Osteoclasti derivazione dal midollo osseo di topo

Summary

Gli osteoclasti sono cellule che riassorbono l'osso principale nel corpo. La capacità di isolare osteoclasti in gran numero ha causato notevoli progressi nella comprensione della biologia osteoclasti. In questo protocollo, si descrive un metodo per l'isolamento, la coltivazione e quantificare l'attività degli osteoclasti in vitro.

Abstract

Gli osteoclasti sono cellule altamente specializzate che sono derivati ​​dalla stirpe dei monociti / macrofagi del midollo osseo. La loro capacità unica di riassorbire sia le matrici organiche e inorganiche di osso significa che essi svolgono un ruolo chiave nella regolazione del rimodellamento scheletrico. Insieme, osteoblasti ed osteoclasti sono responsabili del processo di accoppiamento dinamico che coinvolge sia il riassorbimento osseo e la formazione ossea agendo insieme per mantenere lo scheletro normale durante salute e di malattia.

Poiché la cella di ossa riassorbimento principale del corpo, cambiamenti nella differenziazione o funzione osteoclasti possono provocare effetti profondi nel corpo. Malattie associate con la funzione degli osteoclasti alterata può variare in gravità da malattia neonatale letale a causa di fallimento per formare uno spazio osseo per emopoiesi, per osservare più comunemente patologie come l'osteoporosi, in cui un eccessivo riassorbimento osseo degli osteoclasti predispone alle fratture formazione. ent "> La capacità di isolare osteoclasti in quantità elevata in vitro ha permesso significativi progressi nella comprensione del ciclo di rimodellamento osseo e ha aperto la strada per la scoperta di nuove strategie terapeutiche che combattere tali malattie.

Qui, descriviamo un protocollo per isolare e coltivare osteoclasti da midollo osseo di topo che consentiranno di ottenere un gran numero di osteoclasti.

Introduction

Il rimodellamento osseo è dinamico e prevede l'accoppiamento della formazione ossea con riassorbimento osseo ^1. Questo processo strettamente regolato è responsabile del mantenimento dello scheletro durante omeostasi normale, e in risposta a lesioni e malattie.

Gli osteoclasti sono cellule multinucleate, unici che sono in grado di riassorbimento sia le matrici organiche e inorganiche di osso. Gli osteoclasti sono derivati ​​dalla stirpe dei monociti / macrofagi del midollo osseo ^2-5. Anomalie nella funzione o formazione di osteoclasti può provocare una varietà di patologie cliniche, incluse condizioni comuni come ....

Protocol

NOTA: Dichiarazione etica: Tutte le ricerche sugli animali vertebrati è stata eseguita in conformità protocolli approvati dal Pannello di Amministrazione di Stanford in laboratorio Animal Care (APLAC).

1. Preparazione

1. Consentire 10 ml di mezzi di separazione gradiente di densità cellulare disponibile in commercio (che contiene polysucrose e sodio diatrizoato, regolate ad una densità di 1.077 g / ml) per venire a RT in una provetta conica da 50 ml.
2. Preparare citometria a flusso (FACS) tampone con 1x tampone fosfato salino (PBS) e siero fetale bovino 2% (FCS). Prelevare un'aliquota di 50 ml e mantenere tale aliquota a TA per uso durante....

Results

Lo scopo di questo metodo era di isolare facilmente un gran numero di osteoclasti in vitro, tipicamente in una settimana. Isolamento di successo di un gran numero di osteoclasti è stata confermata usando tartrato-resistente all'acido fosfatasi colorazione (Figura 1A). Grandi osteoclasti sono visualizzati come grandi cellule viola con più nuclei (tipicamente ≥ 3 nuclei). Usando questo protocollo, è comune per isolare osteoclasti con ben 30 nuclei per osteoclasti (Figura 1B).

Discussion

La capacità di isolare facilmente e coltivare un gran numero di osteoclasti in vitro è stato responsabile per aver contribuito a promuovere la comprensione della biologia dell'osso e delle malattie degli osteoclasti-mediata. Era l'identificazione di RANKL che portano a questo, quando è stato recentemente identificato come il principale regolatore della formazione degli osteoclasti, differenziamento e la sopravvivenza ^16-18.

E 'stata la nostra esperienza che la.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM, senza glutammina, senza rosso fenolo	Gibco	51200-038
M-CSF, topo ricombinante	Gibco	PMC2044
Topo ricombinante TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli espresso)	R& D Systems	462-TEC-010
Prostaglandina E2	Sigma-Aldrich
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Fosfatasi acida, kit di lekociti (TRAP)	Sigma-Aldrich	387A
Piastre per riassorbimento osseo per osteoassay, piastre a 24 pozzetti	Corning Life Sciences	3987