Gli osteoclasti sono cellule che riassorbono l'osso principale nel corpo. La capacità di isolare osteoclasti in gran numero ha causato notevoli progressi nella comprensione della biologia osteoclasti. In questo protocollo, si descrive un metodo per l'isolamento, la coltivazione e quantificare l'attività degli osteoclasti in vitro.
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Articolo metodologico
Osteoclasti derivazione dal midollo osseo di topo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli osteoclasti sono cellule altamente specializzate che sono derivati dalla stirpe dei monociti / macrofagi del midollo osseo. La loro capacità unica di riassorbire sia le matrici organiche e inorganiche di osso significa che essi svolgono un ruolo chiave nella regolazione del rimodellamento scheletrico. Insieme, osteoblasti ed osteoclasti sono responsabili del processo di accoppiamento dinamico che coinvolge sia il riassorbimento osseo e la formazione ossea agendo insieme per mantenere lo scheletro normale durante salute e di malattia.
Poiché la cella di ossa riassorbimento principale del corpo, cambiamenti nella differenziazione o funzione osteoclasti possono provocare effetti profondi nel corpo. Malattie associate con la funzione degli osteoclasti alterata può variare in gravità da malattia neonatale letale a causa di fallimento per formare uno spazio osseo per emopoiesi, per osservare più comunemente patologie come l'osteoporosi, in cui un eccessivo riassorbimento osseo degli osteoclasti predispone alle fratture formazione. ent "> La capacità di isolare osteoclasti in quantità elevata in vitro ha permesso significativi progressi nella comprensione del ciclo di rimodellamento osseo e ha aperto la strada per la scoperta di nuove strategie terapeutiche che combattere tali malattie.
Qui, descriviamo un protocollo per isolare e coltivare osteoclasti da midollo osseo di topo che consentiranno di ottenere un gran numero di osteoclasti.
Introduzione
Il rimodellamento osseo è dinamico e prevede l'accoppiamento della formazione ossea con riassorbimento osseo 1. Questo processo strettamente regolato è responsabile del mantenimento dello scheletro durante omeostasi normale, e in risposta a lesioni e malattie.
Gli osteoclasti sono cellule multinucleate, unici che sono in grado di riassorbimento sia le matrici organiche e inorganiche di osso. Gli osteoclasti sono derivati dalla stirpe dei monociti / macrofagi del midollo osseo 2-5. Anomalie nella funzione o formazione di osteoclasti può provocare una varietà di patologie cliniche, incluse condizioni comuni come ....
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Protocollo
NOTA: Dichiarazione etica: Tutte le ricerche sugli animali vertebrati è stata eseguita in conformità protocolli approvati dal Pannello di Amministrazione di Stanford in laboratorio Animal Care (APLAC).
1. Preparazione
- Consentire 10 ml di mezzi di separazione gradiente di densità cellulare disponibile in commercio (che contiene polysucrose e sodio diatrizoato, regolate ad una densità di 1.077 g / ml) per venire a RT in una provetta conica da 50 ml.
- Preparare citometria a flusso (FACS) tampone con 1x tampone fosfato salino (PBS) e siero fetale bovino 2% (FCS). Prelevare un'aliquota di 50 ml e mantenere tale aliquota a TA per uso durante....
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Risultati
Lo scopo di questo metodo era di isolare facilmente un gran numero di osteoclasti in vitro, tipicamente in una settimana. Isolamento di successo di un gran numero di osteoclasti è stata confermata usando tartrato-resistente all'acido fosfatasi colorazione (Figura 1A). Grandi osteoclasti sono visualizzati come grandi cellule viola con più nuclei (tipicamente ≥ 3 nuclei). Usando questo protocollo, è comune per isolare osteoclasti con ben 30 nuclei per osteoclasti (Figura 1B).
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Discussione
La capacità di isolare facilmente e coltivare un gran numero di osteoclasti in vitro è stato responsabile per aver contribuito a promuovere la comprensione della biologia dell'osso e delle malattie degli osteoclasti-mediata. Era l'identificazione di RANKL che portano a questo, quando è stato recentemente identificato come il principale regolatore della formazione degli osteoclasti, differenziamento e la sopravvivenza 16-18.
E 'stata la nostra esperienza che la.......
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Dichiarazioni
Nessuno degli autori ha divulgazione o conflitto di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Riconosciamo il sostegno di borse di studio NIH R01 DE021683, DE019434 R01, U01 HL099776, della Fondazione Oak e il Laboratorio Hagey Pediatrica Medicina Rigenerativa.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MEM, senza glutammina, senza rosso fenolo | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, topo ricombinante | Gibco | PMC2044 | |
| Topo ricombinante TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli espresso) | R& D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandina E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Fosfatasi acida, kit di lekociti (TRAP) | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Piastre per riassorbimento osseo per osteoassay, piastre a 24 pozzetti | Corning Life Sciences | 3987 |
Riferimenti
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investi....
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Ristampe e permessi
