिका चरण भ्रूण hawaiensis. (ए) चार micromeres (छोटे कोशिकाओं) और चार macromeres (बड़ा कोशिकाओं) शामिल, (चरण S4 5) unmanipulated भ्रूण आठ सेल चरण जीते. (बी) फ्लोरोसेंट मार्करों 6 पर आधारित अनुरेखण वंश से पता चला है के रूप में एक जंगली प्रकार भ्रूण में सभी blastomeres की सेल भाग्य पदनाम दिखा एक आठ सेल चरण भ्रूण के योजनाबद्ध. (सी) वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग कर हटाया जी प्रसूखण्ड पड़ा है कि S4 चरण भ्रूण जीते. परिक्रमा क्षेत्र में पूर्व में ग्राम प्रसूखण्ड द्वारा कब्जा क्षेत्र से पता चलता है;शेष micromeres थोड़ा जी की पृथक से एक परिणाम के रूप में स्थिति स्थानांतरित कर दिया है. स्केल (ए) में = 250 माइक्रोन बार और (सी). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. बच्चे थैली से भ्रूण को हटाने के लिए इस्तेमाल किया वायर उपकरण. यहाँ दिखाया उपकरण एक सज्जन वक्र पेश करने संदंश का उपयोग तो, एक पाश्चर पिपेट की संकीर्ण अंत में एक टंगस्टन तार डालने और धीरे जगह में तार सील करने के लिए कांच के पिघलने द्वारा किया गया था तार में. बच्चे थैली से भ्रूण को हटाने के लिए उपयुक्त अन्य उपकरणों पा संदंश या एक मोहरबंद और smoothed अंत के साथ एक गिलास केशिका शामिल हैं. सुप्रीम कोर्ट= 1 सेमी शराब बार.
चित्रा 4. गिलास सुई पृथक प्रक्रिया के दौरान blastomeres puncturing के लिए इस्तेमाल किया. यहाँ दिखाया सुई मापदंडों 2 एक्स के साथ एक कार्यक्रम का उपयोग कर एक सूटर P97 सुई खींचने पर खींच लिया था (गर्मी = 566, 100 पुल, वेग = 20, समय = 250) + 1 एक्स (गर्मी = 566, समय = 250, वेग = 100, 100 = खींच). अन्य उपकरणों या कार्यक्रमों के रूप में लंबे समय तक वे यहाँ दिखाया गया है एक के रूप में एक ही सामान्य आकार के होते हैं, के रूप में पृथक के लिए उपयुक्त सुई खींचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. स्केल बार = 1 सेमी.
चित्रा 5. प्रसूखण्ड एक के परिणामों का आकलनblation embryogenesis दौरान. (ए) शीघ्र ही विरोधी वासा immunostaining (तीर) द्वारा लेबल जर्म कोशिकाओं दिखा, अंडे सेने से पहले एक जंगली प्रकार चरण S29 भ्रूण की जननद क्षेत्र. यहां इस्तेमाल किया विरोधी वासा एंटीबॉडी पी. के लिए विशिष्ट है hawaiensis वासा (Linsler, Alwes और Extavour, अप्रकाशित डेटा). (बी) जननद क्षेत्र (तीर) में विशिष्ट विरोधी वासा संकेत के अभाव से पता चला रोगाणु कोशिकाओं के अभाव दिखा, आठ सेल मंच पर हटाया जी प्रसूखण्ड था कि एक मंच S29 भ्रूण की जननद क्षेत्र. स्केल (ए) = 100 माइक्रोन में बार और (बी) के लिए भी लागू होता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| पृथक दौर | # Ablated | # (%) बच50% विकास के लिए | # (%) 90-100% विकास के लिए बच गया |
| 1 | 49 | 41 (83.7) | 6 (12.2) |
| 2 | 48 | 46 (95.8) | 17 (35.4) |
| 3 | 31 | 25 (80.6) | 22 (71.0) |
| 4 | 97 | 72 (74.2) | 56 (57.7) |
| 5 | 108 | 100 (92.6) | 65 (60.2) |
| 6 | 50 | 36 (72.0) | 37 (74.0) |
| कुल | 383 | 320 (83.6) | 203 (53.0) |
तालिका 1. प्रतिनिधि पृथक अस्तित्वआंकड़े. micromere पृथक के बाद, अस्तित्व (25 डिग्री सेल्सियस पर 10-12 दिन) (25 डिग्री सेल्सियस पर 5-6 दिन) के विकास के पहले 50% के भीतर और फिर 90-100% विकास पर दोनों रन बनाए थे. पृथक 1-6 एक आठ महीने की अवधि के पाठ्यक्रम पर कालानुक्रमिक क्रम में एक भी शोधकर्ता (एआर नास्ट) द्वारा प्रदर्शन प्रयोगों के प्रतिनिधि उदाहरण हैं दौर. अनुभव के साथ 90-100% विकास को बढ़ाने के लिए, यहाँ जीवित रहने की दरों के रूप में दिखाया शोधकर्ताओं ने पाया कि मिल जाना चाहिए.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हम पुस्तिका पृथक और दो प्रकार के पाँवों का कड़ी चमड़ी का पशु पी. के प्रारंभिक दरार चरणों से एकल blastomeres की पूरी शारीरिक हटाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन hawaiensis. हम एक आठ सेल चरण भ्रूण से एक रोगाणु लाइन अग्रदूत सेल छ निकाल कर इस प्रोटोकॉल के उपयोग के प्रदर्शन, और पृथक बाद embryogenesis में जी की बेटी कोशिकाओं के अभाव की पुष्टि से सफल रहा है कि दिखा. इस प्रोटोकॉल जल्दी दरार चरणों में भ्रूण से micromeres के किसी भी दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पहली या दूसरी दरार चरणों में इस स्तर पर macromeres, या blastomeres हटाने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए, उपयोगकर्ताओं को केवल कदम 4.4 पर जरायु में एक थोड़ा बड़ा छेद का निर्माण, और एक लंबे समय के लिए दबाव और शोषण को लागू करने की मामूली संशोधनों के लागू कर सकते हैं कदम 4.6 पर कक्ष सामग्री की बड़ी मात्रा को हटाने के लिए. हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग निम्न, पृथक बाद शेष blastomeres के विकास के लिए संयुक्त राष्ट्र ने पाया है किकम से कम gastrulation 23 के समय के माध्यम से दरार और सेल आंदोलन पैटर्न के संबंध में प्रभावित.
इस प्रोटोकॉल यह दो प्रकार के पाँवों का कड़ी चमड़ी का पशु में जल्दी दरार blastomeres की विकास क्षमता में जारी जांच के लिए उपयोगी हो सकता है. कई सवाल कुछ कोशिकाओं नहीं बल्कि दूसरों ablated blastomeres की उन की जगह भाग्य बदल सकते हैं क्यों सहित इस क्षेत्र में उत्तर दिया जा रह है, और इन नियामक परिवर्तन की सटीक समय और तंत्र. प्रोटोकॉल भी बस ब्याज की blastomeres पर क्रमिक कदम 4.2-4.7 दोहरा कर, एक से अधिक सेल की पृथक समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
यह जल्दी दरार blastomeres देखने और सही ढंग से पहचान करने के क्रम में उचित प्रकाश व्यवस्था के साथ एक उच्च गुणवत्ता stereomicroscope उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम एक फाइबर ऑप्टिक ठंड प्रकाश स्रोत से पार्श्व घटना सफेद रोशनी इस उद्देश्य के लिए सबसे उपयोगी है कि लगता है. सीधे specim ऊपर घटना प्रकाशप्रेषित प्रकाश भ्रूण और blastomeres के घने जर्दी घुसना करने में विफल रहता है, जबकि एन, सेलुलर morphologies और सीमाओं को अस्पष्ट कर सकते हैं कि प्रतिबिंब बनाता है इसलिए भेद करना मुश्किल है. यह पीला भ्रूण के लिए सबसे अच्छा विपरीत प्रदान करता है, क्योंकि यह घड़ी का शीशा या एक काले रंग की सतह के बजाय एक सफेद या पारदर्शी कांच की सतह पर रखा जा भ्रूण युक्त पेट्री डिश के लिए सबसे उपयोगी है.
इस प्रोटोकॉल के लिए एक सीमा ब्याज की प्रसूखण्ड सही ढंग से और असंदिग्ध रूप से प्रक्रिया शुरू करने से पहले पहचान की जानी चाहिए कि है. Photoablation तकनीक शोधकर्ताओं प्रणाली के लिए नए के लिए भ्रूण फ्लोरोसेंट डाई 28 के इंजेक्शन के बाद कुछ दरार चक्र के लिए विकसित करने के लिए छोड़ा जा सकता है, और इंजेक्शन प्रसूखण्ड की पहचान के बाद इंजेक्शन की पुष्टि के बाद से, अधिक उपयोगी हो सकता है, लेकिन photoablation से पहले, होता अच्छी तरह से पिछले सेल लाइन में वर्णित किया गया है जो सेलुलर सन्तान के पैटर्न का विश्लेषण करकेउम्र 6,23 विश्लेषण करती है. शोधकर्ताओं पी. के साथ परिचित हैं बार hawaiensis भ्रूण और विश्वास के साथ सभी blastomeres की पहचान कर सकते हैं, यहाँ वर्णित पुस्तिका पृथक बल्कि भ्रूण से मृत सेल शरीर को हटाने के बिना सेल की हत्या से एक प्रसूखण्ड की पूरी शारीरिक हटाने, वांछनीय है जहां अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस प्रक्रिया के सिद्धांत में अन्य holoblastically cleaving क्रसटेशियन की दरार मंच भ्रूण, या जिसका chorions या निषेचन झिल्ली आसानी से हटाया नहीं जा सकता अन्य समुद्री या ताजे पानी अकशेरूकीय से एकल blastomeres दूर करने के लिए लागू किया जा सकता है. संशोधन उपयुक्त लवणता विशेषताओं के साथ ऊष्मायन मीडिया का उपयोग, और अधिक नाजुक झिल्ली (अब, पतली सुई) या अधिक मजबूत भ्रूण आवरण (कम, तेजी से सुइयों गावदुम) को समायोजित करने के लिए सुई के आकार को संशोधित शामिल हो सकते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम कैमरे के काम के लिए तृप्ति गुप्ता और Frederike Alwes सेल पृथक तकनीक को परिष्कृत करने में सहायता के लिए, और डाटा, वीडियो और पांडुलिपि पर प्रतिक्रिया के लिए Extavour प्रयोगशाला के सदस्यों Rayhan आरिफ और Hassaan Shahawy धन्यवाद. इस काम आंशिक हार्वर्ड स्टेम सेल इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित किया गया (बीज अनुदान संख्या एसजी-0057-10-00) एलिसन मेडिकल फाउंडेशन (नई विद्वान पुरस्कार संख्या एजी-NS-07010-10) CGE के लिए, और हार्वर्ड कॉलेज रिसर्च प्रोग्राम पुरस्कार के लिए ARN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 VWR | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 VWR | For making mouth pipette tips. |
| 3 cm Petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 VWR | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. |
| 48-well Plates | Greiner Bio-One | 82051-004 VWR | For culturing embryos following ablation. |
| Bottle top filters 0.2 µm | Nalge Nunc International | 28199-296 VWR | For creating FASW (See below). |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 VWR | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 VWR | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 Fine Science Tools | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here. |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 Sigma Aldrich | Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 World Precision Instruments | For making needles for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 Electron Microscopy Sciences | For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females. |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024. |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 VWR | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA Sigma Aldrich | Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 Sigma Aldrich | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 Sutter Instrument Company | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 VWR | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 VWR | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 Fisher Scientific | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 A-M Systems | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. |
References
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H.
- Sander, K. Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms. Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).
- Regier, J. C., et al. Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences. Nature. 463, 1079-1083 (2010).
- Extavour, C. G. The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).
- Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Genesis. 42, 124-149 (2005).
- Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates. Development. 129, 5789-5801 (2002).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Price, A. L., Patel, N. H. Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis. J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).
- Prpic, N. M., Telford, M. J. Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage. Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).
- Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation. Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).
- Liubicich, D. M., et al. Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).
- Pavlopoulos, A., et al. Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).
- Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis. Development. 137, 3469-3476 (2010).
- Simanton, W., et al. Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology. Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Pavlopoulos, A., Averof, M. Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).
- Kontarakis, Z., et al. A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms. Development. 138, 2625-2630 (2011).
- Zeng, V., et al. De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis. BMC Genom. 12, 581 (2011).
- Zeng, V., Extavour, C. G. ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species. Database. , (2012).
- Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm. PLoS ONE. 8, (2013).
- Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).
- Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. The molecular machinery of germ line specification. Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).
- Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation. Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).
- Fraser, S. E., Harland, R. M. The molecular metamorphosis of experimental embryology. Cell. 100, 41-55 (2000).
- Olsson, L. A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius. Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Chaw, R., Patel, N. H. Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).
- Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. Microscopic Anatomy of Invertebrates. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).
