Summary
Появление генетической устойчивостью против ингибитора киназы терапии представляет серьезную проблему для эффективной терапии рака. Определение и характеристика мутаций устойчивости против недавно разработанного препарата способствует лучшему клинического лечения и следующего поколения дизайна лекарств. Здесь мы описываем наш протокол для скрининга и подтверждения устойчивых мутаций в пробирке.
Abstract
Открытие BCR / ABL как онкоген драйвера в хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) привело к разработке иматиниба, который, по сути, продемонстрировали потенциал ориентации киназы в раковых путем эффективного лечения больных ХМЛ. Это наблюдение революцию разработки лекарственных средств целевой онкогенных киназ, вовлеченных в различных других злокачественных опухолей, таких как, EGFR, B-RAF, KIT и PDGFRs. Тем не менее, один главный недостаток анти-киназы терапии является появление лекарственной устойчивости мутаций, оказывающих цель уменьшили или потеряли сродство к препарату. Понимание механизмов, занятых устойчивыми вариантов не только помогает в разработке ингибиторов нового поколения, но и дает толчок к клиническому ведению помощью персонализированной медицины. Мы сообщили ретровирусной стратегия скрининга для выявления спектра сопротивления, придающего мутации в BCR / ABL, который помог в разработке следующего поколения BCR / ABL ингибиторов. Использование Ruxolitinib и JAK2 в качестве целевой препарат пары, здесь мы опишем в пробирке методов скрининга, который использует мышь BAF3 клетки, экспрессирующие случайные мутации библиотеку JAK2 киназы.
Introduction
Протеинкиназы ключевых регуляторных ферментов внутриклеточных путей передачи сигналов, которые, казалось бы, модулируют каждый клеточной функции. Надлежащий контроль за киназный сигнализации имеет решающее значение для гомеостаза и развития, которые в основном опирается на надлежащее регулирование киназ, фосфатаз и его деградации по UPS (системы протеасома убикитина). Дерегулированных киназы находятся в центре внимания многих видов рака и участвуют в принимающих заболеваний человека 1. Геном человека кодирует более чем 500 протеинкиназы, которые были связаны, прямо или косвенно, ~ 400 заболеваний человека 2. Эти наблюдения поддерживают концепцию терапевтического нацеливания киназ по низкомолекулярные ингибиторы 3-5.
Демонстрация ABL ингибиторов киназы, такие как иматиниба, в лечении хронического миелолейкоза (ХМЛ) при условии, что доказательство концепции для этого подхода 6,7. Это наблюдение не только революцию в муравьяя-киназы терапия, но и в жизнь идею, чтобы определить генетические повреждения в других опухолевых заболеваний для терапевтического нацеливания, которые приводят к открытию онкогенных мутаций в JAK2 от истинной полицитемии (PV) и у пациентов с миелопролиферативных опухолей (MPN). Это открытие вызвало большой интерес в лечении MPNs путем охвата JAK2 с низкомолекулярных ингибиторов киназ. Теперь, почти десяток ингибиторов JAK2 в клинических испытаниях, и один из них был утвержден в последнее время для лечения миелофиброзом. В то время как специфическое нацеливание онкогенных киназ путем низкомолекулярные ингибиторы в раковых привести перспективный результат, он также страдает от развития резистентности к лечению. В самом деле, до сих пор, у пациентов, получавших ингибиторы киназы, такие как иматиниба, Gefitinib, Erlotinib и Dasatinib разработанные мутаций устойчивости в основном за счет приобретения мутаций в домене киназы, в которой лекарственных препаратов 8-10. Сопротивление в результате мутации гена подчеркивает ограничения уплотнительныеF направлена против монотерапии онкогенных киназ, и представляет собой следующий вызов в развитии все более успешной химиотерапии рака. Механистические и функциональные последствия лекарственной устойчивости должны обеспечить обоснование для выбора и проектирования бесплатные соединений для разработки лекарственных препаратов. Мутации, идентифицированные с помощью экранов в пробирке, показали высокую степень корреляции с тем, у больных. Таким образом, скрининг в пробирке для мутаций, которые придают лекарственную устойчивость для данного препарата целевых пар в клинических или доклинических способствует развитию в определении моделей устойчивости, которые могут привести к клинической рецидив. Идентификация этих мутантных форм не только полезно для мониторинга пациентов для ответа наркотиков и рецидивов, но также имеет важное значение для разработки более надежных ингибиторов следующего поколения. Например, развитие следующего поколения ингибиторов BCR / ABL, Nilotinib и Ponatinib, стало возможным из-за большей тесhanistic понимание получил от мутагенеза, структурных и функциональных исследований.
Ранее мы уже сообщали результаты нашего экрана с помощью случайного мутагенеза в BCR / ABL, чтобы выявить спектр мутаций, придающих устойчивость к ингибиторам, таких как иматиниба 11,12, PD166326 12, и AP24163 13. Результаты не только определили мутации, придающие клинической резистентности и болезни рецидив, но и при условии, что механическое понимание лекарственной устойчивости и принципов, регулирующих функцию киназы 11,14. Здесь мы предлагаем дополнительную методическую деталь, с помощью Ruxolitinib и JAK2 в качестве целевого пары наркотиков, с тем чтобы более широкое применение этой стратегии скрининга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры в этом протоколе были проведены в соответствии с Национальным институтом руководящих принципов здравоохранения для этического обращения и ухода за животными, и в соответствии с утвержденным IACUC использования животных протокола.
1. Клеточная линия Обслуживание
- Культура клеток BaF3 в среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и пенициллин / стрептомицин (100 единиц / мл и 100 мкг / мл) и отработавшего культуральной среды из WEHI клеток. Выращивают клетки HEK293T в DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и пенициллин / стрептомицин (100 единиц / мл и 100 мкг / мл). Поддержание клеток при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2.
2. плазмиды Строительство
- Клонирование мышь JAK2 и его онкогенные изоформы JAK2-V617F в pMSCV-Puro-GW Л.Р. Clonase, используя стандартную процедуру рекомбинации клонирования.
- Для строительства выражения люциферазы вектора (pMSCV-Люк-Cherry-GW), используемый в в-VIизображения во, усилить люциферазы из pLVX-Tet-ON вектора методом ПЦР с использованием праймеров (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG и LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC), а затем с клонированием в pENTR-SD-ТОРО для создания pENTR-Люк, который используется передать ген люциферазы в ретровирусный вектор, pMSCV-Cherry-ГВт рекомбинации, опосредованной клонирования с использованием LR Clonase.
3. Подготовка случайной мутации библиотеки, скрининг и определение мутаций
3.1) случайного мутагенеза
- Clone полная длина JAK2 дикого типа и мутации V617F в pMSCV-Puro-GW ретровирусного вектора с использованием коммерческого технологии рекомбинации клонирования.
- Используйте 1 мкг JAK2-V617F плазмидной ДНК для преобразования, XL-1 красный, E. палочки клетки, которая повреждена в механизмах репарации ДНК, таким образом, позволяя им включать случайные мутации при репликации. Более конкретно, смешать 50 - 100 нг ДНК (более 100 нг ДНК снижает эффективность преобразования) с 100 мкл компетентных клеток в предварительно охлажденный полипропиленовую пробирку и инкубировали на льду в течение 30 мин, осторожно закрученного каждые 5 мин. Для хорошего освещения библиотеки, используйте 5:56 трубы компетентных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более 100 нг ДНК снижает эффективность преобразования - Погрузить трубку в водяной бане при 42 ° С в течение теплового шока 45 сек и инкубировать на льду в течение 2 мин. Далее, добавляют 1 мл SOC среды (2,0% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,05% NaCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4 и 0,4% D-глюкозы). Инкубируйте пробирку при 37 ° С при встряхивании при 225-250 оборотов в минуту в течение 90 мин.
- Пластина клеток из каждой пробирки на четыре 10 см LB-чашках с агаром, содержащих 100 мкг / мл ампициллина. Инкубируйте пластин в течение 16 - 24 ч при 37 ° С.
- После видимых колоний, собрать их, очищая пластины с стерильной пластины скребком. Бассейн клетки из каждой пластины и выделения плазмидной ДНК с использованием набора коммерческой добычи плазмиды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно колонии меньше и принимать 18-24 ч, чтобы бытьвидно, потому что это медленно растущие штаммы бактерий. На этом этапе, оценить неоднородность мутаций в библиотеке рестрикционным расщеплением с частыми фрезы, таких как Sau3A1 или Taq1 или секвенирования.
3.2) производство Ретровирусные супернатантах и трансдукции
- За день до трансфекции, плиты 4 х 10 6 НЕК 293Т клеток на 100 см блюд в DMEM, содержащей 10% FCS, пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина.
- На следующий день, замените носитель и трансфекции клеток с мутагенизированного библиотеки pMSCV-JAK2-V617F. Для каждого 10 см пластины, смешать 10 мкг ДНК (5 мкг плазмидной библиотеки и 5 мкг ретровирусной плазмиды упаковки, pCLEco) с 40 мкл FuGENE до общего объема 400 мкл с использованием DMEM свободный носитель в сыворотке. Инкубируйте ДНК и липида смесь в течение 20 мин при комнатной температуре. Через 20 мин добавить ДНК-липидный комплекс по каплям в верхней части HEK293T клеток.
- После шести часов, изменить трансфекции Форма WIth свежие носитель и инкубируют планшеты в течение 48 ч при 37 ° С для производства вирусов. После 48 ч инкубации, собирают вирусные супернатанты фильтровали через 0,45 мкм фильтр Acrodisc.
3.3) отбор устойчивых клонов в пробирке
- Для лекарственно-устойчивых мутантов JAK2-V617F, преобразовывать 100000000 BAF3 ячейку с 100 мл вирусных супернатантами, имеющих титр вируса 0,5-1 x10 6. Более конкретно, смешать 10 8 клеток 100 мл вируса супернатант до общего объема 300 мл с использованием RPMI массовой информации, содержащей 10% сыворотки и 24 мкг / мл polyberene (конечная концентрация ployberene 8 мкг / мл). Распределите эти клеточные смесители в нескольких шесть-луночных планшетах (4-5 мл на лунку).
- Центрифуга пластины при 1250 х г в течение 90 мин при 25 ° С. После центрифугирования, инкубировать пластин при 37 ° С в течение 24 ч.
- На следующий день, бассейн клетки вместе и смешать с Ruxolitinib и среда, содержащая мягкую агар и высевают в сих луночных планшетах. Для каждой концентрации лекарственного средства, смешать 10 мл трансдуцированных клеток BAF3 (10-20 миллионов клеток) с соответствующим количеством Ruxolitinib в 50 мл пробирку. Макияж объем до 40 мл, используя RPMI, содержащей 20% сыворотки. Добавить 10 мл 1,2% агара к клеткам, mixcarefully и пластины в шесть-луночных планшетах.
- Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение двух недель. Выберите резистентных колоний, используя 0,2 мл наконечников и суб-культуры их по отдельности в 24-луночных планшетах в течение 3-4 дней.
- Урожай устойчивых BAF3 клетки центрифугированием при 450 х г в течение пяти минут при комнатной температуре. Изолируйте геномной ДНК с использованием коммерческого набора геномной ДНК изоляции. ПЦР-амплификации полной длины JAK2 кДНК из 100 нг геномной ДНК с использованием праймеров (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG и mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) и долгосрочной шаблона расширения системы ПЦР с высокой точностью.
- Отдельные продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле. Акцизный 3,4 кб ДНК-полосу, представляющих JAK2 кадра кодирования и выделения ДНКс использованием набора коммерческой добычи гель. Последовательность полной длины кДНК, используя 8 внутренних праймеров (Р1 - P8), охватывающих кодирующую последовательность и проанализировать последовательности с использованием коммерческого программного обеспечения.
4. In Vitro Проверка мутаций устойчивости
Многие клеточные клоны нести более одного мутацию, чтобы проверить вклад каждого мутации в фенотип устойчивости, генерировать выбранные варианты путем сайт-направленного мутагенеза с использованием pMSCV-JAK2V-617F плазмиды в качестве матрицы.
- Выполнение сайт-направленный мутагенез на pMSCV-JAK2-V617F плазмиды с использованием коммерческого набора мутагенеза и олигонуклеотиды, предназначенные для создания точечных мутаций. Подтвердите личности мутантных клонов с помощью секвенирования.
- Преобразовывать клетки BaF3 с ретровирусов с использованием мутантных плазмид следуют с выделение с помощью пуромицина на 1 мкг / мл.
- Пластина 10 4-BAF3 JAK2-V617F клетки (50 мкл RPMI с 10% FCS) в каждую лунку 96-луночного планшета. Отдельныйлы добавить 50 мкл ruxolitinib средах в лунки по всей пластине (конечная концентрация: 0, 1, 3, 5, 10, и 20 мкМ), и инкубируют планшеты в течение 60 ч при 37 ° С.
- Оценка жизнеспособности клеток путем добавления 10 мкл WST-1 реагента в каждую лунку с последующим инкубированием с при 37 ° С в течение 2-4 ч. Запись плотность при A450, используя планшет-ридер. Выполните все анализы в трех экземплярах и земельный участок в среднем поглощение против концентрации INCB018424. Выполните наиболее подходящее сигмовидной кривой с использованием нелинейной кривой алгоритм подбора. Оценка концентрации лекарственного средства в результате 50% жизнеспособность клеток как сотовые IC50.
- Далее, пластина шесть миллионов BAF3 клетки, экспрессирующие варианты JAK2 в шесть-луночных планшетах в среде RPMI среде, содержащей 10% сыворотки с увеличением концентраций ruxolitinib и инкубировали в течение 4-6 ч при 37 ° С.
- Собирают клетки центрифугированием при 450 х г в течение пяти минут при 4 ° С. Промыть клетки один раз с PBS, и лизирующим раствором 20 мМ Трис-Cl (рН 7,5), 50мМ NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 1 мМ фторида натри, 2 мМ натрий Vanadate и 5% глицерина с добавлением ингибитора протеазы коктейль ингибиторов и фосфатазы. Разрушать ультразвуком суспензии клеток в течение 1 мин с последующим добавлением 5-кратного буфера для нанесения геля (350 мМ Трис-HCl [pH 6,8], 500 мМ ДТТ, 15% SDS, 10 мМ бензамидина, 5 мМ ЭДТА, 5 мМ EGTA, 5 мМ натрий Vanadate , протеазы коктейль, 50% глицерина, и 0,001% бромфенолового синего) и денатурация при 70 ° С в течение 5-10 мин.
- Решить белки на 8% SDS полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Выполните иммуноблоттинга с мышиными моноклональными анти-phopsho STAT5. Газа кляксы и зондировали с кроликом поликлональных анти-SATA5 антитела. Визуализация диапазонах ECL реагентов в соответствии с рекомендациями поставщика.
5. В Vivo Проверка
- Преобразовывать BAF3 клеток, экспрессирующих люциферазы и вишня (трансдуцировали ретровирусов, изготовленных из pMSCV-Люк-Cherры GW) с вирусами, выражающих JAK2-V617F и устойчивые варианты. Выбор клетки, которые выживают выбор пуромицин для выражения JAK2 и его вариантов сопротивления.
- Вводите два миллиона активно растущие BAF3-Люк / черри клетки, несущие JAK2-V617F и его устойчивые варианты в 200 мкл PBS до 6 Balb / C мышей в хвостовую вену.
- После трех дней клеточных трансплантаций, инъекции мышей с Ruxolitinib (100 мг / кг) два раза в день в течение двух недель.
- Выполнение люциферазы на основе биолюминесценции изображений с системой формирования изображения. ,
- Вкратце, подготовка люциферин раствор путем растворения 300 мг в 25 мл стерильной деионизированной воды, аликвоту в меньших объемах и магазина.
Примечание: магазин люциферин при -80 ° С и не защищают от света до использования. - Вводите 250 мкл каждой мыши по IP для достижения 125 мг / кг в каждой мыши. Обезболить мышей от той же группы вместе с использованием ингаляционных изофлуран (1,5% -2,0%) в запечатанной коробке. Применить ветеринар мазь на ме глаза, чтобы предотвратить сухость.
ПРИМЕЧАНИЕ: время, необходимое для мышей спать (10-15 мин) позволил люциферина деятельность в пике. Держите время в соответствии между группами, чтобы избежать изменения.
- Вкратце, подготовка люциферин раствор путем растворения 300 мг в 25 мл стерильной деионизированной воды, аликвоту в меньших объемах и магазина.
- Немедленно передать мышей изображений камерной сцене и поддержания анестезии в 1,5-2% изофлуораном во время процедур визуализации. Мыши изображение с последовательным 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60, и 300 воздействия сек. Захват изображений и количественной оценки интенсивности биолюминесценции с помощью захвата изображения и программное обеспечение для анализа. После визуализации вернуть мышей обратно в клетку.
- Ибо, в естественных условиях сбора урожая химеризм общего bonemarrow клеток. Эвтаназии мышей с CO 2 в течение 5 мин, затем с цервикальной дислокации. Урожай кости и сокрушить в 4 мл холодного PBS, чтобы собрать костный мозг. Проанализируйте процентов вишни положительные клетки под флуоресцентным микроскопом и количественно, используя FACS. Соберите двадцать тысяч событий из каждого образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Появление генетических мутаций представляет большую проблему для целевой анти-киназы терапии. Мутационные исследования, помимо предоставления механистической и функциональные идеи, которые играют важную роль в выборе и проектировании разработки следующего поколения наркотиков, а также позволяет лучше клинического ведения больных и в будущем может быть более полезным для персонализированной терапии. В этом эксперименте мы покажем, скрининг на ruxolitinib мутаций резистентности в JAK2-V617F киназы (рисунок 1). Мы построили pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway вектор путем введения полнометражный мыши JAK2-V617FcDNA в pMSCV-вишневый-GW. Рекомендуется использовать бактериального хозяина (XL-1 красный штамма E.coli) развивать случайных мутаций на наиболее популярных выбора метода, который ПЦР, из-за его ограничений, связанных с последовательностью смещения и больше генных фрагментов трудно амплификации , Случайным образом мутации библиотеки ДНК трансфицировали в клетки HEK293T для производства ретровирусов. Эти мутантные вирони использовались, были использованы для, трансдукции клеток BaF3, которые были выбраны для роста колоний в мягком агаре в отсутствие IL-3 или с 1 или 5 мкМ Ruxolitinib. В этих условиях, колонии возникают только из клеток, несущих JAK2V-617F кДНК, который выражает функциональный и устойчивый вариант киназы. После 10 - 14 дней, хорошо разделенные отдельные колонии собирали, которые различались по размеру, а также расширить их в жидкой культуры. Геномную ДНК выделяли из этих клеток. Провируса извлекали путем прямого восстановления или с помощью ПЦР. Восстановленные провирусы были упорядочены для идентификации мутаций (рисунок 1). Последовательность анализа проводили с помощью DNAstar пакет Lasergene.
Потому что многие клеточные клоны повезло больше, чем одну мутацию, мы настоятельно рекомендуем в подтверждение этих мутаций в изоляции от как в пробирке и в естественных анализов (рис 2 и 3). Чтобы проверить активность вариантов в изоляции,Выбранные варианты были сгенерированные с помощью сайт-направленного мутагенеза последовательности JAK2V-617F. Эти варианты были вновь внесены в BAF3 клеток, и измеряют способность клеточной пролиферации при различных дозе Ruxolitinib чтобы оценить IC50 (IC50 значения, рис 2а). Биохимические анализы проводили в течение фосфотирозина или фосфо-STAT5 путем иммуноблот-анализа на белок лизатов клеток, которые BAF3 инкубировали с возрастающими дозами Ruxolitinib, чтобы исключить любую мимо ворот, опосредованного сопротивление (фиг.2В). Мутанты, обладающие улучшенными значения IC50 и постоянный аутофосфорилирование при более высоких концентрациях Ruxolitinib, таким образом, подтверждено, что лекарственной устойчивостью варианты. Потому что многие устойчивые мутации показать переменная отклика дозы, поэтому важно, чтобы проверить, являются ли эти мутации совещаться в естественных условиях сопротивления, а также. Как правило, мы рекомендуем проверить только 2 -3 различные варианты для проведения экспериментов в естественных условиях, так как они являются дорогостоящими итрудоемким. Для проверки сопротивления в естественных условиях, BAF3 клетки, сконструированные для экспрессии вариантов JAK2-V617F и Luciferase / вишня чтобы иметь возможность отслеживать в естественных условиях. Мышам вводили 1-2 миллионов черри-положительных клеток, экспрессирующих варианты (JAK2 и люциферазы), с последующим Ruxolitinib инъекции в течение двух недель. После двух недель, мыши были обследованы люциферазы катализируемой биолюминесценции (рис 3), а также для BAF3 химеризма в bonemarrow и периферической крови путем измерения флуоресценции черри-позитивных клеток (рис 3). Мыши, экспрессирующие JAK2-V617F чувствительны к Ruxolitinib, в то время как устойчивые варианты показать прогрессивный прирост биолюминесценции в течение срока лечения, таким образом, предполагая, что BAF3 клетки, экспрессирующие JAK2-V617F вариант является устойчивым к лечению Ruxolitinib в естественных условиях.
Рисунок 2:. Схема, показывающая в проверке пробирке с использованием в зависимости от дозы анализов клеточной пролиферации (А) и вестерн-блоттинга (B) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры. 
Рисунок 3: схематическое изображение в естественных проверки с использованием люциферазы катализируемой измерения биолюминесценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большеверсия этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Клинический успех иматиниба в лечении ХМЛ продемонстрировали не только потенциал таргетинга румяна киназы по низкомолекулярные ингибиторы, но и раскрыли ограничения таргетной терапии: клиническое рецидива и появления мутаций лекарственной устойчивости в гене-мишени. Идентификация мутаций резистентности способствует лучшему клинического ведения и разработки ингибиторов следующего поколения. Этот протокол описывает методологию выявления лекарственно-устойчивых мутаций в гена-мишени. Этот метод использует случайно мутагенеза плазмиды библиотека, созданная в E. палочка, чтобы выразить мутантные белки. Затем эту библиотеку введены в BAF3 клеток (чувствительных к трансформации путем онкогена), а затем с отбора клеточных клонов в присутствии химиотерапевтических агентов. Секвенирование гена-мишени из устойчивых клонов определяет мутации, придающие устойчивость. Наконец, выявленные мутации, воссозданные по сайту направленного мутагенеза для проверки ихлекарственная устойчивость.
Используя эту стратегию, мы определили спектр мутаций в JAK2 и BCR / ABL, придающих устойчивость к Ruxolitinib и иматиниба соответственно. Мы определили более ста мутации в BCR / ABL. Кроме того, определение всех основных мутаций, обнаруженных у пациентов, наш метод скрининга позволил нам идентифицировать новые замены остатков как внутри, так и за ее пределами домена киназы. Интересно, что все мутации из нашего экране были выявлены в образцах пациентов, но этот процесс занял чуть ли не больше, чем 10 лет 15, что свидетельствует о способности этого экрана, чтобы предвидеть мутации, которые будут представлять клинически проблематичный лекарственной устойчивости. В то время как устойчивые скрининга с использованием случайного мутагенеза дает много преимуществ по сравнению с другими методами, существуют потенциальные ловушки, чтобы быть в курсе, когда после процедуры отбора. Для любого скрининга, настоятельно рекомендуется для BAF3 клеток, чтобы быть полностью зависит от цели, против которых RESIпозиция ищется. Отказ или частичный зависимость от гена-мишени не может развиваться истинные устойчивых клонов и, скорее всего развивать ложных срабатываний. Например, четыре различные исследования выполнены устойчивый скрининг к ингибиторам JAK2 с использованием клеток BaF3 трансдуцированные либо EPO или MPL рецепторов для облегчения JAK2-V617F зависимость 16-19. Только восемь устойчивые мутации ограничиваются киназы домен, были выявлены на этих экранах, хотя многочисленные устойчивые клоны развиты, что не хватало мутации, по-видимому из-за появления ложных срабатываний, которые были приписаны гетеродимеризации JAK1 и JAK3 с рецепторами цитокинов. Поэтому, чтобы избежать потери JAK2 зависимости мы провели устойчивый скрининг в простой BAF3, который показал надежную селекцию резистентных клонов против Ruxolitinib и все из этих клонов показал присутствие устойчивых мутаций. Основываясь на этих наблюдениях, для того, чтобы использовать весь спектр мутаций устойчивости, мы рекомендуем клеток BaF3с должно быть полностью зависит от целевого киназы, чтобы избежать появления ложных срабатываний, как это было нормой в предыдущих устойчивых фильмов, выполненных к ингибиторам JAK2 16,17. Кроме того, очень важно, чтобы избежать массовых условий культивирования, при котором клетки, несущие различные мутации объединяют вместе и позволило расширить в жидкой культуре, так как это может привести к клонального доминирования немногих наиболее устойчивых к лекарствам вариантов. Например, во время начального выбора для иматиниба-сопротивления мутагенезу BCR-ABL в объеме жидкой культуры, мы обнаружили только четыре мутантные формы, которые были представлены несколько раз в течение первых 100 изолирует мы секвенировали. Таким образом, скрининга с использованием мягкой агар позволяет медленно растущие клоны с более скромными степени лекарственной устойчивости к возмещению, что бы не быть идентифицированы с использованием объемной культуры. По этой причине, рекомендуется, чтобы расти массового культивирования до выбора только от 14 до 16 ч, а затем с выбора препарата без ИЛ-3 в мягком агаре. В нашем эксPerience, выращивание культур за 36 часа после вирусной трансдукции, как правило, преобладают высоко пролиферативных клонов, что создает риск потерять медленно растущих клонов (слабо преобразовательной). Кроме того, с использованием клеток из ранних временных точках, таких как 6-8 ч после вирусной трансдукции склонны выбирать для очень преобразующей или с гиперэкспрессией клонов, тем самым вызывая смещение и искажение в идентичности и частоты сопротивления клонов. Поэтому, мы рекомендуем использовать клетки, выращенные на 14-16 ч после вирусной трансдукции для скрининга, который обеспечивает плотное выбор индивидуальных клонов и предотвращает клонов господство, как правило, наблюдается в жидких культурах оптом.
Важно, чтобы подтвердить способность кандидата мутации в придавать устойчивость в изоляции, так как некоторые клоны идентифицировали иметь несколько мутаций. Для экрана JAK2-V617F, мы воссоздали большинство мутаций, выявленных из нашей библиотеки Случайный мутагенез с использованием сайт-направленного mutageНесис. После введения выделенных мутантов в свежие клетки, они были затем выращивали в присутствии различных препаратов, чтобы определить IC50s для каждого мутанта. Мы также протестировали два различных устойчивых варианты для сопротивления в естественных условиях путем мониторинга биолюминесценции, чтобы дополнительно подтвердить способность этих отдельных мутаций, чтобы вызвать лекарственную устойчивость в естественных условиях.
Учитывая успех анти-киназы терапии в лечении раковых заболеваний, которые оцинкованной всплеск ингибиторов киназ в клиниках, очень важно определить клинически проблематичный сопротивление, придающий мутации для лучшего управления пациентами и развивающихся препаратов, которые могут предназначаться для них. Эта стратегия скрининга были успешно использованы для выявления мутаций в BCR / ABL, JAK2 и FLT3 20; Однако, мы считаем, что это будет, как правило применимо к широкому кругу противоопухолевых агентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 micron disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E. coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |
References
- Huse, M., Kuriyan, J.
- Melnikova, I., Golden, J.
- Cohen, P. Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).
- Dancey, J., Sausville, E. A. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).
- Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure. Science. 303, 1800-1805 (2004).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med. 2, 561-566 (1996).
- Gorre, M. E., et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science. 293, 876-880 (2001).
- Shah, N. P., et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).
- Branford, S., et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood. 99, 3472-3475 (2002).
- Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell. 112, 831-843 (2003).
- Azam, M., et al. Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).
- Azam, M., et al. AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance. Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).
- Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine. Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).
- Soverini, S., et al. Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia. Leukemia research. 38, 10-20 (2014).
- Deshpande, A., et al. Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 26, 708-715 (2012).
- Koppikar, P., et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy. Nature. 489, 155-159 (2012).
- Marit, M. R., et al. Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor. PLoS One. 7, 43437 (2012).
- Weigert, O., et al. Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition. The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).
- Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503. Blood cancer journal. 3, 138 (2013).
