Summary
Tynntarmen er ofte utsatt for giftstoffer som kan påvirke blodgjennomstrømningen og negativt påvirke næringsopptak. Ved hjelp av en multimyograph og mesenteriske arterie og vene isolerer, forbindelser eller giftstoffer av interesse kan være skjermet for vasoactivity.
Abstract
Pattedyr gastrointestinale system er stadig utsatt for forbindelser (ønskede og uønskede) som kan ha en virkning på blodstrømmen til og fra dette system. Forandringer i blodstrømmen til tynntarmen kan medføre virkninger på de absorptive funksjoner av organet. Spesiell interesse for giftstoffer som frigjøres fra fôr gjennom fermentative og fordøyelsesprosesser har utviklet hos drøvtyggere som et område hvor produktive effektivitet kan forbedres. Video forbundet med denne artikkelen beskriver en in vitro bioassay utviklet til å screene forbindelser for vasoactivity i isolerte tverrsnitt av bovint mesenteriske arterie og vene ved hjelp av en multimyograph. Når blodkar blir montert og ekvilibrert i myograph, kan den biologiske metode i seg selv brukes: som et screening-verktøy for å evaluere den kontraktile respons eller vasoactivity av forbindelser av interesse; bestemme tilstedeværelsen av reseptor-typer av farmakologisk målrette reseptorer med spesifikk agonistS; bestemme rollen til en reseptor med tilstedeværelse av en eller flere antagonister; eller bestemme mulige interaksjoner av forbindelser av interesse med antagonister. Gjennom hele denne blir data samlet i sanntid, kan vev oppsamlet fra et enkelt dyr utsettes for et stort antall forskjellige eksperimentelle behandlinger (en in vitro fordel), og representerer vaskulaturen på hver side av den kapillære sengen for å gi en nøyaktig bilde av hva som kan skje i afferent og efferent blodtilførsel støtte tynntarmen.
Introduction
Forandringer i blodstrøm til et vev seng kan ha en stor virkning på organfunksjon. En primær funksjon av tynntarmen er næringsopptak. Arterielle blodstrømmen til absorberende overflate av tarmen er nødvendig for næringsopptak og blodstrømningsøkning for å hjelpe til med opptak av næringsstoffer som digesta beveger seg langs flaten 1.. En reduksjon i blodstrømmen kan føre til en reduksjon i næringsopptak på grunn av en reduksjon i transepithelial gradient 2. I tillegg til næringsstoffene, kan tynntarmen også bli utsatt for sekundære metabolitter, legemidler eller toksiner som utøver en virkning på blodstrømmen lokalisert i mesenterium. I tilfelle av drøvtyggeren, kan forbindelsene bli frigjort fra et formiddel (f.eks næringsstoffer slik som aminosyrer, eller toksiner slik som ergotalkaloider) gjennom fermentative prosesser av den forutgående. Dersom disse forbindelsene overlever den mikrobielle metabolisme av ruminale gjæring, er de nå tilgjengelige for absorpsjoneller interaksjon når de går gjennom mage-tarmkanalen til dyret.
Det finnes en rekke forskjellige metoder tilgjengelige for å måle blodstrømmen in vivo (for eksempel Doppler-ultralyd, inneliggende blodstrømningsmålere, radiomerkede mikrokuler, og indikator-fortynning teknikker) som tillater evaluering av ulike eksperimentelle scenarier eller behandlinger. Men for å få informasjon om de mekaniske eller farmakologiske egenskapene til vaskulær glatt muskulatur, forble metoder begrenset til store fartøy inntil Mulvany og Halpern tre publiserte en artikkel som beskriver en teknikk ved hjelp av ledning montert vaskulære ring forberedelser i en myograph. Siden utviklingen av denne teknikk, modifikasjoner fortsette å bli gjort til de tilknyttede myograph systemer som muliggjør en rekke forskjellige anvendelser for evaluering av rørformede strukturer. Systemet har også blitt tilpasset til å utnytte faste stenger for montering av større skip 4, hvor perfusjonteknikkene er ikke ønskelig.
På grunn av ulikheter i fartøy fra ulike anatomiske opprinnelse og utmerkelser i de samme fartøy fra ulike arter av dyr, data fra fartøy og dyr type ikke lett kan ekstrapoleres på tvers av ulike fartøy eller samme fartøy i forskjellige dyre typer 5. Følgelig må separate bioassay bli utviklet og validert når disse aspektene er endret. Nylig flere bioassay har blitt utviklet med disse teknologiene for bruk i storfe lateral saphenavene og høyre ruminalt arterie og vene 6,7.
Denne biologiske metode ble utviklet for å spesifikt undersøke effektene som ergotalkaloider har på vaskulatur støtte tynntarmen. Det ble rapportert at 50-60% av fôret alkaloider vises i abomasal innholdet, men bare 5% er gjenfunnet i avføring 8. Strickland et al. 9 uttalte i en anmeldelse av ergotalkaloider, at tilgjengelige data Suggest at tynntarmen kan være den mest viktige området for ergopeptine absorpsjon. Eckert et al. 10 anmeldt biofarmasøytisk aspekter av ergotalkaloider og uttalte at når de krysser epithelial barriere, er ergotalkaloider transportert enten ved lymfesystemet til subclavia vene eller via mesenteriske blodåre og inn i portal blod. Rhodes et al. 11 rapporterte en nedgang i blodstrømmen til tolvfingertarmen og tykktarmen i styrer forbruker en høy endophyte-smittet (høy ergotalkaloidderivater) kosthold. Bruke riktig ruminalt arterie og vene bioassay, Foote et al. 12 viste at ergotalkaloider er vasoaktivt i ruminalt blodkar. Foote et al. 13. senere demonstrert in vivo at ruminalt eksponering for ergotalkaloider resulterer i en redusert rumen epitelial blodstrøm. Denne reduksjonen i blodtilførsel til den absorberende overflate av rumen samtidig forårsaket en reduksjon i nærings (volatile fatty acid) fluks. Gitt quantity av ergotalkaloider passerer videre til tynntarmen fra fortarmen; Det ble antatt at en lignende effekt på tynntarm vaskulaturen og næringsopptak ville oppstå. Dette behov for utvikling av det bovine proksimale ileal mesenteriske arterie og vene bioassay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrer som brukes i denne studien ikke krever godkjenning fra University of Kentucky Animal Care og bruk komité fordi ingen levende dyr ble brukt. Før samling av noe prøven brukt her, ble alle dyr stunned med en fange bolt og tappet for blod. Dette ble utført ved et føderalt kontrollert slakterianlegg ved University of Kentucky. En offisiell representant for USDA Food Safety and Inspection Service observert alle aktiviteter som behandles med levende dyr og håndtering av kadaver.
1. Utarbeidelse av Instrumentation
- For å minimere tiden mellom samlinger av vevsprøver til starten av et eksperiment, sette opp utstyr og forberede buffere før samle eksperimentell vev (eller hvis ekstra personell er tilgjengelig, kan disse oppgavene oppstå samtidig).
MERK: Dette gir ikke bare den største mengden av tid at vevet fortsatt er forsvarlig å utføre eksperimenter, men noeneksperimenter kan kjøre i lange perioder av gangen (eller det er et ønske om å fullføre flere eksperimenter i en dag), derfor er det vanligvis ønskelig å komme i gang så tidlig som mulig. - Strøm opp den tilknyttede datamaskinen, data oppkjøp utstyr, vannbad (for buffer (e)) og myograph enheten (e). Plasser kalibreringsutstyr på myograph enheten (e) og slå på myograph varme (forhåndsinnstilt til 37,5 ° C) og la enheter og kalibreringsutstyr for å varme til forhåndsinnstilte temperaturer.
- Åpne en tidligere opprettet Chart programvareinnstillingene fil på datamaskinen og starte et løp (men ikke anskaffe data).
- Varm opp utstyr for 10 min.
- Begynn å skaffe data.
- Null alle kanaler.
- Kontroller, og gjennomføre kalibrering (om nødvendig) for hver kanal (4 kanaler pr multimyograph) for å standardisere det elektriske signal som leveres fra den respektive kraft transduser forbundet med den kanalen til en 2-g kraft leveres av en sertifisert vekt.
- Etter kalibrering og enheter konvertering er ferdig, lagre alle etterfølgende data som gram. Endres tilsvarende basert på ønskene til hver enkelt laboratorium; utstyr og software tillater bruk av andre enheter, som for eksempel milliNewtons og volt.
- Kontroller at gassledninger er åpent og skru på gasstilførselen (95% O 2/5% CO 2) for å myograph (r) enheter. Kontinuerlig gass alle buffere (i myograph kamre) under hele prosedyren.
- Fylle alle myograph kamre med 70% etanol og suge i 10 min, fjern etanol, og gjenta for en ny 10 min suge.
- Etter fjerning av etanol, skylles tre ganger med deionisert vann, fulgt av tre skyllinger med klare buffer (se del 2 for buffer fremstilling), forlater den tredje tilsetning av buffer i kamrene.
MERK: På dette punktet utstyret kan være inaktiv i denne tilstanden til buffer og vev er forberedt og ansatte er klar til å fortsette med experiment.
- Etter fjerning av etanol, skylles tre ganger med deionisert vann, fulgt av tre skyllinger med klare buffer (se del 2 for buffer fremstilling), forlater den tredje tilsetning av buffer i kamrene.
2. Utarbeidelse av buffere
- Tilbered en 1 L Krebs-Henseleit-bufferløsning for bruk i transport og behandling av vevsprøver for å oppnå sluttkonsentrasjoner på 11,1 mM D-glukose; 1,2 mM MgSO 4; 1.2 mM KH 2 PO 4; 4.7 mM KCl; 118,1 mM NaCl; 3.4 mM CaCl 2; 24.9 mM NaHCO3.
- Bland 9,6 g av Krebs salter inn i omtrent 900 ml av avionisert vann på en røreplate.
- Bland i 0,373 g kalsiumklorid dehydrate etterfulgt av 2,1 g natrium bikarbonat per L buffer ønsket.
- Gass bufferløsning i 20 min med 95% O 2/5% CO2.
- Etter gassing, justere pH til 7,05 (filtrering av buffer øker pH, slutt mål pH bør være 7,4) og juster volumet til 1 L.
- Filter sterilisere buffer i en ren autoklaveres 1 L media flaske og oppbevar buffer ved 4 ° C til alt er klart til bruk.
- Forbered separat Krebs-Henseleit bufferløsning for bruk i myograph eksperimenter som beskrevet i trinn 2.1 for transport Krebs-Henseleit buffer med ytterligere forbindelser som gjelder for de kontraktilitet eksperimenter.
MERK: Typisk 2 L vil være tilstrekkelig for eksperimentene som er beskrevet i denne artikkelen, men dette volumet kan være nødvendig å øke eller redusere basert på lengden av forsøket, antall myograph kamre, og antallet buffer erstatninger (i forhold til behandlings tilføyelser).- Før gassing trinnet (trinn 2.1.3), tilsett 9,1 mg (per L buffer å være forberedt) av desipramin-HCl til buffer.
- Tilbered en 1,0 mM løsning av propranolol-HCl og tilsett 1 ml (per L av buffer som blir fremstilt) av denne oppløsning til Krebs-Henseleit buffer-oppløsning. Gjør denne bufferen på dagen for bruk og holdes i myograph driftstemperaturer (en temperatur som gir en 37,5 ° C temperatur i myograph).
MERK: desipramin tilsettes for å hemme de biogene aminer reuptake mekanismerog la clearing av eksperimentelle tillegg fra buffer bading blodårene til å skje raskere. Tilsetningen av propranolol forhindrer ikke-spesifikk binding av behandlingsforbindelser til β-adrenerge reseptorer.
3. Innsamling og klargjøring av vasculature
- Så snart som mulig, fjerne mage-tarmkanalen fra kadaveret. Når dyret ikke lenger viser noen ufrivillig refleks, fjerne hodet og skjule og deretter heve kadaveret vertikalt. Fjerning av gastrointestinal viscera (spiserør til anus) fra kadaveret skal være ferdig innen godkjente slakteripersonell (<20 min fra tid av slående).
MERK: Hvor snart, er generelt begrenset av plassering / anlegg hvor tarmen blir samlet inn fra og standard operasjonsprosedyrer eller prosedyrer føderalt mandat fulgt av anlegget personell.- I de fleste fasiliteter, gjennomføre manipulasjoner av mage-tarmkanalenpå et eget sted fra behandlingen av kadaveret som er skjebnebestemt til å gå inn i matforsyningen. Bruke et nærliggende praktisk beliggenhet der mage-tarmkanalen kan bli tatt og spredt ut for undersøkelse.
- Når magetarmkanalen blir spredt ut, identifisere tynntarmen, ileocecal fold som forbinder tynntarmen til cecum, og ileal flens som strekker seg proksimalt til ileocecal fold (figur 1A).
- Ved hjelp av en skalpell eller kniv, meget lett foreta et innsnitt i den mesenteriske membran i midten av ileal flensen. Ved hjelp av to pekefingrene, uten omsvøp dissekere bort fettet og bindevev utsette mesenteriske blodkar (figur 1B).
- Fra denne flens eller bule i tarm mesenteriet, dissekere ut flere grener (~ 2 cm i lengde) av de eksponerte mesenterisk arterie og vene bunter som støtter denne delen av ileum (figur 1C).
- Hvis usynge pinsett til å gripe vev, ta vare å ikke gripe direkte eller trekk i blodårene i det hele tatt mens du fjerner dem som noen form for stretching kan skade og negativt påvirke vev ytelse 14. Fjerning Blodkar gjøres best ved å kutte tvers over hver ende av seksjonen som skal fjernes, og deretter å skjære langs eller parallelt med den nå isolerte seksjonen. For enkel, fjerne noen av de omkringliggende vevet sammen med fartøy å gi noen vev å forstå med en pinsett.
- Med en pinsett, senk vevsprøve i et rør inneholdende iskald Krebs-Henseleit-buffer og oppbevares på is inntil behandlingen kan skje i laboratoriet.
- Plasser vevsprøve på en skjæreflate eller i en petriskål og delvis apparatet i iskald Krebs-Henseleit.
- Bruke # 5 gullsmeder tang, Noyes iris saks, og forstørrelses lampe eller dissekere omfang (2,5 til 5.0x forstørrelse er tilstrekkelig), nøye dissekere den omkringliggende fett og connective vev og skille arterie og vene. Identifisering av fartøyets åpning i den ene ende av delen og nøye gripe fascia omgir fartøyet med pinsett.
- Lag et snitt med saksen parallelt til fartøyet ved å skyve spissen av sakse under oppløftet fascia. Etter den første innsnitt, kan fett og bindevev bli ytterligere løsrevet fra beholderen ved å kutte ned på hver side med en saks. Sikre at fartøyene er så ren som mulig mens minimere mengden tid fartøyene bruker på benken.
- Returnere blodkar til rør av frisk Krebs-Henseleit buffer og oppbevar ved 4 ° C (prøver kan forbli lagret i opptil 24 timer etter innsamling og fortsatt produsere gyldige kontraktilitet data).
- Ved hjelp av et barberblad, skive fartøy som skal brukes i myograph inn i ønsket antall av 2 mm seksjoner (det er nyttig å bruke en vev høvelen for å oppnå konsekvente tverrsnitt).
- Undersøke hver seksjon under en dissekere scope (12,5X forstørrelse) for å sikre at hver seksjon har ingen unormalt, greiner, ventiler, eller overfladiske skader utilsiktet gjort under disseksjon og rengjøring. Bytt fartøyet delen hvis det er noe unormalt, gren, ventil, eller overflateskader.
- Lagre akseptable skiver fartøy seksjoner (nedsenket i Krebs-Henseleit buffer) på is eller ved 4 ° C til alt er klart for montering i myograph kamre (vanligvis <30 min).
- Forsiktig montere beholderen på myograph ved å sette inn støttene gjennom hulrommet og øke spenningen (ved hjelp av micropositioner på myograph) er forsiktig med å ikke strekke fartøy over et 2 til 3 g lesing.
- Når alle kamrene er tildekket, vakuum buffer fra alle kamrene og fyll med 5,0 ml av bufferen og starte en 15 min for å starte timeren ekvilibreringsperiode og eksperimentet.
4. Experiment
- Stabilisere alle fartøy seksjoner for 1,5 time å oppnå en stabil reslingen spenning på 1,0 g.
- Sett på Krebs-Henseleit inkuberingsbuffer hvert 15. min.
- Under Ekvilibreringen tiden justere strekket på blodkar seksjoner opp til 2 g, og deretter tillates å slappe ned til ca 0,80 g. Prøv ikke å tillate skip å slappe av for mye (de kan skli av festene). Prøv å oppnå en jevn utgangsspenning, hvor fartøyet inneholder 1 g spenning uten å kreve justering.
- Under ekvilibrering, fremstille en vandig 1,32 M oppløsning av KCl til å bli brukt som en referanse.
- Etter fullførelse av en tilfredsstillende ekvilibrering, tilsett 500 pl av 1,32 M KCl-løsning til å gi en 0,12 M oppløsning i 5,5 ml oppløsning badende fartøyet.
- Etter tilsetning av 1,32 M KCl, ikke justere spenningen manuelt som maksimal respons fra denne tillegg brukes til å evaluere vevs-levedyktighet og kan brukes til å normalisere behandlingsdata (f.eks konsentrasjons responser til en agonist).
- Bytt ut buffer i 15-min intervaller inntil spenningen har returnert til baseline verdi på 1,0 g.
- Så snart grunnlinjen er nådd, endres bufferen, og samtidig begynner et 1 min tidsur. Gjør dette for alle kamrene samtidig for å unngå en svimlende av starttider.
- Vortex standard som skal legges og forberede en kommentar til kammer 1 i løpet av 1 min nedtelling.
- Tilsett standarder i 25 pl aliquoter til hvert kammer som eksperiment dikterer (dette holder behandling under 0,5% av totalvolumet).
- Når den siste standarden har blitt lagt til, starter en 9 min tidtaker.
- Ved slutten av den 9 min standard inkubering, fjernes ved behandling-buffer inneholdende fra kamrene og tilsett 5,0 ml av frisk buffer, og starter timeren 2,5 min.
- Gjenta trinn 4.4.4.
- På slutten av den andre 2,5 min skylling, støvsuge kamrene og tilsett frisk buffer, og starte en 1 min tidtaker til nedtelling begynnelsen av second standard tillegg.
- Fortsett denne syklusen for alle dagens standard tilsetninger.
- Under den endelige standarden tillegg og påfølgende 9 min inkubasjon forberede 1,32 M KCl referanseforbindelse for en slutten av løp referansedose tillegg av 500 mL.
- Etter 1 min intervall etter siste behandling tillegg, legger KCl og starte en 9 min tidtaker.
MERK: KCl tillegg er å bekrefte vev levedyktighet ved avslutningen av forsøket, og er nyttig hvis administrere en behandling som resulterer i ubetydelig respons. - Ved avslutningen av den endelige 9 min referanseforbindelse inkubasjon vakuum eller fjern buffer fra alle kamrene. Ikke tilsett frisk buffer. Konkludere eksperimentet.
- Lagre Chart fil, fjerne blodkar seksjoner og kast riktig, og følg rydde opp protokollen (gitt av produsenten og kan være lab spesifikke) for myograph utstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blodkarene som benyttes til å generere de medfølgende resultater ble samlet fra 6 Holstein-styring (425 ± 8 kg) i løpet av en 3 ukers intervall. Et eksempel på en typisk mesenteriske vene kontraktile respons på KCl og behandlings tilsetninger øker i konsentrasjon er presentert i figur 2. Størrelsen av responsen vil variere noe med størrelsen av fartøyet (korrelert med størrelsen av donor dyr), men kan også bli påvirket (negativt) av feil håndtering (strekk) av skipene under innsamling og rengjøring. Derfor er det viktig å observere en signifikant kontraktile respons i skip eksponering for KCl. Hvis en ubetydelig reaksjon er observert på dette punktet, er det ikke tilrådelig å gå nærmere inn på fremgangsmåten med at fartøyet. Som sett i 9 min inkubasjonsperioder i figur 2, er det trinnvise økninger i respons som korresponderer med økende konsentrasjoner. Selv om ønskelig for denne speular eksperimentell design, kan det ikke alltid oppstå eller bli ettertraktet med andre behandlinger. Den KCl tillegg ved avslutningen av eksperimentet, selv om det ikke anvendes i behandlingen av data som samles inn, er meget viktig fordi det bekrefter levedyktighet av vevet ved avslutningen av forsøksperioden (blir mer viktig dersom fartøyet ikke svarer til noen av behandlings tilføyelser).
De data som er presentert i figur 2 føres i gram strekk. Det er viktig å normalisere disse data for å minimalisere enhver dyre-for-dyret og fartøy til fartøy variasjon. Således, i tillegg til å bli brukt som en indikator på levedyktigheten, er den maksimale KCl-respons benyttes til å normalisere alle behandlings tilføyelser. Dette genererer contractile svardata som en prosentandel av KCl maksimum. Dette er hvordan mesenterisk arterie og vene-responskurver for å øke konsentrasjonen av 5-hydroksytryptamin (serotonin, figur 3) og noradrenalin ( Den mesenteriske vene respons til både 5-hydroksytryptamin (figur 3) og noradrenalin (figur 4) startet som negative verdier. Dette er et resultat av å korrigere den maksimale spenningen registrert i løpet av hver 9 min inkubasjonstid ved baseline spenning innspilt før den første KCl tillegg. Denne referanse korreksjon sikrer at eventuelle små forskjeller i spenninger ikke er inkludert i analysen, og at de data som presenteres for å reflektere bare en endring i spenning. De negative verdi resultatene fra blodåren avslappende og slippe under pre-KCl baseline nivå før den etterfølgende behandlingen tillegg. Dette er spesielt vanlig i venøse prøvene hvor de innledende konsentrasjoner av behandlingen eller agonist er for lav til å føre til en kontraktile respons. Dette var ikke tilfelle for meg senteric arterie respons til enten biogene amin, som holdes spenningen over utgangsverdien til beholderen begynte å reagere på behandling tilføyelser. Denne forskjellen eksemplifiserer forskjellene i fartøyer på hver side av sengen, og kapillær hvorfor de ble begge betraktes som del av denne bioassay. Denne biologiske metode kan brukes til å evaluere vasoactivity av forbindelser på blodkarene til næringsstoffer til tynntarmen, samt blodkar bærer absorberte næringsstoffer vekk fra tynntarmen. Data på figur 3 og 4 er enkle eksempler på hvordan dette kan oppnås. I tilfelle av 5-hydroksytryptamin (figur 3), var det ikke en forskjell i den arterielle eller venøse kontraktile respons. Motsatt den kontraktile respons av mesenteriske vene til økende konsentrasjoner av noradrenalin var større enn den for den mesenteriske arterie. gur 1 "fo: content-width =" 3in "src =" / filer / Ftp_upload / 52020 / 52020fig1highres.jpg "width =" 300 "/>
Figur 1:. Et eksempel på bovin tarmkanalen anvendes som kilde til mesentriske blodårer Den rød stjerne angir den synlige delen av ileocecal fold i alle tre ruter som et referansepunkt. (A) Det hele tarmkanalen med det røde oval indikerer ileal flens hvor prøvetaking av vaskulatur oppstått. (B) Eksponering av mesenteriske vaskulær seng. (C) Iris saks peker mot en utsatt gren av mesenteriske vene (synlig) og arterien (ikke synlig) like før samlingen. 
Figur 2: Eksempel på en konsentrasjonsrespons fra et mesenteriske vene til økende konsentrasjoner av noradrenalin (1 x 10 -7-1X 10 -4 M). De store hendelser på begynnelsen og slutten av sporet er svarene på 0,12 M KCl tilsetninger. Den rødt rektangel betegner datainnsamling regionen korresponderende med 9 min inkubasjonstid for hver behandling tillegg. De tre slanke pigger som følger dette er gjenstander som genereres av buffer utskiftninger og er ikke inkludert i analysen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 3: Midlere kontraktile respons av mesenteriske arterie (MA) og vene (MV, n = 6-styring) til økende konsentrasjoner av 5-hydroksytryptamin (serotonin) linjer vist ble samlet ved hjelp av ikke-lineær regresjonsanalyse for å tilpasse dataene til en sigmoidal. konsentrasjon response kurve som benyttet følgende ligning: y = bunn + [(topp - bunn) / (1 + 10 (logEC 50 - x))], hvor topp og bunn er prosentandelen av 120 mM KCl maksimale kontraktile respons på platåer, og EC 50 er den molare konsentrasjonen av alkaloid produsere 50% av den maksimale respons KCl. 
Figur 4: Midlere kontraktile respons av mesenteriske arterie (MA) og vene (MV, n = 6-styring) til økende konsentrasjoner av noradrenalin linjer viste generert ved hjelp av ikke-lineær regresjonsanalyse for å tilpasse dataene til en sigmoidal konsentrasjonsresponskurve som benyttes. følgende ligning: y = bunn + [(topp - bunn) / (1 + 10 (logEC 50 - x))], hvor topp og bunn er prosentandelen av 120 mM KCl maksimal contractile respons på vidder, og EC50 er den molare konsentrasjonen av alkaloid som produserer 50% av den maksimale respons KCl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den første utfordringen i utviklingen av denne bioassay var etableringen av en repeat samling nettsted for mesenteriske blodkar. Prøve stedet konsistens er kritisk, ettersom noen av funksjonene til tynntarmen endres i løpet av progresjon fra jejunum gjennom ileum, og følgelig mesenteriet variere i et tilsvarende mønster. De ileale grener av mesenteriske arterie og vene var det mest lett identifiseres gjennom anatomiske landemerker. Ved å finne cecum og følge ileocecal fold til sin endestasjon på venstre side av mesentery, dette er nær avslutningen av kranie mesenteriske arterie 15. Arealet av lengre mesenteriet (betegnet flensen) og forlengelsen av ileocecal fold (unik for den bovine dyr) 16 laget sampling over mange dyr svært repeterbare. En av de større fallgruver som kan gjøres er at denne fasen av bioassay. Mekanisk strekking har en stor negativ innvirkning på etterfølgende fartøy pYtelse 14 og forskeren vil merke at fartøy som er overdrevent manipulert eller strekkes under fjerning og påfølgende rengjøring ikke vil svare på referanseforbindelsen som brukes. Dette er dessverre den eneste måte å virkelig evaluere kvaliteten av den vaskulære preparat på en funksjonell nivå og fartøyer som ikke svarer til KCl skal ikke betraktes som ytterligere for generering av pålitelige data.
To andre metode validerings trinn (ikke vist) som førte til den siste metoden presentert heri var bruken av andre kjemikalier som referanseforbindelser og å teste levedyktigheten til blodårene etter 24 timers lagring. Noradrenalin og serotonin ble evaluert som referanseforbindelser, men svar av mesenteriske arterie og vene ble for variabel over skipstype og på tvers av dyr for dem å bli brukt med hell. Omvendt, tilsetning av 120 mM KCl resulterte i en svært reproduserbar respons på tvers av både arterie og vene preparater. ALSO, arterie og vene respons ble evaluert dagen for innsamling og revurderes 24 hr innlegg samling, og det var ingen forskjell i agonist respons av enten arterie eller vene. Dette var et viktig aspekt ved den biologiske metode, så er det ofte et stort antall behandlinger (eller ulike behandlings kombinasjoner) som kan anvendes, men forskere er begrenset av plassen på myograph og tid. Ved å utvide perioden med levedyktighet ut 24 timer fra samlingen, er det tid for ytterligere eksperimentering økt sterkt.
Det er viktig for forskeren til å forstå den fleksibiliteten av behandlingsstrukturen påføres denne bioassay. En forsker kan legge til en hvilken som helst forbindelse som i inkuberingsbuffer at han eller hun er interessert i kronisk eksponere blodkarene for å kontrollere noe av biologisk relevante eller som en behandling (i tilfelle av Klotz et al. 17, ble dette gjort med laterale saphenous årer kontinuerlig utsatt for ketanserin, som motvirket en serotonin reseptor av interesse). Mesentriske blodårer kan bli forbehandlet med en forbindelse av interesse før gjennomføring av en kontraktil respons eksperiment. Den bioassay, som presenteres, er designet for å gjennomføre en kumulativ konsentrasjon respons eksperiment ser på ergotalkaloider som agonister og om før kosten eksponering for ergotalkaloider påvirket vaskulær respons 18. De representative resultater viser at denne metoden kan produsere en målbar vaskulær respons og bare fire konsentrasjoner ble brukt til å oppnå dette. I tilfelle av Egert et al. 18, var det opptil 10 forskjellige konsentrasjoner som brukes til å konstruere en responskurve. Denne metoden er en metode for å evaluere et stort antall forskjellige forbindelser eller reseptorer på blodårer fra et enkelt dyr i et lite tidsvindu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Omtale av varenavn, egenutviklede produkt, eller spesifisert utstyr utgjør ikke en garanti eller garanti av USDA og innebærer ikke godkjenning til utelukkelse av andre produkter som kan være tilgjengelige.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner Ryan Chaplin og Dr. Gregg Rentfrow ved University of Kentucky Meats Lab og Institutt for husdyr og matvitenskap for å gi muligheter for å samle eksperimentelle vev utnyttes her.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi Myograph | Danish Myo Technologies | 610M | A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice. |
| Powerlab 8/sp | ADIntruments | ML785 | |
| LabChart 7 | ADInstruments | Version 7 | |
| Force Calibration Kit | Danish Myo Technologies | 100055 | Specific to DMT myographs |
| Bottle-top Filter | Nalgene | 595-4520 | 0.22 μm pore size; 45 mm neck size |
| #5 Jewler’s Forceps | Miltex | 555008FT | Any brand of forceps can be used |
| Noyes Iris Scissors | Miltex | 18-1510 | Any brand of scissors can be used |
| Dissecting Scope | Zeiss | Stemi 2000-C | Any brand of dissecting light microscope will suffice |
| Adjustable Tissue Matrice | Braintree Scientific | TM C12 | This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly |
| Krebs-Hensleit Buffer | Sigma-Aldrich | K3753-10x1L | It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich | C7902-500G | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Desipramine-HCl | Sigma-Aldrich | D3900-5G | |
| Propranolol-HCl | Sigma-Aldrich | P0884-1G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| 95% O2/5% CO2 | Scott Gross | UN3156 |
References
- Matheson, P. J., Wilson, M. A., Garrison, R. N.
- Dobson, A. Blood flow and absorption from the rumen. Quarterly journal of experimental physiology. 69, 599-606 (1984).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
- Nielsen-Kudsk, F., Poulsen, B., Ryom, C., Nielsen-Kudsk, J. E. A strain-gauge myograph for isometric measurements of tension in isolated small blood vessels and other muscle preparations. Journal of pharmacological. 16, 215-225 (1986).
- Mulvany, M. J., Aalkjaer, C. Structure and function of small arteries. Physiological reviews. 70, 921-961 (1990).
- Klotz, J. L., et al. Assessment of vasoconstrictive potential of D-lysergic acid using an isolated bovine lateral saphenous vein bioassay. Journal of animal science. 84, 3167-3175 (2006).
- Klotz, J. L., Bush, L. P., Strickland, J. R. A vascular contractility bioassay using bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 1944-1951 (2011).
- Westendorf, M. L., et al. In vitro and in vivo ruminal and physiological responses to endophyte-infected tall fescue. Journal of dairy science. 76, 555-563 (1993).
- Strickland, J. R., et al. Board-invited review: St. Anthony"s Fire in livestock: causes, mechanisms, and potential solutions. Journal of animal science. 89, 1603-1626 (2011).
- Eckert, H., Kiechel, J. R., Rosenthaler, J., Schmidt, R., Schreier, E. Ch. 11. Ergot Alkaloids and Related Compounds. B, B. erde, HO, S. child , Springer-Verlag. (1978).
- Rhodes, M. T., Paterson, J. A., Kerley, M. S., Garner, H. E., Laughlin, M. H. Reduced blood flow to peripheral and core body tissues in sheep and cattle induced by endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 69, 2033-2043 (1991).
- Foote, A. P., Harmon, D. L., Strickland, J. R., Bush, L. P., Klotz, J. L. Effect of ergot alkaloids on contractility of bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 2944-2949 (2011).
- Foote, A. P., et al. Ergot alkaloids from endophyte-infected tall fescue decrease reticuloruminal epithelial blood flow and volatile fatty acid absorption from the washed reticulorumen. Journal of animal science. 91, 5366-5378 (2013).
- Hocking, K. M., et al. Detrimental effects of mechanical stretch on smooth muscle function in saphenous veins. Journal of vascular surgery. 53, 454-460 (2011).
- Smith, D. F.
- Budras, K. D., Habel, R. E. Bovine Anatomy An Illustrated Text. , first, Schlütersche GmbH and Co. KG, Verlag and Druckerei. (2003).
- Klotz, J. L., et al. Antagonism of lateral saphenous vein serotonin receptors from steers grazing endophyte-free, wild-type, or novel endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 91, 4492-4500 (2013).
- Egert, A. M., Kim, D. H., Schrick, F. N., Harmon, D. L., Klotz, J. L. Dietary exposure to ergot alkaloids decreases contractility of bovine mesenteric vasculature. Journal of animal science. 92, 1768-1779 (2014).
