Summary
Opkomst van genetische resistentie tegen kinase remmer therapie vormt een serieuze uitdaging voor een effectieve behandeling van kanker. Identificatie en karakterisatie van resistente mutaties tegen een nieuw ontwikkelde geneesmiddel helpt bij een betere klinische behandeling en de volgende generatie geneesmiddelen. Hier beschrijven we ons protocol in vitro screening en validatie van resistente mutaties.
Abstract
De ontdekking van BCR / ABL als bestuurder oncogen bij chronische myeloïde leukemie (CML) resulteerde in de ontwikkeling van Imatinib, die in feite aangetoond dat het potentieel van de kinase gericht op kanker door het effectief behandelen van de CML patiënten. Deze waarneming revolutie geneesmiddelenontwikkeling de oncogene kinasen betrokken bij diverse andere maligniteiten, zoals EGFR, B-RAF, KIT en PDGFRs richten. Echter, een belangrijk nadeel van anti-kinase therapieën is het ontstaan van resistentie mutaties waardoor de doelstelling om verminderde of verloren affiniteit voor het geneesmiddel. Inzicht in de mechanismen die in dienst zijn van resistente varianten niet alleen helpt bij het ontwikkelen van de volgende generatie-remmers, maar geeft ook een impuls aan klinische behandeling met behulp van gepersonaliseerde geneeskunde. We meldden een retrovirale vector screening strategie voor het spectrum van resistentie verstrekkend mutaties in BCR / ABL, die heeft bijgedragen in de volgende generatie BCR / ABL remmers te identificeren. Met behulp van Ruxolitinib en JAK2 als een drug target paar, hier beschrijven we in vitro screening methoden die de muis BAF3 cellen die de willekeurige mutatie bibliotheek van JAK2 kinase gebruikt.
Introduction
Proteïne kinasen zijn belangrijke regulerende enzymen van intracellulaire signaaltransductie, die schijnbaar moduleren elke cellulaire functie. Een goede beheersing van kinase gemedieerde signalering is van cruciaal belang om de homeostase en ontwikkeling, die meestal berust op goede regulering van kinasen, fosfatasen en de afbraak ervan door UPS (ubiquitine proteasoom systeem). Gedereguleerd kinases zijn in het centrum stadium van vele vormen van kanker en betrokken bij tal van ziekten bij de mens 1. Menselijk genoom codeert voor meer dan 500 eiwitkinasen die zijn verbonden, direct of indirect, -400 menselijke ziekten 2. Deze waarnemingen worden ondersteund het concept voor therapeutische doelwitten van kinases door kleine molecule inhibitoren 3-5.
Het aantonen van ABL kinaseremmers, zoals Imatinib, in de behandeling van chronische myeloïde leukemie (CML) verstrekte de proof of concept van deze benadering 6,7. Deze observatie niet alleen een revolutie in de mieri-kinase behandeling ook afgedwongen het idee om de genetische laesies in andere neoplastische ziekten voor therapeutische doelwitten, die leiden tot de ontdekking van oncogene mutatie in het JAK2 van polycytemie vera (PV) en patiënten met myeloproliferatieve neoplasmen (MPN) identificeren. Deze ontdekking grote belangstelling bij de behandeling van MPNs door zich te richten JAK2 met kleine molecule kinase inhibitoren. Nu, een tiental van JAK2 remmers in klinische studies en een van hen is onlangs goedgekeurd voor de behandeling van myelofibrose. Hoewel specifieke targeting van oncogene kinasen door kleine molecule inhibitoren bij kanker brengen veelbelovende resultaten, lijdt ook van ontwikkeling van resistentie tegen de behandeling. In feite, tot nu toe, de patiënten behandeld met kinase-remmers, zoals imatinib, gefitinib, Erlotinib en Dasatinib ontwikkelde resistentie mutaties voornamelijk door de overname van mutaties in het kinase domein waartoe drug targets 8-10. Resistentie als gevolg van genmutatie benadrukt de beperkingen of gerichte monotherapie tegen oncogene kinasen, en is de volgende uitdaging in de ontwikkeling van steeds succesvolle chemotherapie. Mechanistische en functionele gevolgen van resistentie tegen geneesmiddelen moeten een achtergrond voor de keuze en het ontwerp van een gratis verbindingen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen te verstrekken. Mutaties die via in vitro schermen, blijkt een hoge mate van correlatie met die gevonden bij patiënten. Daarom, in vitro screenen op mutaties die resistentie voor een bepaald geneesmiddel doelparen in klinische of preklinische ontwikkeling helpt verlenen identificeren de resistentiepatronen die waarschijnlijk klinische terugval veroorzaken. De identificatie van deze mutante vormen is niet alleen nuttig bij de controle patiënten voor drug respons en terugval, maar eveneens essentieel voor het ontwerpen van robuustere volgende generatie remmers. Bijvoorbeeld, de ontwikkeling van de volgende generatie BCR / ABL remmers, nilotinib en Ponatinib, mogelijk gemaakt door een grotere mechanistic inzichten opgedaan met mutagenese, structurele en functionele studies.
Eerder hebben we de resultaten van onze scherm met willekeurige mutagenese van BCR / ABL het spectrum van mutaties die resistentie tegen remmers zoals imatinib 11,12, PD166326 12 en AP24163 13 onthullen gerapporteerd. De resultaten niet alleen gewezen op de mutaties die klinische resistentie en de ziekte van terugval, maar ook voorzien van de mechanistische begrip van resistentie tegen geneesmiddelen en beginselen voor de kinase functie 11,14. Hier bieden we aanvullende methodologische detail, met behulp van ruxolitinib en JAK2 als een drug target paar, om een bredere toepassing van deze screening strategie mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle procedures in dit protocol werden uitgevoerd volgens de National Institute of Health richtlijnen voor de ethische behandeling en verzorging van dieren, en volgens een goedgekeurde IACUC gebruik dier protocol.
1. Cell Line Maintenance
- Cultuur BAF3 cellen in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en penicilline / streptomycine (100 eenheden / ml en 100 ug / ml) en kweekmedium WEHI cellen brachten. Groeien HEK293T cellen in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en penicilline / streptomycine (100 eenheden / ml en 100 ug / ml). Handhaaf cellen bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer die 5% CO2.
2. Plasmideconstructie
- Kloon de muis JAK2 en haar oncogene isovorm JAK2-V617F in pMSCV-puro-GW door LR Clonase behulp van standaard recombinatie kloonprocedure.
- Voor de constructie van luciferase-expressievector (pMSCV-Luc-Cherry-GW) gebruikt in vivo beeldvorming, amplificeren luciferase van pLVX-Tet-ON vector door PCR met primers (LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG en LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) gevolgd door klonering in pENTR-SD-TOPO te pENTR-Luc, dat opwekking het luciferasegen overdragen retrovirale vector, pMSCV-Cherry-GW door recombinatie gemedieerde klonering gebruikmaking van LR-clonase.
3. Voorbereiding van Random Mutation Bibliotheek, screenen en identificeren van de mutaties
3.1) Willekeurige mutagenese
- Kloon volledige lengte van JAK2 wild-type en de V617F mutatie naar pMSCV-puro-GW retrovirale vector met behulp van een commercieel recombinatie klonen technologie.
- Gebruik 1 ug JAK2 V617F-plasmide-DNA te transformeren, XL-1 Red, E. coli cellen die defect in DNA herstelmechanismen zodat ze willekeurige mutaties nemen tijdens de replicatie. Meer specifiek, meng 50-100 ng DNA (meer dan 100 ng DNA vermindert transformatie-efficiëntie) 100 pi competente cellen in een voorgekoeld polypropyleen buis en geïncubeerd op ijs gedurende 30 minuten, voorzichtig schudden om de 5 min. Voor een goede bibliotheek dekking, gebruiken 4-6 buizen van competente cellen.
OPMERKING: Meer dan 100 ng DNA vermindert transformatie-efficiëntie - Dompel de buis in een waterbad bij 42 ° C voor een heat shock van 45 seconden en incubeer op ijs gedurende 2 minuten. Voeg vervolgens 1 ml SOC-medium (2,0% trypton, 0,5% gistextract, 0,05% NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, en 0,4% D-glucose). Incubeer de buis bij 37 ° C onder schudden bij 225-250 rpm gedurende 90 min.
- Plaat cellen uit elke buis op vier 10 cm LB-agarplaten die 100 ug / ml ampicilline. Incubeer de platen gedurende 16-24 uur bij 37 ° C.
- Volgende zichtbare kolonies, verzamel ze door het afschrapen van de platen met een steriele plaat schraper. Pool cellen van elke plaat en isolaat plasmide-DNA met een commercieel plasmide extractie kit.
OPMERKING: Meestal kolonies zijn kleiner en neemt 18-24 uur te zijnzichtbaar omdat deze langzaam groeiende bacteriestammen. In dit stadium, beoordeelt de heterogeniteit van mutaties in de bibliotheek door restrictiedigestie met frequente snijder zoals Sau3A1 of Taq1 of sequencing.
3.2) De productie van retrovirale Supematanten en Transduction
- Een dag voor transfectie, plaat 4 x 10 6 HEK 293T cellen op 100 cm schalen in DMEM met 10% FCS, penicilline / streptomycine en 2 mM L-glutamine.
- De volgende dag, de plaats van de middelgrote en transfecteren de cellen met gemuteerd pMSCV-JAK2-V617F bibliotheek. Voor elke 10 cm plaat, meng 10 ug DNA (5 ug van het plasmide bibliotheek en 5 ug retrovirale inpak plasmide, pCLEco) met 40 ul van FuGENE tot een totaal volume van 400 pl met serumvrij DMEM medium. Incubeer de DNA en lipide mengsel gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Na 20 min wijs Voeg de DNA-lipide-complex druppel bovenop HEK293T cellen.
- Na zes uur, veranderen de transfectie media with vers medium en incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37 ° C gedurende virusproductie. Na 48 uur incubatie, verzamel virale supernatanten gefiltreerd door een 0,45 urn filter Acrodisc.
3.3) selectie van resistente klonen in vitro
- Voor resistente JAK2 V617F-mutanten, transduceren 100000000 BAF3 cel 100 ml virus supernatanten met een virale titer van 0.5-1 x10 6. Meer specifiek, meng 10 8 cellen met 100 ml virussupernatant tot een totaal volume van 300 ml met RPMI medium, dat 10% serum en 24 ug / ml polyberene (eindconcentratie van ployberene 8 ug / ml). Verdeel deze cel mixers in meerdere zes well platen (4-5 ml per putje).
- Centrifugeer de platen bij 1250 xg gedurende 90 min bij 25 ° C. Na centrifugatie Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur.
- De volgende dag, bundelen de cellen bij elkaar en meng met ruxolitinib en medium met zachte agar en vergulde in six well platen. Voor elke geneesmiddelconcentratie, meng 10 ml getransduceerde BAF3 cellen (10-20 miljoen cellen) met een aangepaste hoeveelheid ruxolitinib in een 50 ml buis. Vul met water aan tot 40 ml met behulp van RPMI dat 20% serum. Voeg 10 ml van 1,2% agar aan de cellen, mixcarefully en plaat in zes well platen.
- Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende twee weken. Pluk de resistente kolonies met behulp van 0,2 ml pipet tips en subcultuur ze individueel in 24 well platen voor 3-4 dagen.
- Oogst de resistente BAF3 cellen door centrifugatie bij 450 xg gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Isoleer het genomische DNA met een commercieel genomisch DNA isolatie kit. PCR versterken volledige lengte JAK2 cDNA van 100 ng genomisch DNA met primers (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG en mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) en lange-template uitbreiden high fidelity PCR-systemen.
- Scheid de PCR producten met agarosegelelektroforese. Accijnzen het 3,4 kb van DNA-band die JAK2 codering frame en isoleren van het DNAeen handelspraktijk gelextractiekit. Sequentie de volledige lengte van cDNA met 8 interne primers (P1 - P8) verspreid over de coderende sequentie en het analyseren sequenties met commerciële software.
4. In Vitro Validatie van Resistant Mutaties
Veel celklonen dragen meer dan één mutatie, om de bijdrage van elke mutatie in fenotype te testen, genereren geselecteerde varianten door plaatsgerichte mutagenese middels pMSCV-JAK2V-617F-plasmide als matrijs.
- Voeren gerichte mutagenese op pMSCV-JAK2-V617F plasmide met behulp van een commercieel mutagenesekit en oligonucleotiden ontworpen om puntmutaties te creëren. Bevestigen de identiteit van de mutant klonen door sequencing.
- Transduceren BAF3 cellen met retrovirussen gemaakt met behulp van mutante plasmiden gevolgd met de selectie met behulp van puromycine op 1 ug / ml.
- Plaat 10 4 BAF3-JAK2 V617F-cellen (50 pi RPMI met 10% FCS) in elk putje van een plaat met 96 putjes. Apartly voeg 50 ul van de ruxolitinib bevattende media aan de putjes in de plaat (eindconcentratie: 0, 1, 3, 5, 10, en 20 uM) en incubeer de platen gedurende 60 uur bij 37 ° C.
- Beoordeel cellevensvatbaarheid door toevoeging van 10 pl WST-1 reagens aan elk putje gevolgd door incubatie bij 37 ° C gedurende 2-4 uur. Record absorptie bij A450 met behulp van een plaat lezer. Voer alle testen in drievoud en plot gemiddelde extinctie tegen INCB018424 concentraties. Voer een best-fit sigmoïdale curve met een niet-lineaire curve fitting algoritme. Score de geneesmiddelconcentratie resulteert in 50% cel levensvatbaarheid als cellulaire IC50.
- Vervolgens plaat zes miljoen BAF3 cellen die JAK2 varianten in zes putjes in RPMI medium dat 10% serum met toenemende ruxolitinib en gedurende 4-6 uur bij 37 ° C.
- Verzamel de cellen door centrifugatie bij 450 xg gedurende vijf minuten bij 4 ° C. Was de cellen eenmaal met PBS, en lyseren in 20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM natriumfluoride, 2 mM natriumvanadaat en 5% glycerol, aangevuld met protease inhibitor cocktail en fosfataseremmers. Ultrasone trillingen de celsuspensie gedurende 1 min, gevolgd door toevoeging van 5x gel laadbuffer (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], 500 mM DTT, 15% SDS, 10 mM benzamidine, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 5 mM natriumvanadaat , Protease cocktail, 50% glycerol en 0,001% broomfenolblauw) en denaturatie bij 70 ° C gedurende 5-10 minuten.
- Los de eiwitten op een 8% SDS-polyacrylamidegel onder denaturerende omstandigheden. Voeren immunoblotting met de muis monoklonaal anti-phopsho STAT5. Strip de vlekken en opnieuw gesondeerd met een konijn polyklonale anti-SATA5 antilichaam. Visualiseer de banden met behulp van ECL-reagentia volgens de aanbevelingen van de leverancier.
5. In vivo Validation
- Transduce BAF3 cellen die luciferase en kersen (getransduceerd met retrovirussen gemaakt van pMSCV-Luc-cherry GW) met virussen uiten JAK2-V617F en resistente varianten. Selecteer cellen die puromycineselectie voor de expressie van JAK2 en de weerstand varianten overleven.
- Injecteer twee miljoen actief groeiende BAF3-Luc / kers cellen die JAK2-V617F en resistente varianten in 200 pl PBS tot 6 Balb / C-muizen via-staartader injectie.
- Na drie dagen cel transplantaties, injecteren de muizen met ruxolitinib (100 mg / kg) tweemaal per dag gedurende twee weken.
- Uitvoeren-luciferase gebaseerde bioluminescentie beeldvorming met een imaging-systeem. .
- Kortom, bereiden luciferine-oplossing door oplossen 300 mg 25 ml steriel gedeïoniseerd water, aliquot in kleinere volumes en opslag.
OPMERKING: Bewaren luciferin bij -80 ° C en beschermen tegen licht tot gebruik. - Injecteer 250 ui aan elke muis met IP 125 mg / kg per muis bereiken. Verdoven de muizen uit dezelfde groep samen met inhalatie van isofluraan (1,5% -2,0%) in een verzegelde doos. Solliciteer dierenarts zalf op the oog tot droog voorkomen.
OPMERKING: De tijd genomen voor muizen om te slapen (10-15 min) toegestaan luciferin activiteit piek. Houd de tijd consistente tussen de groepen om variatie te voorkomen.
- Kortom, bereiden luciferine-oplossing door oplossen 300 mg 25 ml steriel gedeïoniseerd water, aliquot in kleinere volumes en opslag.
- Breng de muizen onmiddellijk naar beeldvorming kamer podium en anesthesie bij 1,5-2% isofluorane te behouden tijdens de beeldvorming procedures. Afbeelding muizen met sequentiële 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60 en 300 sec belichting. Maak foto's en kwantificeren bioluminescentie intensiteit van het gebruik van image acquisitie en analyse software. Volgende beeldvorming terug de muizen terug naar zijn kooi.
- Voor in vivo chimerisme oogst totaal beenmerg cellen. Euthanaseren de muizen met CO2 gedurende 5 minuten gevolgd door cervicale dislocatie. Oogst de botten en verpletteren in 4 ml koud PBS om het beenmerg te verzamelen. Analyseer het percentage kers positieve cellen onder de fluorescentie microscoop en te kwantificeren met behulp van FACS. Verzamel twintigduizend gebeurtenissen uit elk monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opkomst van genetische mutaties vormt grote uitdaging voor de gerichte anti-kinase-therapie. Mutatie-studies, naast het verstrekken van mechanistische en functionele inzichten die instrumenteel in de selectie en het ontwerp van de volgende generatie drug ontwikkeling zijn, maakt het ook mogelijk een betere klinische behandeling en kan in de toekomst meer behulpzaam zijn voor gepersonaliseerde behandeling. In dit experiment tonen wij screening ruxolitinib resistentie mutaties in JAK2 V617F-kinase (figuur 1). We gebouwd pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway vector door de invoering van de full-length muis JAK2-V617FcDNA in pMSCV-Cherry-GW. Het wordt aanbevolen om bacteriële gastheer (XL-1 red stam van E. coli) om willekeurige mutaties in de meest populaire keuze van de methode, die PCR, vanwege de beperkingen geassocieerd met sequentie vertekening en grotere genfragmenten moeilijk te amplificeren ontwikkeling . Willekeurig gemutageniseerde DNA bibliotheek werd getransfecteerd naar HEK293T cellen voor productie van retrovirussen. Deze mutant virtoepassingen werden gebruikt, transduceren de BAF3 cellen die werden geselecteerd voor koloniegroei in zachte agar bij afwezigheid van IL-3 met 1 of 5 uM ruxolitinib. Onder deze omstandigheden kolonies ontstaan alleen cellen die JAK2V-617F cDNA dat functionele en resistente variant van de kinase uitdrukt. Na 10-14 dagen werden goed gescheiden individuele kolonies opgepikt, welke varieerden in grootte en breidde ze in vloeibare kweek. Genomisch DNA werd geïsoleerd uit deze cellen. De pro-virus werd gewonnen door directe redding of door PCR. De teruggewonnen provirussen werden gesequenced om mutaties (figuur 1) geeft. Sequence analyses werden uitgevoerd met DNASTAR Lasergene pakket.
Omdat veel celklonen uitgevoerd meer dan één mutatie, raden wij valideren van deze mutaties afzonderlijk zowel in vitro en in vivo assays (figuren 2 en 3). Om de activiteit van varianten controleren afzonderlijkgeselecteerde varianten werden gegenereerd door plaatsgerichte mutagenese van de JAK2V-617F sequentie. Deze varianten gereïntroduceerd BAF3 cellen en gemeten vermogen celproliferatie bij verschillende dosering van ruxolitinib evalueren IC50 (IC50-waarden, Figuur 2A). Biochemische tests worden uitgevoerd voor fosfotyrosine- of fosfo-STAT5 door immunoblotanalyse op eiwitlysaten van BAF3 cellen die werden geïncubeerd met toenemende doses van ruxolitinib het uitsluiten van de palen gemedieerde resistentie (Figuur 2B). Mutanten vertonen verbeterde IC50 waarden en aanhoudende autofosforylering bij hogere ruxolitinib concentraties derhalve bevestigd voor resistente varianten. Omdat veel resistente mutaties tonen dosis responsvariabele, daarom is het noodzakelijk om te testen of deze mutaties resistentie verlenen in vivo ook. Meestal raden wij slechts 2 -3 verschillende varianten te testen in vivo experimenten, omdat ze duur enomslachtig. De in vivo resistentie te valideren, werden BAF3 cellen ontworpen om JAK2-V617F varianten en Luciférase / cherry betuigen aan in vivo volgen mogelijk te maken. Muizen werden geïnjecteerd met 1-2.000.000 kers positieve cellen (expressie JAK2 varianten en luciferase), gevolgd door ruxolitinib injectie gedurende twee weken. Na twee weken werden de muizen afgebeeld voor luciferase-gekatalyseerde bioluminescentie (figuur 3), en ook BAF3 chimerisme in beenmerg en perifeer bloed door het meten van de fluorescentie van kersen positieve cellen (figuur 3). Muizen die JAK2 V617F-gevoelig zijn ruxolitinib, terwijl resistente varianten vertonen progressieve toename in bioluminescentie gedurende de periode van behandeling, wat erop wijst dat BAF3 cellen die JAK2 V617F-variant is resistent tegen ruxolitinib behandeling in vivo.
Figuur 2:. Een schema toont in vitro validatie met behulp van dosis-afhankelijke celproliferatie assays (A) en Western blotting (B) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 
Figuur 3: Een schematische weergave van in vivo validatie met behulp van luciferase-gekatalyseerde bioluminescentie meting. Klik hier voor een grotere weergaveversie van deze figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De klinische succes van Imatinib behandelen CML blijkt niet alleen het potentieel van de targeting rouge kinases kleine molecule inhibitoren, maar ook ontdekt beperkingen van gerichte therapie: klinische terugval en ontstaan van resistentie mutaties in het doelgen. Identificatie van resistentie mutaties helpt bij een betere klinische beheer en de ontwikkeling van de volgende generatie remmers. Dit protocol beschrijft een methode voor resistente mutaties in de beoogde gen te identificeren. Deze werkwijze gebruikt een willekeurig gemutageniseerde plasmide bibliotheek ingebouwd in E. coli, de mutante eiwitten tot expressie. De bibliotheek wordt vervolgens ingebracht in BAF3 cellen (vatbaar voor transformatie door een oncogen), gevolgd door selectie van celklonen in aanwezigheid van chemotherapeutische middelen. Sequencing van doelgen resistente klonen identificeert mutaties resistentie. Tenslotte geïdentificeerde mutaties worden nagebootst door plaatsgerichte mutagenese om te validerengeneesmiddelresistentie.
Met behulp van deze strategie hebben we het spectrum van mutaties in JAK2 en BCR / ABL die resistentie tegen ruxolitinib en imatinib, respectievelijk gedefinieerd. We identificeerden meer dan honderd mutaties in BCR / ABL. Trouwens, het identificeren van alle belangrijke mutaties waargenomen bij patiënten, onze screeningsmethode liet ons toe om nieuwe substituties van residuen, zowel binnen als buiten de kinase domein identificeren. Interessant is dat alle mutaties van ons scherm geïdentificeerd in monsters van patiënten, maar dit proces duurde bijna meer dan 10 jaar op 15, waardoor de mogelijkheid van dit scherm om te anticiperen op mutaties die klinisch problematische resistentie zal opleveren demonstreren. Terwijl resistente screening met behulp van willekeurige mutagenese biedt vele voordelen in vergelijking met andere methoden, zijn er potentiële valkuilen bewust te zijn van bij het volgen van een screening procedure. Voor elke screening, is het sterk aanbevolen voor BAF3 cellen volledig afhankelijk van de doelgroep te zijn waartegen Resihouding wordt gevraagd. Een storing of gedeeltelijke afhankelijkheid van het doelwitgen niet waar resistente klonen ontwikkelen waarschijnlijk valse positieven ontwikkelen. Zo hebben vier verschillende studies bestand screening uitgevoerd van JAK2 remmers met BAF3 getransduceerd met ofwel EPO of MPL receptoren JAK2 V617F-afhankelijkheid 16-19 vergemakkelijken. Slechts acht resistente mutaties beperkt domein kinase geïdentificeerd uit deze schermen, hoewel talrijke resistente klonen ontwikkeld dat ontbrak mutaties, vermoedelijk door ontstaan van valse positieven, hetgeen werd toegeschreven aan heterodimerisatie van JAK1 en JAK3 cytokine receptoren. Daarom, om het verlies van JAK2 afhankelijkheid te vermijden we uitgevoerd resistent screening in duidelijke BAF3 dat robuuste selectie van resistente klonen tegen ruxolitinib en al van deze klonen toonde toonde de aanwezigheid van resistente mutaties. Op basis van deze observaties, om het volledige spectrum van resistente mutaties benutten, raden wij aan dat de BaF3 cels moeten volledig afhankelijk van de gerichte kinase tot de opkomst van valse positieven te vermijden zijn, zoals een norm in de vorige bestand screenings uitgevoerd tegen JAK2-remmers 16,17 geweest. Bovendien is het essentieel om bulk kweekomstandigheden waarbij cellen die verschillende mutaties elkaar worden samengevoegd en laat expanderen in vloeibare kweek te voorkomen, aangezien dit kan leiden tot klonale dominantie van enkele zeer resistente varianten. Bijvoorbeeld, tijdens de eerste selectie voor imatinib-resistentie van gemutageniseerde BCR-ABL in bulk vloeibare cultuur, vonden we slechts 4 mutante vormen die meerdere keren binnen de eerste 100 isoleert we gesequenced waren vertegenwoordigd. Daarom screenen met behulp van zachte agar laat langzaam groeiende klonen met meer bescheiden mate van resistentie tegen geneesmiddelen te vorderen die niet zou worden geïdentificeerd met behulp van bulk cultuur. Daarom wordt aanbevolen om bulk cultuur groeien voorafgaand aan selectie slechts 14 tot 16 uur, gevolgd door geneesmiddelselectie zonder IL3 in zachte agar. In onze experience, groeit de culturen na de 36 uur na virale transductie hebben de neiging om te worden gedomineerd door zeer proliferatieve klonen, die een risico voor langzaam groeiende klonen te verliezen (zwak transformatieve) vormt. Evenzo, waarbij cellen uit een eerdere tijdstippen zoals 6-8 uur na virale transductie gevoelig selecteren voor zeer transformerende of overexpressie klonen, waardoor een voorspanning en voorstelling in de identiteit en frequentie van resistentie klonen. Daarom raden wij het gebruik van cellen gekweekt voor 14-16 uur na virale transductie voor screening, waarbij strakke selectie van individuele klonen biedt en voorkomt dat klonale dominantie meestal waargenomen in vloeibare bulk culturen.
Het is essentieel om een kandidaat mutatie om resistentie afzonderlijk verlenen bevestigen, aangezien sommige klonen werden geïdentificeerd om meerdere mutaties. Voor de JAK2-V617F scherm, we opnieuw een meerderheid van de mutaties geïdentificeerd uit onze willekeurige mutagenese bibliotheek met behulp van gerichte mutageNesis. Na de introductie van de geïsoleerde mutanten in zoet cellen, werden zij vervolgens gekweekt in aanwezigheid van verschillende drugs IC50's voor elke mutant te bepalen. We testten ook twee verschillende resistente varianten in vivo resistentie door monitoring van de bioluminescentie op het vermogen van deze enkele mutaties resistentie veroorzaken in vivo verder te bevestigen.
Gezien het succes van anti-kinase therapie bij de behandeling van kanker die een golf van kinaseremmers in klinieken gegalvaniseerd, is het cruciaal om de klinisch problematische resistentieverstrekkend mutaties voor een betere behandeling van de patiënt en ontwikkeling van geneesmiddelen die hen kunnen richten identificeren. Deze screening strategie is met succes gebruikt om mutaties in het BCR / ABL, JAK2 en FLT3 20 identificeren; We geloven echter dat het algemeen toepasbaar op een brede waaier van anti-neoplastische middelen is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 micron disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E. coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |
References
- Huse, M., Kuriyan, J.
- Melnikova, I., Golden, J.
- Cohen, P. Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).
- Dancey, J., Sausville, E. A. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).
- Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure. Science. 303, 1800-1805 (2004).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med. 2, 561-566 (1996).
- Gorre, M. E., et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science. 293, 876-880 (2001).
- Shah, N. P., et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).
- Branford, S., et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood. 99, 3472-3475 (2002).
- Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell. 112, 831-843 (2003).
- Azam, M., et al. Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).
- Azam, M., et al. AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance. Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).
- Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine. Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).
- Soverini, S., et al. Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia. Leukemia research. 38, 10-20 (2014).
- Deshpande, A., et al. Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 26, 708-715 (2012).
- Koppikar, P., et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy. Nature. 489, 155-159 (2012).
- Marit, M. R., et al. Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor. PLoS One. 7, 43437 (2012).
- Weigert, O., et al. Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition. The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).
- Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503. Blood cancer journal. 3, 138 (2013).
