Summary
Nematoden sind Bodenbewohner-Rundwürmer, die eine Vielzahl von Insekten parasitieren. Wir zeigen, Stichprobenverfahren zur Isolierung dieser Nematoden aus dem Boden mit zwei Techniken: das Insekt Hetze und die modifizierte Weiß Falle, für die Gewinnung von Nematoden aus Bodenproben und infizierten Insektenkadaver auf.
Abstract
Nematoden (aka EPN) stellen eine Gruppe von Bodenbewohner-Nematoden, die eine Vielzahl von Insekten parasitieren. Diese Nematoden gehören zu zwei Familien: Steinernematidae und Heterorhabditidae. Bisher wurden mehr als 70 Arten in der Steinernematidae beschrieben worden, und es sind etwa 20 Spezies in der Heterorhabditidae. Die Nematoden haben eine Partnerschaft mit mutualistic Enterobacteriaceae Bakterien und zusammen sind sie als starke insektizide Komplex, der eine Vielzahl von Insektenarten tötet handeln.
Hierbei konzentrieren wir uns auf die am häufigsten verwendeten Techniken zum Sammeln von EPN Boden betrachtet. Der zweite Teil dieser Präsentation konzentriert sich auf die Insekten-Hetze Technik, einer weit verbreiteten Ansatz für die Isolierung von EPN aus Bodenproben, und die modifizierte Weiß-Trap-Technik, die für die Wiederherstellung dieser Nematoden aus infizierten Insekten verwendet wird. Diese Methoden und Techniken sind wichtige Schritte für die erfolgreiche Etablierung von EPN Kultnahmen im Labor und auch die Grundlage für andere Biotests, die diese Nematoden als Modellorganismen für die Forschung in anderen biologischen Disziplinen zu betrachten. Die in dieser Präsentation gezeigten Techniken entsprechen denen, durchgeführt und / oder entworfen von Mitgliedern der SP Auf Labor sowie diejenigen, die von verschiedenen Autoren beschrieben.
Introduction
Viele Nematoden mit Insekten verbunden, und ihre Wirt-Interaktionen reichen von Vorteil für schädlich. Hierbei konzentrieren wir uns auf eine Gruppe von Nematoden, die Krankheitserreger von Insekten sind, die auch als Nematoden (oder EPN) bekannt. Zwei Familien Nematoden gehören zu dieser Gruppe von Nematoden: Steinernematidae und Heterorhabditidae 11,13. Die pathogene Wirkung ist in der Tat durch ihre Interaktion mit fakultativ anaeroben Darmbakterien (Bakterien Xenorhabdus assoziieren mit steinernematids und Bakterien Photorhabdus assoziieren mit heterorhabditids) 2 erlassen. Die Bakterien werden von einem Host zu einem anderen Insekt von der einzigen frei lebenden Nematoden-Bühne, der dritten Stufe infektiöse juvenile (auch als dauer jugendlich, Jugend-oder Infektions IJ bekannt), die in der Erde lebt vektorisiert. Einmal in der Insekten, die Nematoden lösen die Bakterien in die Hämolymphe der Insekten, die die Insekten-Wirts durch massive Blutvergiftung zu töten. Die Bakterien auchdes Insekts Gewebe abbauen und sich der Nematoden Nahrungsquelle, so dass sie, um zu reifen und sich zu vermehren. Üblicherweise werden eine oder zwei Generationen wachsenen Nematoden im Insekten kadaver hergestellt. Die Nachkommen der letzten Erwachsenengeneration reassoziiert mit ein paar Bakterienzellen in eine Art und Weise zu spezialisieren, als ihre bisherigen Ernährungs Beziehung, und pflegen diese Zellen im Darm, als sie aus bewegen sich von der Insekten-Kadaver in den Boden, wo sie andere Insekten parasitieren zu erwarten 6,11,14 (Abbildung 1).
Seit ihrer Entdeckung im Jahre 1927, EPN wurden als wertvolle Alternativen zu chemischen Pflanzenschutzmitteln, da sie eine Vielzahl von Insekten, die landwirtschaftliche Schädlinge 3,4,5 sind parasitieren. Doch in den letzten zwei Jahrzehnten, diese Nematoden und ihre symbiontischen Bakterien wurden als formbar Modellsystem zur Untersuchung der biologischen, ökologischen und evolutionären Aspekte der Wirt-Mikroben-interactio anerkannt14 ns.
Das Ziel dieser Präsentation ist es, die Methoden und Techniken, die am häufigsten für Bodenproben und die Isolierung von EPN eingesetzt zu zeigen. Eine Vielzahl von Werkzeugen zur Verfügung und kann für das Sammeln von Bodenproben verwendet werden, einschließlich: Boden Loten, Spachtel, post-Erdbohrer, Schnecken, Probenahmerohre, Handschaufeln, unter anderem (Abbildung 2).
Je nach Zweck der Untersuchung können zwei Verfahren für die Probenahme berücksichtigt werden: a) geschichtet, b) Zufallsauswahl (Fig. 3). Die geschichtete Stichprobe wird üblicherweise als Teil einer intensiven Studie in einem bestimmten Bereich oder abgegrenzt über einen bestimmten Zeitraum verwendet wird. Im allgemeinen wird ein transect abgegrenzt und Bodenproben werden in festgelegten Abständen in der transect über einen Zeitraum (3A) 15 genommen. Die Zufallsstichprobe wird in der Regel eingesetzt, wenn die sich auf ein weites Gebiet. Dieses Probenahmestrategie ist für die Untersuchung der Vielfalt der EPN f verwendetrom einen großen geographischen Bereich oder die Region (3B) 12. Je nach Schwerpunkt der Studie, die eine breite Palette von Höhen-, Boden-Texturen und Lebensräumen (z. B.., Feldern, Wäldern, Wiesen, Parks, Stränden, Uferbereiche, etc.) kann eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden.
Wir zeigen die Insekten-Hetze Technik, die ursprünglich von Bettwäsche und Akhurst 1 beschrieben wurde, und stellt eine einfache und selektive Alternative für die Wiederherstellung EPN von Bodenproben. Dies ist ein selektives Verfahren, das auf der Prämisse, dass die Nematoden (IJ-Stufe) wird zu einem Insektenwirtszogen werden und parasitieren sie basiert. Diese Technik kann auch zur Isolierung von anderen Insektenpathogene wie Pilze, Bakterien und 8,10 zu berücksichtigen.
Wir haben auch die modifizierte Weiß-Trap-Technik, die für das Abrufen von Nematoden Nachkommen von infizierten Insekten 7,14 Hosts verwendet wird, zu demonstrieren. Dies ist eine mühe erfüllthod, die den Vorteil von Abrufen einer "sauberen" Nematoden Nachkommen frei von Schmutz von den erniedrigenden Insektenkadaver bietet.
Schließlich sind die beschriebenen und in diesem Artikel gezeigt Techniken entsprechen denen konzipiert und / oder im Labor als auch solche mit verschiedenen Kollegen und Mitarbeitern beschrieben.
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Protocol
1. Bodenprobenentnahme
- Betrachten Sie die eine Mindestfläche von 2 - 4 m 2 für jede Probennahmestelle.
- Sammeln von Bodenproben in einer Tiefe von mindestens 15 cm (Fig. 4).
- Nehmen Sie sich mindestens fünf Stichproben in diesem Bereich.
- Nehmen Sie 3 Teilproben pro Probe. Je nach Ziel der Studie entweder kombinieren die Teilstichproben oder bewahren Sie diese getrennt.
- Platzieren Sie jede Probe in einem Plastikbeutel. Betrachten Doppel Absacken zu Austreten von Proben (Abbildung 4) zu vermeiden.
- Label-Proben mit einem wasserfesten Filzstift. Fügen Sie die folgenden Informationen von jeder Probenahmestelle: Site-Informationen (einschließlich Ort / Raum / Site-Namen und GPS-Koordinaten-Informationen), Datum, Lebensraum, verbunden Vegetation, Temperatur, Höhe, usw.
HINWEIS: Falls zutreffend, sammeln und / oder aufzeichnen die Anwesenheit von Insekten oder anderen Wirbellosen mit der Probe zur späteren Identifizierung gesammelt. Sie können potenzielle natur stellenal EPN Gastgeber. - Saubere Sammel Werkzeuge zwischen den Proben durch gründliches Waschen mit Wasser und / oder Desinfektions sie mit 70% Ethanol oder 0,5% Bleichmittel-Lösung.
- Halten Proben in einem Kühler (8-15 ° C) während des Transports zum Labor.
- Nehmen Sie einen Teil der Bodenprobe für die Analyse von Informationen über Bodenbeschaffenheit, Beschaffenheit, Feuchtigkeit, elektrische Leitfähigkeit oder andere gewünschte Bodenparameter zu erhalten.
. 2 Nematode Isolierung aus Bodenproben: Insect-Hetze Technik
- Entfernen Sie alle Fremdkörper (dh., Steine, Holzstücke oder Rinde, Blätter, etc.) Mit Ihren Proben gesammelt, um eine Kontamination mit Mikroorganismen saprobischen vermeiden.
- Fügen Sie Wasser, um den Boden zu befeuchten und die Bewegung der Nematoden zu erleichtern.
HINWEIS: Verwenden Sie eine Sprühflasche, um die Feuchtigkeit der Erde langsam zu erhöhen. - Es werden ca. 200 bis 250 ml feuchten Boden an einem sauberen Kunststoffbehälter mit einem Deckel.
- In Insektenköder. Betrachten 5 bis 10 Insekten an der Bodenoberfläche jeder Probe (Abbildung 5).
- Bedecken Sie den Behälter mit einem Deckel und schalten Behälter auf den Kopf.
- Aufrechterhaltung Behälter im Dunkeln bei RT (es mindestens 22 - 25 ° C).
- Prüfen Behälter alle 2 - 3 Tage und entfernen abgestorbene Insekten.
HINWEIS: fügen Sie zusätzliche gesunde Insekten zu jedem Behälter zur weiteren Hetze der Bodenprobe. - Entfernen tote Insekten aus den Behältern. HINWEIS: Cadavers mit einem braunen oder ockerfarbenen Färbung in der Regel durch steinernematids parasitiert, während ziegelrot bis dunkelviolett Leichen werden von heterorhabditids parasitiert.
- Spülen Leichen in sterilem Wasser.
- Zeigen Leichen in einem modifizierten Weiß Falle zur Rückgewinnung von Nematoden Nachkommen (siehe Verfahren unten).
. 3 Nematode Erholung von Infected Cadavers: Modifizierte Weiß-Falle
- Setzen Sie die Spitze einer 50 (oder 60) mm Durchm. Petrischale in eine größere Schale (100 mm).
- Stellen Sie eine SündeGLE kreisförmigen Filterpapier (Whatman Nr. 1) in der kleineren Schale.
- Platz Leichen auf dem Filterpapier des kleineren Gericht dafür, dass Leichen nicht gegenseitig berühren, um Verunreinigungen zu vermeiden.
- Füllen Sie den äußeren (größeren) Petrischale mit ca. 20 ml steriles destilliertes Wasser. Kein Wasser in der Schale, die die Leichen hält nicht hinzu.
- Decken Sie die große Petrischale und seinen Inhalt mit dem Deckel (Abbildung 6).
- Beschriften Sie Gerichte entsprechend. Fügen Sie die folgenden Informationen: Name Nematode (Art / Isolat), Infektion (Datum Infektion wurde gesetzt) und Trap-Datum (das ist das Datum, die Falle aufgestellt).
- Halten Falle bei RT bis Entstehung von Infektionsjugendstadien (IJ) auftritt. 25 Tage abhängig von der Nematodenarten und / oder Belastung betrachtet - Dieser Prozess kann zwischen 10 nehmen.
- Ernte mit Wasser IJs durch Entfernen des größeren Spiegel der Falle und gießt Wasser mit Nematoden in ein Becherglas.
- Nematoden ermöglichen, um den Boden der Dekantier-bEaker. Dieser Vorgang kann einige Minuten dauern.
- Gießen Sie Wasser sorgfältig darauf achten, Nematoden im Boden des Bechers zu bleiben.
- Nematoden spülen, indem mehr Wasser und ermöglicht Nematoden zu dekantieren. 3-mal, bis das Wasser ist sauber - Dieser Schritt kann 2 wiederholt werden.
- Platzieren Nematodensuspension in einer Gewebekulturflasche (250 ml). Halten Konzentration der Suspension auf 1000 - 3000 Nematoden / ml.
- Speicher Kolben mit Nematodensuspension in einem Kühlraum oder Brutschrank zwischen 10 - 20 ° C.
Hinweis: Überprüfen Sie gespeichert Kolben periodisch Haltbarkeit von EPN ist variabel. Normalerweise steinernematids kann für 6 gespeichert werden - 12 Monate ohne die Notwendigkeit von Subkultur, während heterorhabditids kann mehr regelmäßige Kontrolluntersuchungen erforderlich.
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Representative Results
Bodenprobenentnahme
Dritten Stufe infektiösen jungen EPN sind die einzigen frei lebenden Stadien in diesen Nematoden-Lebenszyklus, die im Boden (Abbildung 1) befinden. Daher sammeln Bodenproben ist eine sehr effiziente Methode, um diesen Nematoden erholen. 4 zeigt ein Bodenprofil, der die Tiefe an dem Proben zu entnehmen. Erhaltung der Feuchtigkeit einer Probe ist ein Schlüsselfaktor für das Überleben der Nematoden. Folglich ist es wichtig, Bodenproben in Kunststoffbeuteln zu halten und sie bei kühlen Temperaturen während des Transports zum Labor (Abbildung 4).
Nematode Wieder
In der Natur sind Chancen, Insekten natürlich von EPN parasitiert weniger als 3%, es sei denn es ist eine Epidemie und eine größere Stichprobe von Insekten mit EPN Befall gefunden. Daher ist Hetze von Bodenproben mit Insekten eine bequeme ca.oach um die Erholung der EPN aus ihrem natürlichen Lebensraum zu verbessern. Abbildung 5 zeigt die Boden Hetze Technik. In diesem Fall wurde eine 250 ml-Kunststoffbehälter mit einem Schraubverschluß verwendet. G. 10 - ca. 250 g Boden wurden in den Behälter gegeben und 5 mellon Larven wurden auf die Oberfläche des Bodens (Fig. 5 rechts) aufgenommen. Nach 5 Tagen wurde der Behälter geöffnet, um tote Insekten mit Anzeichen von Infektion EPN abzurufen. Beachten Sie, Nematoden-infizierten Larven mit roter Färbung (Abbildung 5 links).
Figur 6A zeigt eine schematische Darstellung des modifizierten Weiß abzufangen. Fig. 6B zeigt den Aufbau der Falle. Beachten Sie, dass EPN infizierten Kadavern einander nicht, und dass Filterpapier berühren in der kleinen Petrischale bleibt trocken. 6C zeigt IJs, die aus Leichen. Beachten Sie die "Wanderwege" von Nematoden (IJ), die auf der Petrischale gebildet werden, wie sie sich zu bewegenwehrt das Wasser. Die Zeit für IJ Entstehung von Leichen ist in Abhängigkeit von Nematodenarten und auch abhängig von der Temperatur und der Feuchtigkeit, bei der die Weiß-Falle geführt wird. 6D zeigt IJs bereits im Wasser des größeren Geschirr dieser abzufangen. Beachten Sie, dass die Nematoden im Wasser sehen sauber und frei von Insekten-Gewebe.
Abbildung 1. Lebenszyklus von insektenpathogenen Nematoden.
Abbildung 2. Schaufeln und anderen Geräten zum Sammeln von Bodenproben eingesetzt. (A) Klassische Point-Schaufel. (B) Handschaufel. (C) Von links nach rechts: Viehmeyer Rohr, Kelle, oakfield Rohre, Bodenloten.
Abbildung 3. Bodenprobenstrategien. (A) Schicht. (B) Zufall.
Abbildung 4. Schematische Darstellung der Bodenproben-Strategie. Bild links zeigt ein Bodenprofil zeigt gewünschten Tiefe, in der Proben getroffen werden sollten. Bild rechts zeigt eine Bodenprobe in einem Plastikbeutel mit entsprechender Kennzeichnung.
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Abbildung 5. Beize von Bodenproben mit Insektenlarven. Bild rechts zeigt gesunden Larven, während Bild auf der linken Seite zeigt toten Larven nach einem 5-tägigen Zeitraum Hetze.
Abbildung 6. Schematische Darstellung (A) und Fotos (BD) eines modifizierten Weiß Falle. (B)-Trap einzurichten, (C) Nahaufnahme von infizierten kadaver zeigt IJ Entstehung, (D) close-up zeigt massiven Entstehung IJs von Leichen ins Wasser.
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Discussion
Dieser Nachweis ist der erste von zwei Darstellungen, die eine Reihe von Techniken, die häufig zur Untersuchung EPN und ihrer symbiotischen Bakterien verwendet werden, zu beschreiben. Diese Techniken stellen wichtige Schritte für die erfolgreiche Etablierung von EPN Kulturen im Labor und bilden auch die Grundlage für andere Biotests, die EPN als Modellorganismen für die Forschung zu verwenden.
Verschiedene Bodenuntersuchungen von EPN haben gezeigt, dass die Größe und Verteilung können über Jahreszeiten, Lebensräumen und geografischen Regionen 4, 5,9,15 variieren. Faktoren wie Bodenbeschaffenheit, Feuchtigkeit und Temperatur sowie Host-Verfügbarkeit können eine Schlüsselrolle in ihrer Verteilung zu spielen. Daher ist es wichtig, dass eine vorläufige Daten über die Umfrage. Sobald Proben genommen, ist es wichtig, sie so schnell wie möglich verarbeitet werden. Jedoch ist dies nicht die Möglichkeit, sie in einem Kühlraum oder einem anderen geeigneten temperaturgesteuerten Einheit gespeichert werden. Unterschiedliche Temperaturen kannzum Speichern Insektenköderbehälter je nach Herkunft der Proben berücksichtigt. Normalerweise sind kühlere Temperaturen (z. B.., 15 ° C) für den gemäßigten Proben und bei Proben aus tropischen Regionen betrachtet, wärmere Temperaturen (z. B.., 30 ° C) sind für die in Betracht gezogen.
Die Insektenköder Technik ist die am häufigsten verwendete Methode zur Rückgewinnung von EPN aus Bodenproben. Es ist eine praktische Strategie, die das Abrufen von EPN im Labor ermöglicht. Letzte Larven der größeren Wachsmotte Galleria mellon (Lepidoptera: Pyralidae) werden in der Regel als; jedoch sind andere Insekten Gastgeber (dh, Grillen, Mehlwürmer, Käferlarven, etc.) und / oder geeigneten Stufen berücksichtigt werden und empfohlen, zu verwenden. Einige Studien haben gezeigt, dass ein einzelner Extraktionszyklus des Galleria-Köder Methode ist häufig für die Bestimmung Anwesenheit von EPN in einer bestimmten Probe oder zum Extrahieren alle der EPN von Bodenprobe nicht ausreichends 15. Normalerweise variieren Gewinnungsraten zwischen 20 - 40% 12,15.
Eine Alternative zu der Köder von Bodenproben im Labor ist die Berücksichtigung von Ködern in situ. Dies ist die Platzierung von Insektenköder in der Probenentnahmestelle. In diesem Fall werden die Insekten in den Käfigen (üblicherweise aus einem Metall-oder Kunststoffgeflecht) angeordnet und in demarked Stellen im Untersuchungsgebiet für eine bestimmte Zeitdauer verlassen. Die Käfige mit den Insekten werden dann abgerufen und für EPN-Infektion untersucht. Jedoch ist dieser Ansatz arbeitsintensiv und zeitaufwendig 15.
Der Fadenwurm Fangtechnik wurde ursprünglich von White 10 entworfen und später von Kaya und Stock 6 modifiziert. Die Technik nutzt die Attraktion von Nematoden zu Wasser (dh positiv hygrotropism) und infektiöse Stadien der EPN frei von Insekten Geweben und / oder Schmutz erfolgreich erholt.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Vergangenheit Mitglieder der Auf-Labor bedanken: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta und Victoria Miranda-Thompson für ihre Beiträge zur Verbesserung der viele dieser Protokolle. Wir erkennen die National Science Foundation Förderung (Zuschüsse IOS-0840932 und IOS-0724978) auf SP Lager.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Galleria mellonella | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | For insect baiting technique |
| Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-048 | Infection chamber and White trap assembly |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-092 | Infection chamber and White trap assembly |
| 100 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-088 | Infection chamber and White trap assembly |
| ZIPloc plastic bags | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Mechanical pipettor P1000, P200 ml | VWR | 89130-562; 89130-566 | Infection chamber and White trap assembly |
| Pippetor tips 1000ml, 200 ml | VWR | 16466-004 ; 53510 | Infection chamber and White trap assembly |
| Bleach | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| Sodium hypochlorite | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling , disinfecting | |
| 70% Ethyl alochol | AAPER | 17212945 | Soil sampling , disinfecting |
| Shovels | Ace Hardware or local hardware store | N/A | Soil sampling |
| Tubular soil sampler | Accuproducts | Soil sampling | |
| Soil probe, long handle | Nupla | PRB4T 69401 Classic | Soil sampling |
| Measuring tape | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Flagging tape, various colors | Ace Hardware or local hardware store | Soil sampling | |
| Tissue culture flasks | VWR | Falcon, 29185-304 | White trap, collection of EPN |
| Wash bottles, polyethylene, wide mouth | VWR | 16650-107 | White trap, collection of EPN |
References
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