Summary
Тонкая кишка часто подвергаются воздействию токсинов, которые могут повлиять приток крови и отрицательно повлиять усвоение питательных веществ. Использование multimyograph и брыжеечной артерии и вены изолирует, соединения или токсины, представляющие интерес может пройти обследование на вазоактивности.
Abstract
Млекопитающих желудочно-кишечные системы постоянно подвергаются соединений (желательных и нежелательных), которые могут оказать влияние на приток крови к и от этой системы. Изменения в кровоток в тонком кишечнике может привести к воздействию на поглотительной функции органа. Особый интерес в токсинов, освобожденных от кормов через ферментативных и пищеварительных процессов сложилась в жвачных животных, как области, где производительные эффективность может быть улучшена. Видео, связанные с данной статье описывается биопробы в пробирке, разработанный для скрининга соединений для вазоактивности в изолированных сечений бычьего брыжеечной артерии и вены с использованием multimyograph. После того, как кровеносные сосуды монтируются и уравновешивали в миографа, сам биологический анализ может быть использован: как инструмент скрининга для оценки сократительной реакции или вазоактивности соединений, представляющих интерес; определения присутствия типов рецепторов путем фармакологически ориентации рецепторы с конкретной агонистас; определения роли рецептора с наличием одного или нескольких антагонистов; или определить возможные взаимодействия соединений, представляющих интерес с антагонистами. В течение всего этого, данные собираются в режиме реального времени, ткани собирали из одного животного может подвергаться воздействию большого количества различных экспериментальных процедур (преимущество в пробирке), и представляет собой сосудистую по обе стороны от капиллярного русла, чтобы обеспечить точное картина того, что может происходить в афферентной и эфферентной кровоснабжения поддерживающей тонкую кишку.
Introduction
Изменения кровотока к кровати ткани может иметь большое влияние на функции органов. Основная функция тонкой кишки является питательной поглощения. Артериальная приток крови к поглощающей поверхности кишечнике необходим для поглощения питательных веществ и кровоток увеличивается, чтобы помочь в абсорбции питательных веществ, как еды движется вдоль поверхности 1. Уменьшение кровотока может привести к снижению абсорбции питательных веществ за счет уменьшения в трансэпителиальной градиента 2. В дополнение к питательных веществ, тонкой кишки также могут подвергаться вторичных метаболитов, наркотиками или токсинами, которые оказывают влияние на локализованной кровотока в брыжейки. В случае жвачных животных, соединения могут быть освобождены от корма (например, питательные вещества, такие как аминокислоты или токсины, такие как алкалоидов спорыньи) через ферментативных процессов передней кишки. Если эти соединения выжить микробного метаболизма рубца брожения, они теперь доступны для поглощенияили взаимодействие, так как они проходят через желудочно-кишечный тракт животного.
Есть целый ряд различных методов, доступных для измерения потока крови в естественных условиях (например, доплеровского ультразвукового, пребывающего расходомеры крови, меченных радиоактивным изотопом микросферы, и методы Индикатор-разведение), которые позволяют оценить различных экспериментальных сценариев или лечения. Однако, чтобы получить информацию о механических и фармакологических свойств гладких мышцах сосудов, методы остались ограничивается крупных сосудов до Mulvany и Халперн 3 не опубликована статья, описывающая способ связи, использующий провод монтируется препараты сосудистого кольца в миографа. Так как развитие этой техники, модификации продолжают быть внесены в соответствующие системы миографа которые позволяют множество различных приложений для оценки трубчатых структур. Система также была адаптирована для использования фиксированных стержней для монтажа крупные суда 4, где перфузииметоды не желательно.
Из различий в сосудах из различных анатомических происхождении и различиях в тех же судов из разных видов животных, данные судна и типа животного не может быть легко экстраполированы на различных судах или же судна в различных типах животных 5. Следовательно, отдельные биоанализы должны быть разработаны и утверждены в любое время эти аспекты будут изменены. Недавно несколько биоанализы были разработаны с этими технологиями для использования в скота боковая подкожной вены и правой рубца артерия и вена 6,7.
Это биопроб был разработан специально, чтобы исследовать эффекты, что алкалоиды спорыньи иметь на сосудистую сеть, поддерживающей тонкий кишечник. Было сообщено, что 50-60% от подаваемых алкалоидов появляются в abomasal содержания, но только 5% из них восстановлено в Кале 8. Стрикленд и др. 9 говорится в обзоре алкалоидов спорыньи, что доступный Sugg данныхПредполагаемое что тонкая кишка может быть самым важным местом для поглощения ergopeptine. Эккерт и др. 10 отзывы биофармацевтических аспекты алкалоидов спорыньи и заявил, что, как только они пересекают эпителиальный барьер, алкалоиды спорыньи транспортируются либо лимфатической системы в подключичную вену или через брыжеечной вены и в портальной крови. Родос и др. 11 сообщили об уменьшении кровотока в двенадцатиперстной кишке и толстой кишки в бычков потребляющих высокий эндофитов-инфицированных (высокая алкалоид спорыньи) диеты. С помощью правой артерии и вены биоанализ рубца, Фут и др. 12 показано, что алкалоиды спорыньи являются сосудоактивный в рубце сосудистой. Foote и соавт. 13 впоследствии показали, что в естественных рубца воздействие алкалоидов спорыньи приводит к снижению потока рубца эпителиальных крови. Это уменьшение притока крови к поглощающей поверхности рубца одновременно вызывает снижение питательных веществ (летучих жирных кислот) потока. Учитывая Куantity из алкалоидов спорыньи, проходящих на тонкой кишки от передней кишки; было высказано предположение, что будет происходить аналогичный эффект на тонкой кишки сосудистой и поглощения питательных веществ. Это потребовало разработки крупного рогатого скота проксимального подвздошной брыжеечной артерии и вены биотестирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры, используемые в этом исследовании не требуют утверждения в Университете Кентукки уходу и использованию животных комитета, потому что не использовались живые животные. До коллекции любого образца, используемого в данном документе, все животные были ошеломлены с пленной болта и обескровлены. Это было проведено в федерально проверяемого мясожирового объекта в Университете штата Кентукки. Официальный представитель контролю безопасности продуктов питания Министерства сельского хозяйства США наблюдается все мероприятия, которые имели дело с живым животным и обработки туши.
1 Подготовка приборостроения
- Чтобы свести к минимуму количество времени между коллекциями образцов тканей на начало эксперимента, настроить оборудование и подготовить буферы до сбора экспериментальной ткани (или, если дополнительный персонал доступны, эти задачи могут происходить одновременно).
Примечание: Это не только обеспечивает наибольшее количество времени, которое остается жизнеспособной ткани для проведения экспериментов, но некоторыеЭксперименты могут работать в течение длительных периодов времени (или есть желание завершить несколько экспериментов в день), поэтому, как правило, желательно, чтобы начать как можно раньше. - Включите связан компьютер, приобретения данных оборудования, водяная баня (для буфера (ов)) и миографа блок (ы). Поместите калибровочный оборудование на миографа блока (блоков) и включите миографа тепла (предустановки до 37,5 ° C) и позволяют единиц и калибровки оборудования для нагревания до заранее температур.
- Откройте ранее созданную настройки программного обеспечения Chart файл на компьютере и начать работать (но не получения данных).
- Разминка оборудования в течение 10 мин.
- Начните сбор данных.
- Нулевой все каналы.
- Проверьте, и провести калибровку (при необходимости) на каждом канале (4 канала на multimyograph) стандартизировать электрический сигнал, подаваемый от соответствующего датчика силы, связанной с этого канала на 2-г силы, поставляемой сертифицированной веса.
- После калибровки и преобразования единиц будут завершены, хранить все последующие данные в граммах. Измените соответствующим образом на основе желаний каждого отдельного лаборатории; оборудование и программное обеспечение позволяют использовать другие единицы, например, мН и вольт.
- Убедитесь, что газовые линии четкие завалов и включите газоснабжения (95% O 2/5% CO 2) в миографа (ы) единиц. Постоянно Газ все буферов (в миографа камер) в течение всей процедуры.
- Заполните все миографа камеры с 70% этанола и замочить на 10 мин, удаляя этанол, и повторите для второго 10 мин замочить.
- После удаления этанола, промыть три раза деионизированной водой, после чего три цикла полоскания с подготовленной буфера (смотри раздел 2 для приготовления буфера), в результате чего третье добавление буфера в камерах.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент оборудование может бездействовать в этом состоянии до тех пор, буфер и ткани не получают и персонал готов приступить к экспериментальт.
- После удаления этанола, промыть три раза деионизированной водой, после чего три цикла полоскания с подготовленной буфера (смотри раздел 2 для приготовления буфера), в результате чего третье добавление буфера в камерах.
2 Получение буферов
- Подготовить 1 л Кребса-буферный раствор для использования в транспортировке и переработке образцов тканей для достижения конечных концентраций 11,1 мМ D-глюкозы; 1,2 ммоль MgSO 4; 1,2 ммоль KH 2 PO 4; 4,7 мМ КСl; 118,1 мМ NaCl; 3,4 мМ CaCl 2; 24,9 мМ NaHCO 3.
- Смешайте 9,6 г Кребса солей в примерно 900 мл деионизированной воды на магнитной мешалки.
- Соединение в 0,373 г дигидрата хлорида кальция с последующим 2,1 г бикарбоната натрия в л буфера желаемой.
- Буферный раствор газа в течение 20 мин с 95% O 2/5% CO 2.
- После отравления газами, отрегулировать рН до 7,05 (фильтрация буфера увеличивает рН; конечная цель рН должен быть 7,4) и регулировать громкость до 1 Л.
- Фильтр не стерилизуют буфера в чистую автоклавного 1 л бутылки и медиа-магазина буфере при 4 ° С до готовности к использованию.
- Подготовьте отдельный Кребса-Henseleit буферный раствор для использования в экспериментах миографа как описано на стадии 2.1 для транспортировки Кребса-буфере с дополнительными соединениями, которые относятся к сократимость экспериментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно 2 л хватит для экспериментов, описанных в этой статье, но этот объем может потребоваться быть увеличена или уменьшена на основе длины эксперимента, количество миографа камер, и число буферных замен (по отношению к дополнений лечение).- До газообразования стадию (схема 2.1.3), добавьте 9,1 мг (на л буфера готовится) дезипрамина-HCl буфера.
- Приготовьте 1,0 мкМ раствор пропранолол-HCl и добавить 1 мл (на л буфера готовится) этого раствора в буферном растворе Кребса-. Сделайте этот буфер на день использования и держать на миографа рабочих температур (температуры, которая дает C температуру 37,5 ° в миографа).
Примечание: дезипрамин добавляется для подавления механизмы обратного захвата биогенных аминови позволяют очистку экспериментальных дополнений из буфера купание кровеносные сосуды, происходит более быстро. Добавление пропранолол препятствует неспецифического связывания соединений лечения в β-адренорецепторов.
3 Сбор и подготовка сосудистой
- Как можно скорее снимите желудочно-кишечный тракт от туши. После того, как животное больше не проявляет никакого непроизвольное рефлекс, не снять голову и скрыть, а затем поднять тушу вертикально. Удаление желудочно внутренностей (пищевода в анус) от туши должна быть завершена к сертифицированной бойне персонала (<20 мин, время от оглушения).
ПРИМЕЧАНИЕ: Как скоро, как правило, ограничивается расположения / объекта, где кишечный тракт собираемой от и стандартных операционных процедур или федеральной утвержденных процедур с последующим персонала установки.- В большинстве объектов, проводить манипуляции желудочно-кишечного трактав отдельном месте от обработки туши, которой суждено войти в поставку продовольствия. Используйте неподалеку удобным расположением, где желудочно-кишечного тракта могут быть приняты и распространиться на экспертизу.
- После того, как желудочно-кишечный тракт распространено, определить тонком кишечнике, илеоцекальный раз соединительный тонкой кишки к слепой кишке, подвздошной и фланец, проходящий проксимально по отношению к илеоцекального раза (фиг.1А).
- Использование скальпель или нож, очень легко сделать разрез в брыжеечной мембраны в центре подвздошной фланца. Использование двух указательных пальцев, тупо отсечь жира и соединительной ткани, раскрывающую брыжеечной сосудистой (Рисунок 1В).
- От этого фланца или выпуклость в кишечном брыжейки, рассекать из нескольких филиалов (~ 2 см в длину) из открытых пучков брыжеечной артерии и вены, которые поддерживают эту часть подвздошной кишки (Рисунок 1C).
- Если ипеть щипцы понять ткани, заботиться, чтобы не схватить прямо или тянуть на кровеносные сосуды вообще, удаляя их как любого рода растяжения может повредить и отрицательно повлиять производительность ткани 14. Удаление кровеносных сосудов лучше всего делать путем резки на каждом конце секции должны быть удалены, а затем резки вдоль или параллельно теперь изолированной секции. Для простоты, удалить некоторые из окружающих тканей вместе с судов, чтобы обеспечить некоторые ткани захватить с парой щипцов.
- С парой щипцов, погрузить образец ткани в пробирку, содержащую охлажденного льдом буфера Кребса-и хранить на льду до обработки не может произойти в лаборатории.
- Поместите образец ткани на режущей поверхности или в чашку Петри и частично погрузить в охлажденном льдом Кребса-.
- Использование # 5 ювелиров щипцы, Нойес диафрагмы ножницы, и увеличительное лампу или рассечения сферу (2,5 к 5.0x увеличением достаточно), тщательно отсечь окружающий жира и connectiве тканей и отделить артерию и вену. Определение отверстие емкости на одном конце раздела и тщательно усвоить фасции, окружающую корпус с пинцетом.
- Сделайте разрез с ножницами параллельно судна, сдвинув кончик ножницами под поднятым фасции. После первоначального разреза, жира и соединительной ткани могут быть дополнительно отделяется от судна, сокращая обе стороны с ножницами. Убедитесь, что сосуды как можно более чистым, минимизируя количество времени сосуды потратить на скамейке.
- Возвращение кровеносные сосуды трубок свежем буфере Кребса-и хранят при температуре 4 ° С (образцы могут по-прежнему сохраняется до 24 ч после сбора и до сих пор производят действительные данные сократимости).
- Используя лезвие, ломтик судно будет использоваться в миографа в нужное число 2-мм разделов (это полезно использовать ткани слайсер получить последовательные сечения).
- Исследуйте каждый раздел при вскрытии ШОСре (12.5X увеличения), чтобы гарантировать, что каждая секция не имеет аномалии, филиалов, клапаны, или поверхностное повреждение по неосторожности сделали во время вскрытия и очистки. Замените раздел сосудов, есть ли нарушение, филиал, клапан, или поверхностное повреждение.
- Храните приемлемые нарезанные участки сосудов (погруженные в Кребса-буфера) на льду или при 4 ° С до готовности для монтажа в миографа камер (обычно <30 мин).
- Аккуратно установите судно на миографа вставив опоры через просвет и увеличить натяжение (используя микроподвижки на миографа) будьте осторожны, чтобы не растянуть сосуды выше 2 до 3 г чтения.
- После того, как все камеры покрыты, вакуум буфер из всех камер и залить 5,0 мл буфера и начать 15 мин таймер, чтобы начать периода уравновешивания и эксперимент.
4 Эксперимент
- Равновесие все разделы сосудов в течение 1,5 часа, чтобы достичь стабильных резтин натяжение 1,0 г.
- Замените инкубационном буфере Кребса-каждые 15 мин.
- Во время установления равновесия, постоянно регулировать натяжение секций кровеносных сосудов до 2 г, а затем позволить, чтобы расслабить до примерно 0,80 г. Старайтесь не позволяют судам расслабиться слишком много (они могут соскользнуть с опоры). Попробуйте добиться стабильного базового напряжения, в котором судно держит 1 г напряженность, не требуя корректировки.
- Во время установления равновесия, приготовить водный 1,32 М раствор KCl, которые будут использоваться в качестве ссылки.
- После завершения удовлетворительного равновесия, добавьте 500 мкл 1,32 М раствора KCl, чтобы привести к 0,12 М раствора в 5,5 мл раствор, омывающий судна.
- После добавления в 1,32 М KCl, не регулировать натяжение вручную, как максимальный ответ от этого того используется для оценки жизнеспособности ткани и могут быть использованы для нормализации данных о лечении (например, реакции концентрации на Аgonist).
- Замените буфер в 15-минутными интервалами, пока напряжение не вернется к исходному значению 1,0 г.
- После того, как базовый достигается, изменить буфер и одновременно начать 1 мин таймер. Сделайте это для всех камер одновременно, чтобы избежать ошеломляющие из времени начала.
- Vortex стандарт для добавления и подготовить комментарий для камеры 1 в течение 1 мин обратного отсчета.
- Добавить стандартам в 25 мкл аликвоты каждой камеры в качестве эксперимента диктует (это ведет обработку ниже 0,5% от общего объема).
- Когда последний стандарт был добавлен, начать 9 мин таймер.
- В конце 9 мин стандартной инкубации удалить обработки, содержащей буфер из камер и добавить 5,0 мл свежего буфера, и начать 2,5 мин таймер.
- Повторите шаг 4.4.4.
- В конце второй промывки 2,5 мин, вакуум в камерах и добавить свежий буфер, и начать 1 мин таймер обратного отсчета на возбуждение SECONд стандартной добавки.
- Продолжайте этот цикл для всех стандартных добавок дня.
- Во время окончательного стандарта того и последующего 9 мин инкубации подготовить 1,32 М KCl эталонного соединения для конец отчетного выполнения дозы добавлением 500 мкл.
- После интервале 1 мин после последнего добавления обработки, добавить KCl и начать 9 мин таймер.
Примечание: KCl дополнение для подтверждения жизнеспособности тканей при завершении эксперимента и является полезным, если введение лечение, которое приводит к пренебрежимо малой ответ. - В заключительной 9 мин эталонным соединением инкубации, пропылесосить или удалить буфер из всех камер. Не добавляйте свежий буфер. Заключить эксперимент.
- Сохранить файл Chart, удалить разделы кровеносных сосудов и утилизировать надлежащим образом, и следовать очистить протокол (предоставляется изготовителем и может быть лаборатория конкретных) для миографа оборудования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Кровеносные сосуды, используемые для генерации включены результаты были получены от 6 голштинской бычков (425 ± 8 кг) в течение 3-недельного интервала. Пример типичной брыжеечной вены сократительной реакции на KCl и дополнений обработки увеличения концентрации представлена на рисунке 2. Величина ответа, которые изменяются с размером судна (коррелирует с размером животного-донора), но может также влияния (отрицательно) с неправильным обращением (растяжения) судов во время сбора и очистки. Таким образом, важно, чтобы наблюдать значительное сократительный ответ на воздействие сосуды, чтобы KCl. Если пренебречь реакцию наблюдают и в этой точке, это не желательно, чтобы продолжить дальнейшее в порядке с этим судна. Как видно на 9 мин инкубационных периодов на рисунке 2, есть дополнительные увеличивается в ответ, соответствующие с увеличением концентраций. Хотя желательно, чтобы этот учаулар опытно-конструкторских, он не всегда может происходить или быть востребованы с другими методами лечения. KCl, добавление в конце эксперимента, хотя и не используется в обработке данных, собранных, очень важно, поскольку это подтверждает жизнеспособность ткани в конце экспериментального периода (становится более важной, если судно не отвечает на любое из дополнений лечения).
Данные, представленные на рисунке 2, отражаются в граммах напряжения. Важно нормализовать эти данные, чтобы минимизировать любое животное к животному и судно-судно вариации. Таким образом, в дополнение к использованию в качестве индикатора жизнеспособности, максимальный отклик KCl, используется для нормализации всех дополнений лечения. Это генерирует данные сократительной реакции в виде процента от максимального KCl. Это, как кривые брыжеечной артерии и вены реакции на повышение концентрации 5-гидрокситриптамина (серотонина; фиг.3) и норэпинефрин ( Брыжеечной ответ вены и к 5-гидрокситриптамина (рисунок 3) и норадреналина (рисунок 4) начинал как отрицательные значения. Это является результатом коррекции максимального напряжения, записанной в течение 9 мин каждого инкубационного периода на базовой напряжения, записанного до первоначального KCl того. Это коррекция базовой линии гарантирует, что любые незначительные различия в напряженности не включены в анализ и позволяют данные, представленные для отражения только изменение напряженности. Отрицательные результаты Значение от кровеносного сосуда спокойного и опустившись ниже базовых уровней до KCl перед последующим добавлением лечения. Это особенно распространено в венозных образцах, где начальные концентрации лечения или агониста слишком низкой, чтобы вызвать реакцию сократительную. Это был не тот случай для меня ответ senteric артерии либо биогенного амина, который провел напряженность выше базовой линии, пока судно не начали реагировать на дополнений лечения. Это различие является примером различия в судах по обе стороны от капиллярного русла и почему они оба были рассматриваться как часть этого биотестирования. Это биоанализа могут быть использованы для оценки вазоактивности соединений по кровеносных сосудов, снабжающих питательных веществ в тонкой кишке, а также кровеносные сосуды, несущие питательные вещества, поглощенные от тонкой кишки. Данные на рисунках 3 и 4 представляют собой простые примеры того, как это может быть достигнуто. В случае 5-гидрокситриптамина (рисунок 3), не было разницы в артериальной или венозной ответ сократительной. С другой стороны, ответ на сократительную брыжеечной вены в возрастающих концентраций норадреналина был больше, чем у брыжеечной артерии. фигура 1 "FO: контент-ширина =" 3in "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52020 / 52020fig1highres.jpg "ширина =" 300 "/>
Рисунок 1:. Пример бычьего кишечного тракта, используемого в качестве источника мезентериальных сосудов красный звездочка означает видимую часть илеоцекального раза во всех трех панелей в качестве точки отсчета. (А) Весь тракт с красным овалом, указывающей подвздошной фланец, где произошла выборки сосудов. (B) Выдержка из брыжеечной сосудистого русла. (C) Iris ножницы указывая на открытой филиала брыжеечной вены (видна) и артерии (не виден) только до сбора. 
Рисунок 2: Пример концентрации отклика брыжеечной вены в возрастающих концентраций норадреналина (1 × 10 -7 до 1× 10 -4 М). Большие события в начале и конце трассы являются ответами на 0,12 М KCl дополнений. Красный прямоугольник означает регион сбора данных, соответствующий с 9 мин инкубационного периода для каждого лечения того. В 3 стройные шипы, которые следуют этой артефакты, порожденные замены буферных и не включены в анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 3: Среднее сократительные ответы брыжеечной артерии (МА) и вены (MV, N = 6 бычков) до возрастающих концентраций 5-гидрокситриптамина (серотонина) Показывать коэффициенты были получены с использованием нелинейного регрессионного анализа, чтобы соответствовать данным в сигмоидальной. Концентрация гesponse кривая, которая используется следующее уравнение: у = снизу + [(верх - низ) / (1 + 10 (LogEc 50 - х))], где верх и низ являются процент 120 мм KCl максимальное сократительной реакции на плато, и ЕС 50 является молярной концентрации алкалоида, вызывающую 50% максимальной реакции KCl. 
Рисунок 4: Среднее сократительные ответы брыжеечной артерии (МА) и вены (MV, N = 6 бычков) в возрастающих концентрациях норадреналина линии, показанные были получены с использованием нелинейного регрессионного анализа, чтобы соответствовать данным в сигмоидальной кривой отклика концентрация которых используется. следующее уравнение: Y = снизу + [(сверху - вниз) / (1 + 10 (LogEc 50 - х))], где верхняя и нижняя являются процент 120 мМ KCl максимальной Contractile ответ на плато, и ЕС 50 является молярная концентрация алкалоида, дающей 50% максимальной реакции KCl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Первоначальная задача в развитии этой биотестирования стало создание повторяемой пункт сбора для брыжеечной сосудистой. Пример последовательность сайта имеет решающее значение, так как некоторые из функций кишечника небольшое изменение во время перехода от тощей кишки через подвздошную кишку и, следовательно, брыжейки различаются по аналогичной схеме. Подвздошной ветви брыжеечной артерии и вены были наиболее легко идентифицировать с помощью анатомических ориентиров. При размещении слепой кишки и после илеоцекальный раз в ее конце на левой стороне брыжейки, это рядом с прекращением краниальной брыжеечной артерии 15. Площадь более брыжейки (называется фланец) и расширение илеоцекального раза (уникальный для бычьего животного) 16 сделал выборку через многочисленных животных очень повторяемых. Одна из больших ошибок, которые могут быть сделаны в этой фазе в биопроб. Механическая растяжения имеет большое негативное влияние на последующее сосуда рнаилучших показателей 14 и исследователь заметит, что суда, которые чрезмерно манипулировать или растянутые во время удаления и последующей очистки не будет реагировать на эталонное соединение используется. Это, к сожалению, это единственный способ по-настоящему оценить качество сосудистой подготовки на функциональном уровне и судов, которые не отвечают на KCl не следует рассматривать в дальнейшем для разработки надежных данных.
Два других шагов проверки метод (не показаны), которые привели к окончательному методу, изложенному в данном документе были использование других химических веществ в качестве эталонных соединений и тестирования жизнеспособности кровеносных сосудов следующий 24 ч хранения. Норадреналин и серотонин были оценены в качестве эталонных соединений, но ответы на брыжеечной артерии и вены были слишком переменная по типам судов и через животных, чтобы они были успешно использованы. С другой стороны, добавление 120 мМ KCl привело к очень воспроизводимым ответ на оба артерию и вену препаратов.РБП, артерии и вены ответы были оценены день сбора и перепроверены 24 часов после сбора и не было никаких различий в ответ агониста любой из артерии или вены. Это был важный аспект биологического анализа, так как часто большое количество обработок (или лечения различных комбинациях), которые могут быть применены, но исследователи ограничены места на миографа и времени. По продления срока жизнеспособности из 24 часов из коллекции, время для дополнительного экспериментирования значительно увеличивается.
Важно, чтобы исследователь понимать гибкость структуры обработки, примененной к этому биоанализа. Исследователь может добавить любое соединение к инкубационного буфера, что он или она заинтересована в хронически подвергая кровеносные сосуды для того, чтобы контролировать то из биологической значимости или в качестве лечения (в случае Klotz и соавт. 17, это было сделано с боковые подкожных вен постоянно подвергаются воздействию кеtanserin, который испортил серотонина рецептор интереса). В брыжеечных сосудов может быть предварительно обработан соединением интерес до проведения эксперимента сократительной реакции. Биологический анализ, представленный, был разработан, чтобы провести кумулятивный эксперимент отклика концентрация глядя на алкалоидов спорыньи, как агонистов и будь предварительного пищевого воздействия алкалоидов спорыньи, пострадавших сосудистую реакцию 18. Представительные результаты показывают, что этот метод может производить измеримое сосудистую реакцию, и только четыре концентрации были использованы для достижения этой цели. В случае Egert и др. 18, насчитывалось до 10 различных концентрациях, используемые построить кривую отклика. Этот способ представляет собой способ оценить большое количество различных соединений или рецепторами на кровеносных сосудах из одного животного в небольшой промежуток времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Упоминание торговой маркой, фирменным продуктом, или указанного оборудования не является основанием для гарантии со стороны Министерства сельского хозяйства США и не подразумевает одобрение исключения других продуктов, которые могут быть доступны.
Acknowledgments
Авторы признают, Райан Чаплин и доктор Грегг Rentfrow из Университета Кентукки Мясные Lab и Департамента животноводства и продовольственных наук для предоставления возможности собрать экспериментальные ткани, используемые в настоящем документе.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi Myograph | Danish Myo Technologies | 610M | A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice. |
| Powerlab 8/sp | ADIntruments | ML785 | |
| LabChart 7 | ADInstruments | Version 7 | |
| Force Calibration Kit | Danish Myo Technologies | 100055 | Specific to DMT myographs |
| Bottle-top Filter | Nalgene | 595-4520 | 0.22 μm pore size; 45 mm neck size |
| #5 Jewler’s Forceps | Miltex | 555008FT | Any brand of forceps can be used |
| Noyes Iris Scissors | Miltex | 18-1510 | Any brand of scissors can be used |
| Dissecting Scope | Zeiss | Stemi 2000-C | Any brand of dissecting light microscope will suffice |
| Adjustable Tissue Matrice | Braintree Scientific | TM C12 | This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly |
| Krebs-Hensleit Buffer | Sigma-Aldrich | K3753-10x1L | It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich | C7902-500G | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Desipramine-HCl | Sigma-Aldrich | D3900-5G | |
| Propranolol-HCl | Sigma-Aldrich | P0884-1G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| 95% O2/5% CO2 | Scott Gross | UN3156 |
References
- Matheson, P. J., Wilson, M. A., Garrison, R. N.
- Dobson, A. Blood flow and absorption from the rumen. Quarterly journal of experimental physiology. 69, 599-606 (1984).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
- Nielsen-Kudsk, F., Poulsen, B., Ryom, C., Nielsen-Kudsk, J. E. A strain-gauge myograph for isometric measurements of tension in isolated small blood vessels and other muscle preparations. Journal of pharmacological. 16, 215-225 (1986).
- Mulvany, M. J., Aalkjaer, C. Structure and function of small arteries. Physiological reviews. 70, 921-961 (1990).
- Klotz, J. L., et al. Assessment of vasoconstrictive potential of D-lysergic acid using an isolated bovine lateral saphenous vein bioassay. Journal of animal science. 84, 3167-3175 (2006).
- Klotz, J. L., Bush, L. P., Strickland, J. R. A vascular contractility bioassay using bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 1944-1951 (2011).
- Westendorf, M. L., et al. In vitro and in vivo ruminal and physiological responses to endophyte-infected tall fescue. Journal of dairy science. 76, 555-563 (1993).
- Strickland, J. R., et al. Board-invited review: St. Anthony"s Fire in livestock: causes, mechanisms, and potential solutions. Journal of animal science. 89, 1603-1626 (2011).
- Eckert, H., Kiechel, J. R., Rosenthaler, J., Schmidt, R., Schreier, E. Ch. 11. Ergot Alkaloids and Related Compounds. B, B. erde, HO, S. child , Springer-Verlag. (1978).
- Rhodes, M. T., Paterson, J. A., Kerley, M. S., Garner, H. E., Laughlin, M. H. Reduced blood flow to peripheral and core body tissues in sheep and cattle induced by endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 69, 2033-2043 (1991).
- Foote, A. P., Harmon, D. L., Strickland, J. R., Bush, L. P., Klotz, J. L. Effect of ergot alkaloids on contractility of bovine right ruminal artery and vein. Journal of animal science. 89, 2944-2949 (2011).
- Foote, A. P., et al. Ergot alkaloids from endophyte-infected tall fescue decrease reticuloruminal epithelial blood flow and volatile fatty acid absorption from the washed reticulorumen. Journal of animal science. 91, 5366-5378 (2013).
- Hocking, K. M., et al. Detrimental effects of mechanical stretch on smooth muscle function in saphenous veins. Journal of vascular surgery. 53, 454-460 (2011).
- Smith, D. F.
- Budras, K. D., Habel, R. E. Bovine Anatomy An Illustrated Text. , first, Schlütersche GmbH and Co. KG, Verlag and Druckerei. (2003).
- Klotz, J. L., et al. Antagonism of lateral saphenous vein serotonin receptors from steers grazing endophyte-free, wild-type, or novel endophyte-infected tall fescue. Journal of animal science. 91, 4492-4500 (2013).
- Egert, A. M., Kim, D. H., Schrick, F. N., Harmon, D. L., Klotz, J. L. Dietary exposure to ergot alkaloids decreases contractility of bovine mesenteric vasculature. Journal of animal science. 92, 1768-1779 (2014).
