Ved at kombinere indfødte og tværbindende kromatin immunofældning med høj opløsning massespektrometri, ChroP tilgang gør det muligt at dissekere den sammensatte proteom arkitektur histon modifikationer, varianter og ikke-histonic proteiner synergizing på funktionelt distinkte kromatin domæner.
Kromatin er en meget dynamisk nukleoprotein kompleks lavet af DNA og proteiner, der styrer forskellige DNA-afhængige processer. Kromatin struktur og funktion på bestemte områder er reguleret af den lokale berigelse af histon post-translationelle modifikationer (hPTMs) og varianter, kromatin-bindende proteiner, herunder transkriptionsfaktorer og DNA methylering. Den proteomisk karakterisering af kromatin komposition ved distinkte funktionelle regioner har været hidtil hæmmet af manglen på effektive protokoller til at berige sådanne domæner på et passende renhed og beløb for den efterfølgende dybtgående analyse af massespektrometri (MS). Vi beskriver her en nydesignet kromatin proteomics strategi, opkaldt ChroP (CHRO matin P roteomics), hvorved en præparativ kromatin immunoprecipitation bruges til at isolere forskellige kromatin regioner, hvis funktioner i form af hPTMs, varianter og co-associerede ikke-histonic proteiner, er analyseres ved MS. Vi illustrerer hanre oprettelsen af ChroP til berigelse og analyse af transkriptionelt tavse heterochromatic regioner præget af tilstedeværelsen af tri-methylering af lysin 9 på histon H3. De opnåede resultater viser potentialet af ChroP i grundigt kendetegner heterochromatin proteom og bevise det som en stærk analytisk strategi for at forstå hvordan de forskellige protein determinanter for kromatin interagere og synergieffekt at etablere locusspecifikke strukturelle og funktionelle konfigurationer.
Kromatin er en meget dynamisk nukleoprotein kompleks, der er involveret som primær skabelon for alle DNA-medierede processer. Den nukleosom er den grundlæggende gentagne enhed af kromatin og består af en proteinholdig octamer kerne indeholdende to molekyler af hver kanoniske histon H2A, H2B, H3 og H4, omkring hvilken 147 bp DNA er pakket 1,2. Alle centrale histoner er struktureret som en kugleformet domæne og et fleksibelt N-terminal "hale", der stikker udenfor nukleosom. En af de vigtigste mekanismer til regulering chromatin struktur og dynamik er baseret på covalente post-translationelle modifikationer (PTMS), som hovedsagelig forekommer på N-terminalerne af histoner 3,4. Histon modifikationer kan fungere enten ved ændring af højere orden chromatin struktur, ved at ændre kontakten mellem histoner-DNA eller mellem nucleosomer og dermed kontrollere tilgængeligheden af DNA-bindende proteiner (cis mekanismer), eller ved at fungere som docking sites for regulatoriske proteiner, enten som enkelte enheder, eller indlejret i multimeric komplekser. Sådanne regulerende proteiner kan udøve deres funktion på forskellige måder: ved direkte at modulere genekspression (dvs. TAF-proteiner), eller ved at ændre nukleosom positionering (dvs. chromatin remodeling komplekser) eller ved at ændre andre histon rester (dvs. proteiner med methyl-transferase eller acetyl- transferase aktivitet) (trans mekanismer) 5.. Den observation, at særskilte PTM mønstre klynge på specifikke kromatin loci førte til udarbejdelsen af den hypotese, at forskellige modifikationer på separate steder kan synergize at generere en molekylær kode medierende den funktionelle tilstand af den underliggende DNA. Den "histon kode hypotese" har vundet bred enighed i de kommende år, men dens eksperimentel verifikation har været holdt tilbage af tekniske 6,7 begrænsninger.
Massespektrometri (MS)-baserede proteomics er opstået som enkraftfuldt værktøj til at kortlægge histon modifikation mønstre og til at karakterisere kromatin proteiner 8. MS detekterer en ændring som et specifikt Δmass mellem den eksperimentelle og den teoretiske masse af et peptid. På de enkelte histoner, MS leverer en upartisk og omfattende metode til at kortlægge PTMS, så påvisning af nye ændringer og afslørende samspil blandt dem 9-14.
I de seneste år er der blevet udviklet en række strategier til at dissekere proteomik sammensætning chromatin herunder karakterisering af intakte mitotiske kromosomer 15, identifikation af opløselige hPTM proteiner 16-18 og isolering og analyse af specifikke kromatin regioner (dvs. telomerer) 19,20. Men den undersøgelse af locusspecifikke synergier mellem histon PTMS, varianter og kromatin-associerede proteiner er stadig ufuldstændig. Her beskriver vi en ny tilgang, opkaldt ChroP (Kro matin P roteomics) 21, som vi har udviklet til effektivt at karakterisere funktionelt distinkte kromatin domæner. Denne fremgangsmåde tilpasser chromatin immunoprecipitation (ChIP), en veletableret protokol, der bruges i epigenetisk forskning, for en effektiv MS-baserede proteom analyse af den berigede prøve. Vi har udviklet to forskellige protokoller, afhængigt af typen af kromatin anvendt som input og behandles af MS spørgsmål; især: 1) chip optagne indfødte kromatin fordøjet med MNase er ansat til at rense mono-nukleosomer og at dissekere de co-associere hPTMs (N-ChroP); 2) chip af tværbundet chromatin fragmenteres ved lydbehandling anvendes i kombination med en SILAC baseret interactomics strategi til at karakterisere alle co-berigende chromatin proteiner (X-ChroP). Vi illustrerer her kombinationen af N-og X-ChroP for at berige og studere heterochromatin hjælp H3K9me3 som lokkemad for immunopræcipitationsringenes trin. Anvendelsen af ChroP kan udvidesat studere enten adskilte regioner på kromatin, eller ændringer i kromatin sammensætning inden for samme region under overgangen til en anden funktionel stat og dermed bane vejen for forskellige applikationer i epigenetik.
Vi har for nylig beskrevet ChroP en kvantitativ strategi for stor skala karakterisering af proteinkomponenter kromatin. ChroP kombinerer to komplementære tilgange, der anvendes i den epigenetiske område, Chip og MS, profiterer af deres styrker og overvinde deres respektive begrænsninger. Chip koblet til dyb sekventering (chip-Seq) gør det muligt genom-dækkende kortlægning af histon modifikationer på løsningen af nogle nucleosomes 35. Selvom fordelagtig for deres følsomhed er antistof-baserede assays …
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev oprindeligt udgivet i Mol Cell Proteomics. Soldi M. og Bonaldi T. proteomik Undersøgelse af Chromatin funktionelle domæner afslører Novel synergi blandt Distinct heterochromatin Komponenter MCP. 2013; 12: 64-80. © American Society for Biokemi og Molekylær Biologi. Vi takker Roberta Noberini (italiensk Institute of Technology og IEO, Italien) for kritisk læsning af manuskriptet. TB arbejde er støttet af tilskud fra Giovanni Armenise-Harvard Foundation Career Development Program, den italienske Association for Cancer Research og det italienske sundhedsministerium. MS arbejde blev støttet af en FIRC fællesskab.
DMEM | Lonza | BE12-614F | |
FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G | |
Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100ug (5 × 20μg) | Promega | V5113 | |
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15 % C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
C18 extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145004 | |
Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |