Summary
Fremkomsten af genetisk resistens over for kinase hæmmere udgør en betydelig udfordring for effektiv kræftbehandling. Identifikation og karakterisering af resistente mutationer mod en nyudviklet lægemiddel hjælper med bedre kliniske håndtering og næste generation drug design. Her beskriver vi vores protokol for in vitro screening og validering af resistente mutationer.
Abstract
Opdagelsen af BCR / ABL som drivkraft onkogen i kronisk myeloid leukæmi (CML) resulterede i udviklingen af Imatinib, som i virkeligheden vist potentiale målrette kinasen i kræft ved effektivt at behandle CML-patienter. Denne observation revolutioneret lægemiddeludvikling at målrette onkogene kinaser impliceret i forskellige andre maligniteter, såsom EGFR, B-RAF, KIT og PDGFRs. En stor ulempe ved anti-kinase behandlinger er imidlertid fremkomsten af lægemiddel-resistente mutationer der gør målet at have reduceret eller mistet affinitet for lægemidlet. Forståelse af de mekanismer, der er ansat af resistente varianter ikke kun hjælper med at udvikle den næste generation af inhibitorer, men giver også skub i den kliniske behandling ved hjælp af skræddersyet medicin. Vi rapporteret en retroviral vektor baseret screening strategi for at identificere spektret af resistens tillægger mutationer i BCR / ABL, som har hjulpet med at udvikle den næste generation BCR / ABL inhibitorer. Brug Ruxolitinib og JAK2 som et mål lægemiddel par, her beskriver vi in vitro screeningsmetoder, der udnytter muse BaF3 celler, der udtrykker tilfældig mutation bibliotek af JAK2 kinase.
Introduction
Proteinkinaser er centrale regulatoriske enzymer af intracellulære signaltransduktionsveje, som tilsyneladende modulerer hver cellulær funktion. En ordentlig kontrol med kinasemedieret signalering er afgørende for homeostase og udvikling, som for det meste er afhængig af en ordentlig regulering af kinaser, phosphataser og dens nedbrydning af UPS (ubiquitin proteasom system). Dereguleret kinaser er i centrum af mange kræftformer og impliceret i væld af sygdomme hos mennesker 1. Humane genom koder mere end 500 proteinkinaser, der er blevet knyttet direkte eller indirekte, til ~ 400 humane sygdomme 2. Disse observationer støttes konceptet for terapeutiske målretning af kinaser af små molekyle inhibitorer 3-5.
Demonstrationen af ABL-kinase inhibitorer, såsom Imatinib, i behandlingen af kronisk myeloid leukæmi (CML), forudsat at proof of concept for denne tilgang 6,7. Denne observation ikke kun revolutionerede myrenI-kinase behandling, men også håndhæves ideen til at identificere de genetiske læsioner i andre neoplastiske sygdomme til terapeutisk målretning, som fører til opdagelsen af onkogene mutationer i JAK2 fra polycytæmi vera (PV), og patienter med myeloproliferative neoplasmer (MPN). Denne opdagelse genereret stor interesse i at behandle MPNs ved at målrette JAK2 med småmolekyle-kinaseinhibitorer. Nu, næsten et dusin af JAK2 inhibitorer er i kliniske forsøg, og en af dem er blevet godkendt for nylig til behandling af myelofibrose. Mens specifik målretning af onkogene kinaser af små molekyler inhibitorer i kræft bringe lovende resultat, men også lider udvikle resistens over for behandlingen. Faktisk hidtil Patienter behandlet med kinase inhibitorer, såsom Imatinib, Gefitinib, Erlotinib og Dasatinib udviklet resistens mutationer meste ved at erhverve mutationer i kinase domæne, som lægemiddelmål 8-10. Modstand som følge af genmutation fremhæver begrænsningerne of målrettet monoterapi mod onkogene kinaser, og repræsenterer den næste udfordring i udviklingen af stadigt mere vellykket cancerkemoterapi. Mekanistiske og funktionelle konsekvenser af resistens bør give en begrundelse for valg og design af gratis forbindelser til lægemiddeludvikling. Mutationer identificeret via in vitro skærme, har vist en høj grad af korrelation med dem, der findes i patienter. Derfor in vitro screening for mutationer, som giver resistens over for medicinen for en given lægemiddelmål par i kliniske eller prækliniske udviklingsprogrammer hjælper med at identificere resistensmønstre, som sandsynligvis vil forårsage klinisk tilbagefald. Identifikationen af disse muterede former er ikke kun nyttige i overvågningen af patienter lægemiddelrespons og tilbagefald, men også afgørende for udformningen af mere robuste næste generations hæmmere. For eksempel udvikling af næste generation BCR / ABL inhibitorer, Nilotinib og Ponatinib blev muliggjort på grund af større mechanistic forståelser gøres med mutagenese, strukturelle, og funktionelle studier.
Tidligere har vi rapporteret resultaterne af vores skærm ved hjælp af tilfældig mutagenese af BCR / ABL at afsløre spektret af mutationer giver resistens mod inhibitorer, såsom Imatinib 11,12, PD166326 12, og AP24163 13. Resultaterne ikke blot identificeret mutationer giver klinisk resistens og sygdom tilbagefald, men også den mekanistisk forståelse af modstand og principper for kinase funktion 11,14 stof. Her giver vi yderligere metodologisk detalje, hjælp Ruxolitinib og JAK2 som et lægemiddel målpar, for at muliggøre en bredere anvendelse af denne screening strategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle procedurer denne protokol blev udført ifølge National Institute of retningslinjer for etisk behandling og pleje af dyr Sundhed, og ifølge en godkendt IACUC anvendelsen af dyr protokol.
1. cellelinie Vedligeholdelse
- Kultur BaF3-celler i RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og penicillin / streptomycin (100 enheder / ml og 100 ug / ml) og brugt dyrkningsmedium WEHI Cells. Grow HEK293T celler i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum og penicillin / streptomycin (100 enheder / ml og 100 ug / ml). Oprethold celler ved 37 ° C i en befugtet atmosfære indeholdende 5% CO2.
2. Plasmid Construction
- Klon musen JAK2 og dens onkogene isoform JAK2-V617F i pMSCV-puro-GW af LR CLONASE anvendelse af standard rekombination kloning procedure.
- Til konstruktion af luciferase ekspressionsvektor (pMSCV-Luc-Cherry-GW), der anvendes i i-vivo billeddannelse, forstærke luciferase fra pLVX-Tet-ON vektoren ved PCR under anvendelse af primere (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG og LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) efterfulgt af kloning i pENTR-SD-TOPO at generere pENTR-Luc, som anvendes at overføre luciferasegenet i retroviral vektor, pMSCV-Cherry-GW ved rekombination medieret kloning ved anvendelse af LR CLONASE.
3. Fremstilling af Random Mutation Bibliotek, screening og identifikation af mutationerne
3.1) tilfældig mutagenese
- Klon fulde længde af JAK2 vildtype og V617F mutation i pMSCV-puro-GW retroviral vektor ved hjælp af en kommerciel rekombination kloningsteknologi.
- Brug 1 ug JAK2-V617F plasmid-DNA til at transformere, XL-1 Rød, E. coli-celler, som er defekte i DNA-reparation mekanismer således tillade dem at optage tilfældige mutationer under replikation. Mere specifikt blandes 50 til 100 ng DNA (mere end 100 ng DNA falder transformationseffektivitet) med 100 pi kompetente celler i en præ-kølet polypropylenrør og inkuberet på is i 30 minutter, forsigtigt hvirvlende hver 5 min. For en god bibliotek dækning, skal du bruge 4-6 rør af kompetente celler.
BEMÆRK: Mere end 100 ng DNA falder transformationseffektivitet - Nedsænk røret i et vandbad ved 42 ° C i et varmechok på 45 sek, og der inkuberes på is i 2 min. Dernæst tilsættes 1 ml SOC-medium (2,0% trypton, 0,5% gærekstrakt, 0,05% NaCI, 10 mM MgCI2, 10 mM MgSO4 og 0,4% D-glucose). Inkuber røret ved 37 ° C under omrystning ved 225-250 rpm i 90 min.
- Plate celler fra hvert rør på fire 10 cm LB-agarplader indeholdende 100 ug / ml ampicillin. Pladerne inkuberes i 16-24 timer ved 37 ° C.
- Efter synlige kolonier, samle dem ved at skrabe pladerne med en steril plade skraber. Pool celler fra hver plade og isolere plasmid-DNA ved hjælp af et kommercielt plasmid ekstraktionskit.
BEMÆRK: Normalt kolonier er mindre og tage 18-24 timer at væresynlige, fordi disse er langsomtvoksende bakteriestammer. På dette stadium, vurdere heterogenitet af mutationer i biblioteket ved restriktionsfordøjelse med en hyppig cutter såsom Sau3A1 eller Taq1 eller sekventering.
3.2) Produktion af Retrovirale Supernatanter og transduktion
- En dag før transfektion plade 4 x 10 6 HEK 293T celler på 100 cm skåle i DMEM indeholdende 10% FCS, penicillin / streptomycin og 2 mM L-glutamin.
- Næste dag, udskifte mediet og transficere cellerne med mutageniseret pMSCV-JAK2-V617F bibliotek. For hver 10 cm plade, blande 10 ug DNA (5 ug af plasmidet bibliotek og 5 ug retroviral pakkende plasmid, pCLEco) med 40 pi FuGENE til et totalt volumen på 400 pi hjælp serumfrit DMEM medier. Inkubér DNA'et og lipid mix for 20 minutter ved stuetemperatur. Efter 20 min tilsættes DNA-lipid-kompleks dråbevis oven på HEK293T celler.
- Efter seks timer, ændre transfektion medier wi'te frisk medium og inkuberes pladerne i 48 timer ved 37 ° C for virusproduktion. Efter 48 timers inkubation, indsamle virale supernatanter filtreres gennem et 0,45 um Acrodisc filter.
3.3) Valg af resistente kloner in vitro
- For lægemiddelresistente JAK2-V617F mutanter, transducere 100 millioner BAF3 celle med 100 ml virus supernatanter med en viral titer på 0,5-1 x10 6. Mere specifikt blandes 10 8 celler med 100 ml virus supernatant til et samlet volumen på 300 ml under anvendelse af RPMI-medium indeholdende 10% serum og 24 pg / ml polyberene (slutkoncentration af ployberene er 8 ug / ml). Fordel disse celle mixere i multiple seks brønde (4-5 ml pr godt).
- Centrifugeres pladerne ved 1.250 xg i 90 minutter ved 25 ° C. Efter centrifugering inkuberes pladerne ved 37 ° C i 24 timer.
- Næste dag, samle cellerne sammen og blandes med Ruxolitinib og medium indeholdende blød agar og udpladet i six brøndsplader. For hver medikamentkoncentration, blandes 10 ml af transducerede BaF3-celler (10-20 million celler) med den passende mængde af Ruxolitinib i et 50 ml rør. Der fyldes op til 40 ml med RPMI indeholdende 20% serum. Der tilsættes 10 ml 1,2% agar til cellerne, mixcarefully og plade i seks brønde.
- Pladerne inkuberes ved 37 ° C i to uger. Vælg de resistente kolonier ved hjælp af 0,2 ml pipette tips og subkultur dem individuelt i 24 brønds plader i 3-4 dage.
- Høst de resistente BaF3 cellerne ved centrifugering ved 450 xg i fem minutter ved stuetemperatur. Isoler det genomiske DNA under anvendelse af et kommercielt genomisk DNA isolation kit. PCR forstærke fuld længde JAK2 cDNA fra 100 ng af genomisk DNA ved hjælp af primere (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG og mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) og lang skabelon udvide High Fidelity PCR-systemer.
- Adskil PCR-produkterne ved agarosegelelektroforese. Udskære 3,4 kb DNA-båndet repræsenterer JAK2 kodende ramme og isolere DNAanvendelse af et kommercielt gelekstraktionskit. Sekvensen i fuld længde af cDNA under anvendelse af 8 interne primere (P1 - P8) spænder den kodende sekvens og analysere sekvenserne under anvendelse af kommerciel software.
4. In vitro Validering af resistente mutationer
Mange cellekloner bære mere end én mutation, at teste bidraget fra hver mutation i resistens fænotype, generere udvalgte varianter ved site-directed mutagenese hjælp pMSCV-JAK2V-617F plasmid som skabelon.
- Udfør mutagenese på pMSCV-JAK2-V617F plasmid anvendelse af et kommercielt mutagenese kit og oligonukleotider designet til at skabe punktmutationer. Bekræft identitet mutant kloner ved sekventering.
- Transducere BaF3-celler med retrovira fremstillet ved anvendelse af mutant-plasmider efterfulgt med selektion under anvendelse af puromycin på 1 pg / ml.
- Pladen 10 4 BAF3-JAK2-V617F celler (50 pi RPMI med 10% FCS) i hver brønd i en plade med 96 brønde. Separatly tilsættes 50 pi af ruxolitinib holdige medier til brøndene i hele pladen (slutkoncentration: 0, 1, 3, 5, 10 og 20 uM), og inkuberes pladerne i 60 timer ved 37 ° C.
- Vurdere cellernes levedygtighed ved tilsætning af 10 pi WST-1 reagens til hver brønd efterfulgt med inkubation ved 37 ° C i 2-4 timer. Optag absorbans ved A450 ved anvendelse af en pladelæser. Udfør alle analyser i tre eksemplarer og plot gennemsnit absorbansen mod INCB018424 koncentrationer. Udfør en best-fit sigmoidal kurve ved hjælp af en ikke-lineær kurvetilpasning algoritme. Score medikamentkoncentrationen resulterer i 50% cellelevedygtighed som den cellulære IC50.
- Dernæst plade seks millioner BAF3 celler, der udtrykker JAK2 varianter i seks brøndsplader i RPMI-medium indeholdende 10% serum med stigende koncentrationer af ruxolitinib og inkuberet i 4-6 timer ved 37 ° C.
- Indsamle cellerne ved centrifugering ved 450 xg i fem minutter ved 4 ° C. Vask cellerne én gang med PBS og lyseres i 20 mM Tris-CI (pH 7,5), 50mM NaCI, 1% NP-40, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM natriumfluorid, 2 mM natriumvanadat og 5% glycerol suppleret med protease inhibitor cocktail og phosphataseinhibitorer. Soniker cellesuspension i 1 min efterfulgt af tilsætning af 5x gel loading buffer (350 mM Tris-HCI [pH 6,8], 500 mM DTT, 15% SDS, 10 mM benzamidin, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM natriumvanadat , Protease cocktail, 50% glycerol og 0,001% bromphenolblåt) og denaturering ved 70 ° C i 5-10 min.
- Løse proteinerne på en 8% SDS-polyacrylamidgel under denaturerende betingelser. Udfør immunoblotting med muse-monoklonalt anti-phopsho STAT5. Strip blottene og genprobet med et kanin polyklonalt anti-SATA5 antistof. Visualiser båndene anvendelse af ECL reagenser efter leverandørens anbefaling.
5. In vivo Validering
- Transducere BaF3-celler, der udtrykker luciferase og kirsebær (transduceret med retrovirus fremstillet pMSCV-Luc-cherry GW) med virus, der udtrykker JAK2-V617F og resistente varianter. Vælg celler, der overlever puromycinselektion til ekspression af JAK2 og dets modstand varianter.
- Injicer to millioner aktivt voksende BAF3-Luc / kirsebær celler, der bærer JAK2-V617F og dens resistente varianter i 200 pi PBS i 6 Balb / c-mus via hale-vene injektion.
- Efter tre dages celletransplantationer, injicere mus med Ruxolitinib (100 mg / kg) to gange dagligt i to uger.
- Udfør luciferase-baserede bioluminescence billeddannelse med et billedbehandlingssystem. .
- Kort sagt, forberede luciferin løsning ved at opløse 300 mg til 25 ml sterilt deioniseret vand, portion i mindre mængder og butik.
BEMÆRK: Opbevar luciferin ved -80 ° C og beskyttet mod lys indtil brug. - Injicer 250 pi til hver mus ved IP at opnå 125 mg / kg i hver mus. Bedøver musene fra samme gruppe sammen ved hjælp af inhaleret isofluran (1,5% -2.0%) i en forseglet kasse. Påfør dyrlæge salve på the øje at forhindre tørhed.
BEMÆRK: Den tid, mus til at sove (10-15 min) gav luciferin aktivitet top. Hold gang i overensstemmelse mellem grupperne for at undgå variation.
- Kort sagt, forberede luciferin løsning ved at opløse 300 mg til 25 ml sterilt deioniseret vand, portion i mindre mængder og butik.
- Overfør musene straks afbildningskammeret fase og opretholde anæstesi på 1,5-2% isofluoran under billeddannende procedurer. Billede mus med sekventiel 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60 og 300 sek eksponering. Fange billeder og kvantificere bioluminescence intensitet ved hjælp af erhvervelse image og analysesoftware. Efter billeddannelse returnere mus tilbage til sit bur.
- For, in vivo kimærisme høst totale knoglemarvsceller. Aflive mus med CO 2 i 5 minutter efterfulgt med cervikal dislokation. Høst knoglerne og knuse i 4 ml kold PBS til at indsamle knoglemarven. Analyser procent kirsebær positive celler under fluorescensmikroskop og kvantificere anvendelse af FACS. Saml tyve tusind hændelser fra hver prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fremkomsten af genetiske mutationer udgør stor udfordring for den målrettede anti kinase terapi. Mutations undersøgelser, foruden at give mekanistiske og funktionelle indsigter, der er medvirkende til udvælgelse og design af næste generation af lægemiddeludvikling, også giver en bedre klinisk ledelse og kan i fremtiden være mere nyttigt for personlig behandling. I dette forsøg viser vi screening for ruxolitinib resistens mutationer i JAK2-V617F kinase (Figur 1). Vi konstruerede pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway vektoren ved at indføre fuld længde muse JAK2-V617FcDNA i pMSCV-Cherry-GW. Det anbefales at anvende bakteriel vært (XL-1 rød stamme af E. coli) at udvikle tilfældige mutationer over mest populære valg af metode, som er PCR, på grund af dets begrænsninger forbundet med sekvens bias og større genfragmenter er vanskelige at opformere . Tilfældigt mutageniseret DNA-bibliotek blev transficeret til HEK293T celler til retrovirus produktion. Disse mutant viranvendelser blev anvendt til at transducere BaF3-celler, som blev udvalgt til kolonivækst i blød agar i fravær af IL-3 med enten 1 eller 5 uM Ruxolitinib. Under disse betingelser opstår kolonier kun fra celler, der bærer JAK2V-617F cDNA'er, der udtrykker funktionelle og resistent variant af kinasen. Efter 10-14 dage blev godt adskilte individuelle kolonier plukkes, som varierede i størrelse, og udvidet dem i flydende kultur. Genomisk DNA blev isoleret fra disse celler. Den provirus blev udvundet ved direkte rednings- eller ved PCR. De udvundne provirus blev sekventeret for at identificere mutationer (figur 1). Sekvensanalyser blev udført ved anvendelse af DNASTAR pakke af Lasergene.
Fordi mange cellekloner gennemført mere end en mutation, anbefaler vi kraftigt at validere disse mutationer i isolation fra både in vitro og in vivo-assays (figur 2 og 3). For at bekræfte aktiviteten af varianter i isolation,udvalgte varianter blev genereret ved stedorienteret mutagenese af JAK2V-617F sekvens. Disse varianter blev genindført i BaF3 celler, og målt for celleproliferation evne på forskellig dosering af Ruxolitinib at evaluere IC50 (IC50-værdier, figur 2A). Biokemiske analyser udføres for phosphotyrosin eller phospho-STAT5 ved immunoblotanalyse på proteinlysater af BaF3 celler, som blev inkuberet med stigende doser af Ruxolitinib at udelukke enhver forbi mål medieret modstand (figur 2B). Mutanter udviser forbedrede IC50 værdier og vedvarende autophosphorylering ved højere Ruxolitinib koncentrationer er således bekræftet at være resistente varianter. Fordi mange resistente mutationer viser dosis-respons variable, er det derfor bydende nødvendigt at teste, om disse mutationer vil give in vivo resistens samt. Normalt anbefaler vi at teste kun 2 -3 forskellige varianter til in vivo eksperimenter, som de er dyre ogarbejdskrævende. For at validere in vivo modstand blev BaF3 celler manipuleret til at udtrykke JAK2-V617F varianter og Luciferase / kirsebær for at aktivere in vivo sporing. Mus blev injiceret med 1-2 millioner cherry positive celler (som udtrykker JAK2 varianter og luciferase), efterfulgt af Ruxolitinib injektion i to uger. Efter to uger blev musene afbildet for luciferase katalyseret bioluminescens (figur 3), og også for BAF3 kimærisme i knoglemarven og perifert blod ved måling af fluorescensen af kirsebær-positive celler (figur 3). Mus, der udtrykker JAK2-V617F er følsomme over for Ruxolitinib, mens resistente varianter viser progressiv stigning i bioluminescens perioden af behandlinger, hvilket antyder, at BaF3-celler, der udtrykker JAK2-V617F variant er resistent over for Ruxolitinib behandling in vivo.
Figur 2:. En ordning, der viser in vitro validering med dosisafhængige celleproliferationsassays (A) og western blotting (B) Klik her for at se en større udgave af dette tal. 
Figur 3: En skematisk repræsentation af in vivo validering med luciferase katalyseret bioluminescens måling. Klik her for at se et størreversion af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 micron disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E. coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |
References
- Huse, M., Kuriyan, J.
- Melnikova, I., Golden, J.
- Cohen, P. Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).
- Dancey, J., Sausville, E. A. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).
- Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure. Science. 303, 1800-1805 (2004).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med. 2, 561-566 (1996).
- Gorre, M. E., et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science. 293, 876-880 (2001).
- Shah, N. P., et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).
- Branford, S., et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood. 99, 3472-3475 (2002).
- Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell. 112, 831-843 (2003).
- Azam, M., et al. Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).
- Azam, M., et al. AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance. Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).
- Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine. Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).
- Soverini, S., et al. Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia. Leukemia research. 38, 10-20 (2014).
- Deshpande, A., et al. Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 26, 708-715 (2012).
- Koppikar, P., et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy. Nature. 489, 155-159 (2012).
- Marit, M. R., et al. Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor. PLoS One. 7, 43437 (2012).
- Weigert, O., et al. Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition. The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).
- Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503. Blood cancer journal. 3, 138 (2013).
