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Bioengineering

Induzida por drogas Sensibilização de adenililciclase: Racionalização Ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e siRNA Triagem Applications

Published: January 27, 2014 doi: 10.3791/51218
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

Summary

Ativação persistente de inibição G receptores acoplados à proteína resulta em sensibilização da adenilil ciclase sinalização. Para identificar as vias moleculares essenciais, abordagens nonbiased são necessárias, no entanto, esta estratégia requer o desenvolvimento de um ensaio escalável sensibilização AMPc baseado em células. Relata-se um ensaio de sensibilização para a pequena molécula e triagem siRNA.

Abstract

Sensibilização de adenilil-ciclase (AC) de sinalização tem sido implicada numa variedade de distúrbios neuropsiquiátricos e neurológicas, incluindo o abuso de substâncias e na doença de Parkinson. Activação aguda de Gαi / O-ligada receptores inibe a actividade de AC, enquanto que a activação persistente de estes receptores resulta na sensibilização heteróloga de CA e um aumento dos níveis de AMPc intracelular. Estudos anteriores demonstraram que esta melhoria da capacidade de resposta de CA é observada tanto in vitro e in vivo a seguir a activação crónica de vários tipos de receptores Gαi / ligada a O, incluindo D 2 da dopamina e μ receptores opióides. Apesar de sensibilização heteróloga do AC foi relatada pela primeira vez há quatro décadas, o mecanismo (s) que estão na base deste fenômeno são ainda desconhecidas. A falta de dados mecanicistas presumivelmente reflete a complexidade envolvida com esta resposta adaptativa, o que sugere que as abordagens nonbiased poderia ajudar na identificaçãoção das vias moleculares envolvidas na sensibilização heteróloga do AC. Estudos anteriores têm implicado quinase e sinalização Gbγ como sobreposição de componentes que regulam a sensibilização heteróloga do AC. Para identificar alvos sobrepostos únicos e adicionais associados com a sensibilização da AC, o desenvolvimento ea validação de um ensaio de sensibilização cAMP escalável é necessário para uma maior taxa de transferência. As abordagens anteriores para estudar sensibilização são geralmente complicado que implica a manutenção de cultura de células contínuo, bem como uma complexa metodologia para medição da acumulação de AMPc que envolve vários passos de lavagem. Assim, o desenvolvimento de um ensaio de base celular robusto, que pode ser utilizado para rastreio de alto rendimento (HTS) em um formato de 384 poços iria facilitar estudos futuros. Usando dois modelos celulares D 2 receptores de dopamina (ie. CHO-D 2D e HEK-AC6 / D 2D), convertemos o nosso ensaio de sensibilização 48 poços (> 20 passos 4-5 dias) para um período de cinco step, ensaio dia único em formato de 384 poços. Este novo formato é passível de triagem pequena molécula, e que demonstram que este desenho do ensaio também pode ser facilmente utilizado para a transfecção reversa de siRNA em antecipação de rastreio da biblioteca de siRNA alvo.

Introduction

Um adenililciclase adaptativo (AC) de sinalização de resposta conhecida como a sensibilização de super-heteróloga ou foi descoberto pela primeira vez no laboratório do Prêmio Nobel, Dr. Marshall Nirenberg. Dr. Nirenberg proposto que o aumento da capacidade de resposta AC observado após a ativação do receptor opióide δ crônica era um mecanismo envolvido na tolerância e dependência de opiáceos 1. Além disso a activação do receptor opióide δ crónica, esta resposta neuroadaptativo de sinalização AC também ocorre a seguir a activação persistente de vários outros Gαi / acoplada-o-receptores 2. Notavelmente, muitos destes receptores estão associados com a dor, distúrbios neuropsiquiátricos e neurológicas, e incluem opióide μ / κ, D 2/4 da dopamina, 5HT 1A, e M 2/4 receptores muscarínicos 2. Além de descobertas do Dr. Nirenberg, um grande corpo de evidências que liguem sensibilização de sinalização AC para a ativação do receptor opióide crônica tanto in vivo 3-7. Sensibilização de CA também tem sido associado com uma variedade de doenças que envolvem receptores de dopamina D-2, como incluindo esquizofrenia e da doença de Parkinson (para revisão ver referência 2). Apesar da importância potencial de sensibilização, o mecanismo preciso (s) associado com a ativação persistente Gαi / acoplada-o receptor que leva ao aumento da capacidade de resposta AC permanece em grande parte desconhecido.

Estes estudos fornecem a justificativa para examinar os mecanismos de sensibilização dos adenililciclase como um importante alvo neurobiológica. Da mesma forma, a relevância fisiológica da AC sinalização 8 e a importância que as isoformas individuais de corrente alternada conter nesta resposta adaptativa também deve ser reconhecido 2,9,10. No contexto de nossa pesquisa, as características gerais associadas com a sensibilização heteróloga das isoformas recombinantes de AC paralelo essas características descrita para estudar as isoformas endógenos de AC. Especificamente, pesquisas anteriores descobriram que a ativação de proteínas Gαi / o e subunidades posterior liberação / βγ rearranjo são requisitos importantes para a sensibilização do receptor induzida de todas as isoformas de AC. Além disso, diversos estudos sugerem que a sinalização de proteina-quinases e subunidades Gβγ esteja envolvido na sensibilização 2,11-13. ACs individuais também exibir padrões de sensibilização únicas e distintas 12. Por exemplo, a exposição persistente de receptores D 2 de agonistas está relacionado com a sensibilização de AC1 e AC8 em Ca 2 + / calmodulina 14,15 estimulação, ao passo que a AC3 estreitamente relacionada não é sensibilizado 2. AC2, AC4, e AC7 estão intimamente relacionados, no entanto, apenas a actividade da PKC-AC2 é estimulado de forma robusta sensibilizadas depois de exposição prolongada de receptores D 2 de agonistas 7,14,16,17. Além disso, AC5 e AC6 mostram um acentuado grau de hetersensibilização para ologous e Gás-acumulação de AMPc estimulada por forskolin após a ativação de receptores D 2 14,18-20, mas parecem diferir em sua exigência para Gβγ subunidade-AC interações 21. Embora a maioria dos estudos de sensibilização AC usaram linhagens de células modelo (por exemplo, células HEK293 expressando isoformas AC individuais), parece que estes resultados traduzem-se em modelos de células neuronais nativos 4,22. Mais recentemente, os efeitos de inibidores selectivos de pequenas molécula de isoformas AC identificados em células HEK293 que expressam as isoformas AC também podem ser convertidos para os estudos in vivo do comportamento 23.

A falta de um mecanismo molecular para a identificação de sensibilização heterólogo provavelmente reflecte a complexidade da resposta adaptativa, bem como as propriedades reguladoras únicas do indivíduo AC isoformas 12. Desvendando tal complexidade é ainda mais complicada pelo uso de metodologia pesado tchapéu limitou investigadores académicos de empregar abordagens imparcial. Por exemplo, os nossos estudos mecanísticos envolveu o uso de modelos celulares continuamente cultivadas utilizando 24 - e 48-formato de poço de cultura de tecidos de 15. As células em cultura foram normalmente cultivadas durante 48 horas e, em seguida, submetido a tratamento com drogas agonistas (2-18 horas), seguido por uma série de lavagens e incubações de células (Figura 1). AC-isoforma específica de cAMP de acumulação protocolos foram então empregues, seguido por medição da acumulação de cAMP utilizando um processo trabalhoso e demorado [3 H] metodologia 15,24 ligação cAMP. A duração do início ao fim, para cada ensaio, geralmente requerido um total de quatro a cinco dias de plaqueamento de células para análise de dados (Figura 1). A aplicação de novas tecnologias e automação tem levado a melhorias marcado para estudos de sensibilização no ambiente industrial e HTS centro. Por exemplo, um grupo de trabalho com o Centro Nacional de Chemical Genomics relatou um dia dois HTS processo de ensaio para identificar pequenas moléculas inibidoras da μ do receptor opióide sensibilização induzida no formato 1536-25 bem.

O presente artigo descreve os nossos esforços para desenvolver um ensaio HTS para estudos de sensibilização heteróloga utilizando tecnologias que estão disponíveis na maioria das instituições de pesquisa acadêmica. Esta estratégia foi conseguida por incorporação do uso de células criopreservadas de modelos celulares expressando heterologamente o receptor de dopamina D 2 em combinação com as isoformas de adenilil-ciclase recombinante endógenos ou individuais (CHO-D 2L ou células HEK-AC6 / D 2 L). Para melhorar o nosso rendimento, redesenhamos nosso ensaio de sensibilização 48 bem (cerca de> 20 passos mais 4-5 dias) para um de cinco etapas, ensaio dia único em formato de 384 poços que era essencialmente "misturar e ler". O novo formato utiliza um tempo homogêneo de fluorescência resolvida disponível comercialmente (HTRF) ensaio para medir cAMP accumulation em células intactas com um leitor de placa de multi modo. O ensaio é robusto e passíveis de triagem pequena molécula, e pode ser efectivamente aplicado a triagem de inibidores de sensibilização heteróloga. Além disso, podemos fornecer dados que permitem o uso deste ensaio com transfecção reversa de siRNA para triagem ampla biblioteca siRNA alvo ou genoma, com apenas uma pequena modificação para a abordagem geral.

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Protocol

1. Expansão e criopreservação de células Ensaio Pronto

  1. Cultura de CHO-K1-DRD 2L células (CHO-D 2L) sobre uma cultura de células prato 15 centímetros 2 em meio F12 de Ham enriquecido com 1,0 uM de L-glutamina, 800 ug / mL de G418, 300 ug / higromicina ul, 100 U / ul penicilina, 100 ug / mL de estreptomicina, e 10% de soro fetal bovino (FBS).
  2. Incubar as células a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO2 até as células são 90-95% confluentes. Lavar as células com 10 uL de Tampão Fosfato Salino (PBS), e colher as células por adição de 3 ul de tampão de dissociação de células durante 5 min a 37 ° C. Ressuspender as células utilizando 12 mL dos meios de cultura e contagem de células usando exclusão do azul de tripan.
  3. Centrifugar a suspensão de células a 500 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5 mL de meio de congelação (10% de dimetil sulfóxido, 90% FBS). Dilui-se a suspensão de células para se conseguir a concentração desejada de células (por exemplo, 1-20 x 10 6 células / mL).
  4. Alíquota 1,0 mL da solução de célula para cada cryovial. Incubar as criotubos em um recipiente de congelação de células a -80 ° C durante a noite. Transferir os criotubos para um líquido N2 tanque para o armazenamento de longo prazo.

2. Cultivo de células Pronto Ensaio (e transfecção reversa opção)

  1. Rapidamente descongelar um criotubo gelado de células em um banho de água a 37 C º. Uma vez que as células são descongelados, transferir as células para um tubo cônico de 15 mL contendo 9 mL de Opti-MEM, e misturar invertendo o tubo 3-5x.
  2. Centrifugar as células a 500 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de Opti-MEM.
  3. Contar as células usando exclusão com azul de tripano para determinar a viabilidade das células e diluir as células viáveis, conforme necessário (por exemplo. De 3 x 10 5 células / mL de concentração) emOpti-MEM. Placa 10 uL / ​​poço de células em cultura de tecidos tratados placa de 384 poços com uma pipeta multicanal.
  4. Fazer diluições seriadas de AMPc em Opti-MEM para gerar uma curva padrão para estimar a produção de cAMP por as células (de acordo com a recomendações do fabricante - ver Secção 7). Adiciona-se 10 uL / poço dos padrões de cAMP à placa Nota:. Uma curva padrão único pode ser preparado sobre uma placa separada ou poços em branco sobre uma das placas de ensaio.
  5. Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente, e incubar a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 durante 1 hora.

3. SiRNA transfecção opção Inverter *

Esta secção é opcional e relevante para a Figura 3.

  1. Prepara-se uma solução de siRNA em DDH RNase 2 O (por exemplo, de 0,4 pmol / ul). Adicionam-se 5 ul a poços individuais de placas de 384 poços, e centrifugar a placa a 100 xg por 15 sic à temperatura ambiente.
  2. Diluir Lipofectamina 2000, em Opti-MEM por um fator de 0,006 (por exemplo, adicionar 6 mL de Lipofectamina 2000 a 1000 l de Opti-MEM), e misture por pipetagem cima e para baixo.
  3. Incubar a solução Lipofectamine 2000/Opti-MEM durante 5 min à temperatura ambiente. Adicionar 5 ml da solução de Lipofectamine 2000/Opti-MEM diluída para poços individuais de placas de 384 poços que já contém siRNA. Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente.
  4. Incubar a placa durante 30 minutos à temperatura ambiente.
  5. Células prontas ensaio em placa, como descrito acima (Seção 2). Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente.
  6. Retornar placa de ensaio para incubadora humidificada a 37 ° (5% CO 2) C durante 48-96 horas, tal como determinado para o gene alvo derrubar (ver discussão).

4. Pequeno Screening Molecule

  1. Dilui-se o fármaco de interesse (por exemplo, inibidores. Moléculas pequenas) em Opti-MEM a 6x a concentração final desejada. Diluições em série pode ser concluída usando pipetas de mão ou uma estação de tratamento de líquido.
  2. Adicionar 2,5 mL / poço de composto de teste ou tampão contendo veículo (por exemplo, DMSO) para o lado das cavidades com uma pipeta multicanal.
  3. Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente (incubação é opcional).

5. Persistente tratamento com o agonista

  1. Prepara-se uma de 600 nm (ou seja. 6 vezes a concentração final desejada de 100 nM), solução de quinpirole em Opti-MEM.
  2. Adicionar 2,5 mL / poço de solução quinpirole 600 nM para o lado das cavidades com uma pipeta multicanal.
  3. Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente, e incubar a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 durante 2 horas.

6. Estimulação de AMPc Acumulação

  1. Durante a incubação de 2 horas, preparar as stimulatiem solução em Opti-MEM. A solução de estimulação é composta por 40 uM de forscolina, 2 uM de 3-isobutil-1-methyxanthine (IBMX), e 4 uM espiperona (todas as concentrações no passo 6 são 4x a concentração final desejada).
  2. Adicionar 5 uL / ​​poço da solução de estimulação para o lado das cavidades com uma pipeta multicanal.
  3. Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente, e incubar à temperatura ambiente durante 1 hora.

7. Têmpera e Estimativa de cAMP Acumulação

  1. Produção de AMPc pelas células é medida utilizando o kit de cAMP dinâmica 2, de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, reconstituir anti-cAMP-criptato e cAMP-d2 em água destilada. Congelar alíquotas a -20 ° C para armazenagem de curta duração.
  2. Dilui-se uma alíquota de anti-AMPc-criptato e uma alíquota de cAMP-D2 separadamente em tampão de lise de acordo com as instruções do fabricante para fazer soluções de trabalho.
  3. Add 10 ul / poço de solução de trabalho de anti-cAMP-criptato e 10 ul / poço de solução de trabalho de cAMP-D2 para a placa de 384 poços com uma pipeta multicanal.
  4. Centrifugar a placa a 100 g durante 15 segundos a temperatura ambiente, e incubar à temperatura ambiente durante 1 hora.
  5. Leia a placa em um leitor de placas de fluorescência (configuração de escala automática para a sensibilidade) com uma excitação de 337 nm e medir as emissões em 620 nm e 665 nm por instruções do fabricante.
  6. Aplicar análise raciométrica para avaliar curva padrão cAMP por instruções do fabricante. Usando os valores resultantes, extrapolar a acumulação de AMPc estimada nos poços de teste, utilizando o software de análise de dados.

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Representative Results

Parte I. Desenvolvimento de um ensaio de sensibilização bem heterólogo 384 para a identificação de inibidores de moléculas pequenas utilizando um modelo de células comercialmente disponível.

Estudar sensibilização heteróloga em um modelo de celular, fizemos uma série de melhorias que nos permitiu agilizar o ensaio em um formato "misturar e ler". Várias das modificações principais são destacadas a seguir, e são descritos em mais pormenor na discussão. O primeiro passo fundamental foi modificando nossa cultura de células a partir de células cultivadas continuamente para células criopreservadas 26. Nós agora rotineiramente lotes de cultura de células que podem ser criopreservadas em concentrações entre 1-20 x 10 6 células / mL. Para cada ensaio respectivo, os estoques de células são descongeladas, diluídas, contadas, e depois plaqueadas directamente em placas de 384 poços. Ao eliminar a necessidade de um período de cultura e aumentar a conveniência do doseamento. O formato do nosso ensaio de sensibilização prévia utilizada tiss 48 poçosplacas de cultura de ue, e envolveu uma série de lavagem, decante, etapas de transferência, e um à base de filtração [3 H] cAMP ensaio de ligação (Figura 1). Assim, este formato para a sensibilização não era passível de aplicações de alto rendimento. Por isso, exercido um esforço significativo para simplificar o ensaio para um primeiro de 96 poços e, em seguida, um formato de 384 poços pode ser alterada para rastreio de alto rendimento. A otimização eliminação envolver de etapas de lavagem e avaliação de vários tipos de placas de cultura / ensaio, diferentes densidades celulares, e as diferentes tempos de incubação. Exploramos também várias metodologias para a detecção de cAMP e descobriu que a tecnologia HTRF cAMP bem caracterizado utilizado no presente protocolo foi altamente reprodutível, confiável e extremamente estável. Esta plataforma de ensaio baseia-se immunocompetition entre o AMPc produzido pelas células e cAMP marcado (isto é. CAMP-d2) fornecido com o kit. Nós agora temos desenvolvido com sucesso e protocolos aplicados para SensIT heterólogazação em formato de 384 poços que são essencialmente "misturar e ler" (painel direito Figura 1).

Nosso objetivo inicial era a de gerar um alto throughput D 2L ensaio sensibilização receptor utilizando células CHO-D 2D comercialmente disponíveis (humanos DRD 2D, número de acesso: NM_000795) que endogenamente expressar AC6 e AC7 27. As células CHO-D 2L criopreservadas foram plaqueadas a 3000 células / cavidade em uma placa de cultura de tecidos de 384 poços, e foram equilibradas durante 1 hora a 37 ° C numa incubadora humidificada. As placas foram removidas da incubadora e concentrações crescentes de D 2 quinpirole agonista foram adicionados à temperatura ambiente. As células foram então incubadas durante 2 horas a 37 ° C numa incubadora humidificada. A acumulação de AMP cíclico foi então iniciada pela adição de 10 pM de forscolina (um activador directo de AC). O tampão de acumulação de cAMP continha um inibidor de fosfodiesterase, isobutilmetilxantina (IBMX), Bem como o antagonista de D 2, espiperona (1 uM, K i para D, 2D = 0,07 nM), a fim de evitar a activação do receptor D 2 residual durante a fase de acumulação de cAMP. As células foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. O ensaio foi terminado pela adição de um tampão de lise contendo os reagentes HTRF cAMP. Os estudos revelaram que um pré-tratamento de 2 horas com quinpirole aumentada subsequente acumulação de AMPc estimulada por forscolina, de uma forma dependente da dose consistente com a sensibilização heterólogo (Figura 2A). Os resultados desta experiência demonstram que os ensaios de sensibilização podem ser realizados num formato de 384 poços. O novo formato de ensaio de redução do número de passos a partir de mais do que 20 a 4 passos, sem a necessidade de lavagem ou decantar passos tornando-se um "misturar e ler" ensaio (Figura 1).

A segunda série de experiências investigou se este novo ensaio aerodinâmico pode ser utilizada para umainibidores ssess de sensibilização no modelo CHO-D 2L. CHO-D 2 L células criopreservadas foram plaqueadas numa placa de cultura de tecido de 384 a uma densidade de 3000 células / poço em Opti-MEM. Conhecidos antagonistas D 2 foram adicionados para bloquear a sensibilização induzida pela D-2 receptor. Opti-MEM contendo 100 nM quinpirole (concentração final) foi em seguida adicionado a um volume total de 15 uL, e as células foram incubadas durante 2 horas a 37 ° C numa incubadora humidificada. Após a incubação, a acumulação de cAMP foi iniciada por meio da adição directa de forscolina (10 ^ M concentração final), e o ensaio foi terminado e AMPc medido usando HTRF. Os resultados iniciais mostraram que o pré-tratamento com espiperona ou haloperidol (D prototípico dois antagonistas) preveniu completamente sensibilização induzida quinpirole de forscolina acumulação de AMPc estimulada (Figura 2B). Estes resultados proporcionam a validação de que esta abordagem pode ser utilizada para identificar os pequenosinibidores de moléculas de D 2 sensibilização induzida pelo receptor. Numa segunda experiência, utilizou-se este método para avaliar a potência de uma série de antagonistas D 2 para testar se estes compostos inibem a sensibilização. Tal como os resultados anteriores, estes estudos demonstraram que os antagonistas D 2 inibiu sensibilização induzida agonista de um modo dependente da dose (Figura 2C). A ordem de potência para a inibição da sensibilização foi coerente com suas ações como D 2 antagonistas dos receptores e sua farmacologia anteriormente descrito em D 2 receptores 28.

Parte II. Aplicação de ensaio de sensibilização de 384 poços para a transfecção reversa de siRNA em empreendimentos de rastreio.

O nosso objectivo seguinte foi o de desenvolver um ensaio de sensibilização de 384 poços que pode ser usada para realizar a transfecção escalável inversa siRNA de rastreio de bibliotecas. Estudos preliminares foramrealizada através de um modelo de célula HEK que heterologamente expressa ambos os receptores de dopamina D 2D (rato DRD 2D, número de acesso: NM_012547) e AC6 (ADCY6 rato, número de acesso: NC_005120) (ou seja, as células HEK-AC6 / D 2D). As primeiras experiências avaliou a capacidade de demonstrar sensibilização induzida por agonista de AC na linha celular. Resumidamente, as células AC6 / D 2L criopreservados foram semeadas (1000 células / poço) em uma placa de 384 poços de cultura de tecidos. Opti-MEM contendo 1 quinpirole uM (concentração final) foi adicionado a um volume total de 15 uL, e as células foram incubadas durante 2 horas a 37 ° C numa incubadora humidificada. Após a incubação, a acumulação de cAMP foi iniciada pela adição de concentrações crescentes de forskolin. O ensaio foi terminado pela adição de tampão de lise contendo os reagentes HTRF. Os resultados revelaram que a exposição de células a quinpirole agonista durante 2 horas levou a uma melhoria acentuada da CAM estimuladas com forscolinaAcumulação de P (Figura 3A). O aumento da acumulação de AMPc em ambos 100 nM e 300 nM de forscolina era maior do que 15 vezes em comparação com as células tratadas com o veículo (Figura 3A).

Em seguida, utilizamos publicado siRNA metodologias 29,30 para guiar os nossos esforços de otimização que incluiu uma avaliação de várias condições de transfecção reversa (por exemplo, reagentes de transfecção, a eficiência de transfecção, densidade celular, tempo de incubação, etc.). Estudos preliminares utilizado siGloRed, um indicador de transfecção, em combinação com Lipofectamine 2000 para determinar as condições óptimas inversa transfecção. As experiências indicaram que 2-4 pmol siRNA / 5 mL de H 2 O combinada com 0,03 ul de Lipofectamina 2000/5 ul de Opti-MEM fornecida uma eficiência de transfecção quase 95% em 72 horas, sem qualquer toxicidade observável em células HEK (dados não mostrados). Em seguida, examinaram o efeito de Gαs siRNA na sensibilização heterólogaforscolina de acumulação de AMPc estimulada em células AC6 / D 2L. O siRNA Gas foi proposto como um potencial controle positivo porque Gαs tem sido identificada como um componente-chave de sensibilização heteróloga para várias isoformas AC (ou seja, AC1, AC2, AC5 e AC6) 19-21. Além disso, o sinal de sensibilização de 15 vezes em a AC6 / D 2L modelo celular (Figura 3A) fornece um sinal robusto para a janela de ruído para avaliar a eficiência de transfecção inversa. Utilizando as condições descritas acima, concluímos estudos preliminares avaliaram Gαs siRNA como um controlo positivo, e os resultados demonstraram uma forte bloqueio (> 90%) de sensibilização (dados não mostrados).

A redução induzida pelo siRNA dramático do sinal de sensibilização proporciona um controlo positivo apropriado para o processo de triagem de siRNA. Para se obter uma avaliação mais quantitativa para siRNA triagem de sensibilização heteróloga AC, geramos dados em queum factor de Z "foi calculado para uma série de condições de ensaio, usando as células AC6 / D 2D 31. Para esta experiência, que combinado 2 pmol Gαs siRNA, ou o controlo de siRNA não alvo, em 5 mL com 0,03 ul de Lipofectamina 2000/5 ul de Opti-MEM por cavidade em uma placa de 384 poços (volume total de 10 ul). As células criopreservadas foram descongeladas, ressuspensas em Opti-MEM e depois adicionados a poços individuais contendo a mistura de ARNsi / lipofectamina utilizando várias densidades de células (isto é. 500-5.000 células/10 ul / poço). A duração do tratamento quinpirole (2 h vs 18 horas), bem como a concentração final de forscolina (100-300 nM) foram também exploradas no nosso ensaio de sensibilização AC6 / D 2L. Os resultados destas experiências revelaram que o factor de um robusto Z 'foi obtido nas seguintes condições: 750 células / poço, a duração de 72 horas de transfecção, 2 horas de tratamento quinpirole, e 300 nM de forscolina para estimular a acumulação de cAMP (Figura 3B). Nestas conditions, obteve-se uma resposta de 15 sensibilização dobra que foi reduzido em 94% na presença de Gαs siRNA (Z 'de 0,6 para Gαs siRNA vs. controlar siRNA).

Figura 1
Figura 1. No formato tradicional, as células foram semeadas em formato de 48 poços e crescidas até à confluência ao longo de 48 horas. O meio de crescimento foi decantado, os inibidores de moléculas pequenas adicionado, seguido por adição do agonista D 2. Após a incubação de 2 horas, com meio de ensaio é decantado e as células são submetidas a uma série de passos de lavagem / decantação. Em seguida, a CA é estimulada e as células são lisadas. A acumulação de AMP cíclico é, em seguida, avaliada utilizando [3 H] cAMP ensaio de ligação, que é um ensaio de dois dias requerendo um passo de filtração e contagem de cintilações. Embora o formato de 96 poços Eliminciado muitos dos passos de lavagem e decantar, descobrimos que este formato não foi prontamente passíveis de HTS ou automação. O formato HTS utiliza células criopreservadas que são plaqueadas directamente em placas de 384 poços. Estas células criopreservadas são "ensaio pronto" depois de um equilíbrio de 1 hora. Após este período de incubação inicial, os inibidores de moléculas pequenas podem ser adicionados, seguido pela adição de D 2 agonista para uma incubação de 2 horas. AC é estimulado, e as células são lisadas utilizando os reagentes de detecção HTRF na placa de ensaio.

Figura 2
Figura 2. Células criopreservadas CHO-D 2L foram semeadas directamente em placas de ensaio de 384 a 3000 células / poço e equilibrado durante 1 hora. A.) Aumentando as concentrações do agonista D 2, quinpirole, foram adicionados e as células foram incubadas durante 2 horas a 37 ° C numa incubadora humidificada. A acumulação de AMP cíclico foi estimulada com forscolina 10 uM (concentração final) na presença de espiperona e IBMX durante 1 hora à temperatura ambiente. A reacção foi parada utilizando reagentes de ensaio de HTRF AMPc (n = 1, representativas de pelo menos três experiências). Os dados são expressos como uma resposta por cento das células tratadas com o veículo. Células B.) CHO-D 2L foram pré-tratadas na ausência (controlo) ou na presença de antagonistas do receptor D 2 (ou seja, indicados espiperona ou haloperidol). Quinpirole (100 nM) foi adicionado, e as células foram incubadas durante 2 horas para induzir a sensibilização. AC foi estimulada com forscolina 10 uM (concentração final) durante 1 hora à temperatura ambiente. O AMP cíclico foi determinado usando HTRF. Os dados são expressos como uma resposta por cento das células tratadas com o veículo. C.), as células CHO-D 2L foram pré-tratadas na ausência (controle =100%) ou na presença de concentrações crescentes de antagonistas do receptor D 2 indicadas. Quinpirole (100 nM) foi adicionado, e as células foram incubadas durante 2 horas para induzir a sensibilização. AC foi estimulada com forscolina 10 uM (concentração final) durante 1 hora à temperatura ambiente. O AMP cíclico foi determinado usando HTRF. Os dados são expressos como uma porcentagem da resposta sensibilização induzida por quinpirole. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 3
Figura 3. Células criopreservadas HEK-AC6 / D 2L foram plaqueadas a 1000 células / poço e equilibrou-se durante 1 hora. A.) As células foram incubadas com o veículo ou 100 nM quinpirole durante 2 horas numa incubadora humidificada. Wa ACs estimuladas com concentrações crescentes de forskolin durante 1 hora à temperatura ambiente. AMP cíclico foi determinada utilizando HTRF. B.) transfecção reversa de Gαs siRNA blocos sensibilização nas células AC6 / D 2D. Gαs siRNA ou o controlo de siRNA nontargeting (2 pmol) foi combinada com 0,03 ul Lipofectamine2000 (lipo) em um volume total de 10 uL, e a solução foi adicionada a poços individuais numa placa de 384 poços. AC6 criopreservadas / D 2L células foram então adicionados para a transfecção reversa e incubadas durante 70 horas a 37 ° C numa incubadora humidificada. O agonista do receptor D 2, quinpirole (1 uM final), ou veículo foi adicionado seguido de uma incubação de 2 horas. Acumulação AMP cíclico foi estimulado com 300 nm forskolin (concentração final) para 1 hora e medida usando HTRF. Clique aqui para ver imagem ampliada.

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Discussion

Em um esforço para facilitar os estudos de sensibilização heteróloga, temos extensivamente modificado nosso método anterior alcançar uma simplificada "mix e ler" formato que pode ser alterada a seleção de alto rendimento e mecanismo de exame ação. As modificações importantes nosso protocolo pode ser resumido como se segue: 1) o uso de células criopreservadas como reagentes de ensaio "pronto", 2) a miniaturização do ensaio em formato de 384 poços, e 3) a utilização da medição de HTRF cAMP.

A adoção de criopreservação para os nossos ensaios baseados celular tem melhorado muito a eficiência e reprodutibilidade para o nosso dia-a-dia e experiências de triagem empreendimentos. Esta abordagem é um padrão da indústria, e pode ser facilmente traduzido para a pesquisa acadêmica criação 26. Para melhorar a eficácia da cultura de células, frascos de células são utilizadas como "fora dos reagentes de prateleira", em que as reservas de células são descongeladas, diluída, e em seguida, revestida directamente em placas de 384 poços de for cada ensaio. Nós previamente incorporada células criopreservadas em estudos que visam identificar antagonistas de proteína G invertebrados receptores acoplados 32,33. Esta metodologia foi vantajoso na medida em que o trabalho inicial não foi realizada em nosso laboratório e exigiu transportar células cultivadas em todo campus que apresentaram desafios e provavelmente introduzidas variabilidade. Utilizando a nossa nova abordagem, as células congeladas podem agora ser imediatamente descongelados e diluídos no local antes do início do ensaio. Além de melhorar a reprodutibilidade, criopreservação também eliminado o período de tempo de 48 horas de plaqueamento de células para a execução do ensaio (Figura 1). Nós temos aplicado com sucesso a abordagem criopreservação em estudos de transfecção estáveis ​​e transientes usando uma variedade de receptores recombinantes e subtipos de ACs com leituras funcionais, incluindo a acumulação de AMPc e recrutamento β-arrestin (Brust, TF, Ejendal, KFK, e Watts, VJ observações não publicadas) . DesPite nossas experiências positivas até à data, os investigadores devem verificar se o receptor ou alvo, e sistema de célula de modelo é compatível com a criopreservação antes de iniciar qualquer estudo de grande escala.

A segunda modificação que era importante para os nossos esforços para simplificar o ensaio de sensibilização eliminação envolver de decantar e lavar etapas (Figura 1). Estas alterações foram simultâneo com a miniaturização do ensaio para um formato de 96 poços (Conley e Watts, observações não publicadas). Especificamente, um protocolo de sensibilização modificado foi concebido em que a acumulação de cAMP foi iniciada por meio da adição directa de forscolina em tampão de ensaio seguindo D 2 agonista de incubação na ausência de quaisquer passos de lavagem ou de decantação (ver painel do meio Figura 1). Além disso, o tampão de acumulação de cAMP continha uma concentração relativamente elevada de espiperona (1 uM), um antagonista de D 2 que tem um valor de Ki de 0,07 nM para a D 2receptores 15. Este 100 vezes a concentração excessiva de resultados Espiperona em ocupação completa receptor D 2 durante a fase de acumulação de AMPc, impossibilitando assim D 2 a ativação do receptor residual por agonistas (por exemplo quinpirole) durante o forskolin estimulado passo AC 15. Esta mudança eliminou a três decantar e três passos de lavagem a seguir à incubação inicial agonista. No âmbito do desenvolvimento de formato de 96 poços, que também foram capazes de eliminar o passo final antes da têmpera decantar e lisar as células. Esta modificação foi realizada aumentando a concentração do nosso reagente de lise (ácido tricloroacético ou seja,. TCA) 3-9% e adicionando o reagente directamente ao tampão de acumulação de AMPc. Os resultados promissores do ensaio de 96 poços sensibilização modificado fornecido suporte para a conversão do ensaio de sensibilização com um formato de 384 poços. Infelizmente, a nossa metodologia anterior para quantificar acampamento foi um filtratio laboriosobaseado no n [3 H] cAMP ensaio de ligação de proteína (> 5 passos). Por exemplo, o ensaio é geralmente completada ao longo de dois dias para permitir a secagem do filtro e contagem de cintilação 15,24. Estas desvantagens feita a [3 H] cAMP de proteína de ligação impraticável utilizar um formato de alto rendimento de 384 poços.

O terceiro elemento-chave veio através da incorporação de metodologias para medir e quantificar cAMP de forma favorável para o formato de 384 poços. Por exemplo, temos uma experiência significativa usando um elemento cAMP Response (CRE), com base em sistema de repórter luciferase para medições de cAMP relativas em um formato de 384 poços 32,33. Embora esta abordagem tem sido utilizada com sucesso por nosso laboratório para muitos estudos de receptores acoplados Gαs, os repórteres CRE-luc estão sujeitas a um número de falsos positivos e negativos durante testes de rastreio 34. Além disso, nossa D 2 estudos de sensibilização preliminares com este aplicativobarata não foram encorajadores em que foi observada a inibição aparente de realimentação do sinal de luciferase (dados não mostrados). Por isso, concentramos nossos esforços na implementação da tecnologia GloSensor cAMP através da construção e caracterização de linhagens de células estáveis ​​utilizando tanto o seu "primeiro" e "segundo" vetores GloSensor geração. O GloSensor é um repórter de luciferase engenharia contendo um sítio de ligação de cAMP no interior da proteína luciferase de 35. Embora o sistema é muito útil para a cinética de quantificação de cAMP, o método não foi eficaz para a medição induzida por agonista de sensibilização (Conley e Watts, observações não publicadas). Também explorou uma BRET baseado cAMP biosensor 36 para os nossos estudos como um custo eficaz de meios para avaliar a acumulação de AMPc. Infelizmente, o ruído de fundo associada com o biossensor transfectadas transitoriamente limitado a capacidade para adaptar-se este método para o nosso ensaio de sensibilização. Por fim, avaliamos vários kits empregando tempo homogêneo fluor resolvidoescence (HTRF) como uma abordagem para medir AMPc em formato de 384 poços. Descobrimos que esta metodologia estabelecida era mais compatível com laboratórios acadêmicos e instalações de triagem em que eram robustos, sensível, estável e fácil de usar. A principal desvantagem para os pesquisadores acadêmicos é o custo dos reagentes, no entanto compra em massa de reagentes e miniaturização para 384 formato bem faz com que o preço mais do que competitivo com outros kits, incluindo ensaios baseados ELISA e nossa anterior "caseiro" [3 H] proteína cAMP ensaio 15 vinculativo.

O trabalho representativo demonstra a aplicabilidade do ensaio de sensibilização de 384 poços de estudos de receptor de dopamina D 2 sensibilização induzida de sinalização AC em linhas de células recombinantes. Em vários estudos preliminares, temos usado este ensaio com pequenas modificações para avaliar D 2 receptor de dopamina e receptor opióide μ sensibilização induzida de várias isoformas de AC (Tabela 1). Estes estudos sublinham a aplicabilidade geral do ensaio de 384 cavidades para várias linhas de células, os subtipos de receptores, e as isoformas de corrente alternada. Os interessados ​​no desenvolvimento de formatos de ensaio semelhantes seriam encorajados a explorar variáveis ​​como densidade celular, tempos de pré-tratamento agonistas, AC protocolos de ativação / condições e metodologia de detecção HTRF acampamento para os seus modelos de celulares. Os dados antagonistas aqui apresentados demonstram a capacidade do ensaio para identificar pequenas moléculas inibidoras de sensibilização. Os valores de potência são consistentes com os determinados com outros ensaios funcionais 28, bem como os valores de afinidade (Ki) obtidos utilizando-se ensaios de ligação de radio-receptores (ver: http://pdsp.med.unc.edu/pdsp.php). O projeto ensaio presente poderia facilmente acomodar HTS esforços onde os compostos são entregues através de um pintool ou estão preplated em placas prontos ensaio. Além dos ensaios de sensibilização descritos, as metodologias aplicadas aqui deve ser aplicável a outro anúncioensaios aptive onde várias drogas / reagentes são aplicadas antes de uma medida de ponto final no formato de 384 poços.

Nós tentamos destacar etapas importantes de desenvolvimento para todo o ensaio de 384 poços, mas também quero ressaltar que o desenvolvimento dos ensaios de transfecção siRNA reversa foi particularmente desafiador. Nosso objetivo de longo prazo para estes ensaios é a realização de um amplo esforço de genoma para identificar os genes que se sobrepõem e únicos envolvidos na sensibilização heteróloga das isoformas de AC. Usando nosso ensaio siRNA inicial como uma diretriz, nós oferecemos as seguintes sugestões abreviados para o desenvolvimento de um siRNA ensaios de transfecção reversa: (1) examinar a eficiência de transfecção utilizando proporções de um indicador como Siglo e reagentes de transfecção (. Eg Lipofectamina 2000), (2) determinar a densidade de sementeira óptima (por exemplo, 500-5.000 células / poço), (3) explorar duração transfecção (por exemplo, 48-96 horas), e (4) avaliar as condições de ensaio adequadas (por exemplo, tr drogaeatments, medidas de ponto final e controles robustos) para alcançar melhor sinal (análise fatorial por exemplo Z '). Detalhes adicionais e informações gerais para o uso de siRNA em esforços de triagem também podem ser encontradas nos métodos de artigos anteriormente referenciados 29,30. Os investigadores que estão interessados ​​nos esforços HTS também deve explorar a capacidade de adaptação de seus ensaios para automação (por exemplo. Pintool e robótica). Além disso, outros fatores ou controles para empreendimentos de triagem incluem validação formal ensaio, ensaios de viabilidade celular, e telas de balcão apropriadas. Para informações adicionais, o leitor interessado seriam incentivados a examinar o Manual de Orientação NCGC Ensaio disponível através NCATS em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/.

Nós descrevemos nossa abordagem para a racionalização um ensaio laborioso multiday numa eficiente "mistura e ler" ensaio que pode ser realizado num único dia. As metodologias aqui descritas e umaestudo recente de 1.280 compostos na sensibilização induzida receptor μopioid em formato 1536-bem 25 sugere que a sensibilização pode agora ser facilmente interrogado utilizando HTS. O ensaio aqui descrito é susceptível de pequena molécula de teste e pode ser aplicado para as abordagens genéticas tais como siRNA. Nosso formato de ensaio é focada na resposta adaptativa conhecido como sensibilização heteróloga do AC, no entanto, a abordagem geral e métodos podem ser amplamente aplicada a outros ensaios baseados em células que necessitam de múltiplas drogas e de reagente adições (por exemplo, de dessensibilização e neuroproteção.). O trabalho aqui relatado é facilmente realizado dentro de um ambiente acadêmico usando pipetas multicanal e um multi leitor de placas modo capazes de ler o desfecho desejado em formato de 384 poços.

Tabela 1. Os modelos celulares testados quanto à sensibilização induzida por agonista.

Receptor AC Isoforma Linha celular Sensibilização
sinal
D 2L dopamina Endógeno
(AC6 e AC7 27) 		CHO-D 2L 2-3 dobra
D 2L dopamina AC2 Recombinante, AC5 e AC6 HEK 293 transfectadas de forma estável AC2 = 2-3 dobra
AC5 = 50 dobra
AC6 = 15 dobra
μ opióide AC1 Recombinante, AC2 e AC5 HEK 293 transfectadas de forma estável AC1 = 6-7 vezes
AC2 = 2-3 dobra
AC5 = 10-15 vezes

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer o Sr. Richard Zink e Todd Wiernicki para treinamento e orientação metodológica ensaio. Agradecemos também a John Paul Spence para a leitura cuidadosa e sugestões editoriais. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, e Eli Lilly and Company por meio do Programa de Pesquisa Prêmio Lilly (LRAP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHO-K1-DRD2L cells DiscoveRx 930579C2
Ham’s F12 media VWR SH30026fs
Fetal Bovine Serum VWR SH3007003
G418 Sigma A1720
Hygromycin Fisher 50-230-5556
Penicillin/streptomycin Life Technologies 15070063
15 cm dishes BD Falcon 353025
DMSO Sigma D2650
Cell dissociation buffer Life Technologies 13150016
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 10010-049
Cryovials Fisher 976171
Opti-MEM Life Technologies 31985070
TC treated 384-well plates Perkin-Elmer 6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 kit Cisbio Bioassays 62AM4PEB http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4 Biotek H4MLFPTAD
Prism 6 GraphPad Software NA
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
(±)Quinpirole Sigma Q111
Spiperone Sigma S7395
Clozapine Sigma C6305
Haloperidol Sigma H1512
S-(-)Sulpiride Sigma S112
Lipofectamine 2000 transfection reagent Invitrogen 11668019
Trypan blue Life Technologies T10282
Water, DNase- and RNase-free MP Biomedicals 821739
Gas siRNA Dharmacon custom siRNA
Nontargeting siRNA control Dharmacon D-001206-14-20
siGlo Red Dharmacon D-001630-02

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References

  1. Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
  2. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
  3. Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
  4. Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
  5. Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
  6. Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
  7. Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
  8. Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
  9. Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
  10. Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
  11. Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
  12. Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. Siehler, S., Milligan, G. 10, Cambridge University Chapter. 189-217 (2010).
  13. Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
  14. Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
  15. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
  16. Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
  17. Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
  18. Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
  19. Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
  20. Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
  21. Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
  22. Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
  23. Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
  24. Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
  25. Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
  26. Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
  27. Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
  28. Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
  29. Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
  30. Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  32. Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
  33. Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
  34. Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
  35. Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
  36. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).

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