Introduction
脂质体已被广泛研究，并作为最生物相容性生物医学的药物递送系统的临床应用1,2之一。它们主要由磷脂和胆固醇，这两者都是生物相容的化合物模仿天然细胞膜份。而亲水性物质可在含水内部被截留，亲脂性试剂可以脂质体磷脂双层3内被引入。脂质体的含水内部中的封装的物质给予保护，防止降解在体内 ，也防止了主机系统从用于疾病的治疗的细胞毒性药物，例如化学治疗旨在破坏肿瘤细胞的毒性作用。脂质体表面与像聚乙二醇聚合物的修饰（PEG化）进一步延伸体内的脂质体的血液循环时间，由于空间位稳定4。 Moreov呃脂质体可隔离的高浓度的几种物质，如蛋白质5,6，亲水性物质7,8和酶9。因此，它们作为可靠的临床治疗和诊断工具，值得他们的批准用于递送细胞毒性药物，如阿霉素治疗癌症4。由于其灵活性，脂质体还可以装载有荧光染料用于诊断和图像引导手术目的。
荧光成像提供了一个高性价比的和非侵入体内诊断工具，但需要一些基本要求。它可以证明，这适合最适合于体内成像的荧光染料具有特征吸收和发射最大值在光分散和散射，以及组织自发荧光从水始发和血红蛋白是低的范围内。因此，这样的探针具有其650和900纳米之间10 ABS /青霉最大值。除此之外，无论是在体外和体内的荧光染料的稳定性是至关重要的，如调理作用和快速清除可大大限制了它们用于体内成像应用11。其他效果，例如差的稳定性和低灵敏度或观察与吲哚花青绿（ICG）12-16对靶器官的细胞毒作用，是不希望的，并用于体内成像设计探针时，必须考虑到。这些观察导致了若干临床前的近红外荧光染料，纳米颗粒以及用于体内成像的炎性过程，癌症和用于图像引导手术17-20新技术的积极发展。尽管大多数的临床前NIRF（近红外荧光）的稳定性的染料在体外 ，其通过肝脏和肾脏快速灌注和清除阻碍它们在疾病和炎症过程的体内光学成像的使用。
ntent“>因此，我们提出了一个协议对荧光染料的封装，如良好表征的近红外荧光染料DY-676-COOH，在脂质体以其倾向自淬火，在相对 高浓度的21，在高浓度的H-二聚体形成和/或PI-层叠荧光团分子的增加之间位于彼此的福斯特半径结果在荧光分子之间荧光共振能量转移（FRET）内的荧光团的分子之间的相互作用，在低浓度的空间中，从而防止PI-堆积作用和H-二聚体形成并导致高的荧光发射。高，低浓度和伴随荧光猝灭和激活之间的开关是一种很有前途的策略，可被利用为光学成像22上 。在这方面，封装的高浓度的NIRF染料的DY-676-COOH在脂质体的含水内部更发vorable用于体内成像比游离染料。该方法的挑战在于在正确的封装首先和其次，在从包封高浓度的染料产生的利益的验证。与游离染料与非淬火脂质体制剂与低浓度的染料的比较猝灭脂质体的成像特性，也是必不可少的。我们显示通过简单的，但高度有效膜水化和挤压协议结合交替冻结和解冻循环是DY-676-COOH的淬火浓度的脂质体中的封装是可行的。用于制备脂质体的其它方法，如逆相蒸发法23以及乙醇注入法24使脂质体制剂具有高包封率的许多亲水性的物质。然而，要被封装的物质的性质可以影响所述包封效率。实际上，这里介绍的薄膜水化和挤压协议揭示了DY-676-COOH的封装效率最高。为了说明DY-676-COOH，一个酵母多糖诱发的水肿模型，它允许在几个小时内的炎症过程的研究的脂质体包封的好处，被使用。这里，它被证明脂质体与高浓度的包封的DY-676-COOH是在炎症过程中比游离染料或未淬火脂质体制剂具有低染料浓度的体内光学成像更适合于全身。因而底层协议提供了一种简单而快速的方法，以产生荧光猝灭脂质体和在体外和体内的活化和成像潜在的有效性。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：所有的程序都是由区域动物委员会，并按照有关伦理使用动物的国际准则认可。
1.准备材料和仪器
- 自发形成囊泡分散液的制备（SFV）
- 溶解和制备原液以下磷脂：214毫克/毫升的蛋磷脂酰胆碱（EPC）134毫克/毫升胆固醇，122毫克/毫升1,2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- -N - [甲氧基（聚乙二醇）-2000]（铵盐）（MPEG 2000 -DSPE）和2毫克/毫升1,2-dioleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- -N - （7-硝基2-1,3苯并恶-4-基）（铵盐）的氯仿，并存储在玻璃小瓶（NBD-DOPE）。
- 提供大约3毫升氯仿在一个圆底烧瓶中并磷脂原液适当量转移到圆底烧瓶中，制备脂质体的EP组成C：澈：的mPEG 2000 -DSPE以6.5的摩尔比：3：0.5。脂质体双荧光标记添加0.3％（摩尔）NBD掺杂到脂质的解决方案。
- 蒸发从减压（300毫巴）在55℃下使用旋转蒸发器将有机磷脂溶液中的氯仿。
- 后，形成均匀的磷脂膜，降低压力至10毫巴1-2小时，以除去残留的氯仿存款。
- 而氯仿蒸发，溶解DY-676-COOH（6.181微米）在10毫米的Tris缓冲液pH 7.4，并填写与液氮杜瓦瓶。接通超声波浴设定在50℃。
- 传送DY-676-COOH（6.181微米）溶液到圆底烧瓶水合干燥的磷脂膜和涡大力直到自发形成囊泡（SFV）分散形式的适当体积（0.5-1毫升）中。确保所有的磷脂的分散，以避免脂质损失。
- 仔细TRAnsfer圆底烧瓶含有SFV分散到液氮中并冷冻的分散3-5分钟。放置在圆底烧瓶中进在50℃的超声波浴中解冻该分散体然后旋涡振荡分散大力为1-2分钟。重复此步骤，六次，总共七个冻融循环。
- SFV挤压，形成均匀的脂质体囊
- 转移SFV分散到1ml注射器（注射器-a）和使用LiposoFast-基本挤出成注射器-b至100纳米的聚碳酸酯膜挤出的分散体。
- 挤出从注射器-b中的分散性，回注射器一个，然后重复该循环10次。由于挤压，在从一个模糊的外观，以清晰的色散随时间的变化注射器的解决方案。经过十次（20单挤压步骤）从设备中取出注射器b和挤出分散从注射器直接上一次进入无菌1.5毫升反应管中。
- 脂质体的净化封装DY-676-COOH免费染料
- 准备使用浸泡在10mM Tris缓冲液pH 7.4（柱长28厘米，直径0.8厘米）G25珠的柱色谱纯化。
- 传送0.5毫升挤出囊泡分散体到凝胶床并且让样品漏极到凝胶基质中。
- 洗脱用10mM Tris缓冲液pH为7.4（ 图1A）的脂质体和完全洗柱直至游离染料下水道出列。如果需要的话，收集并根据制造商的说明通过脱盐和脱水循环的游离染料。
- 通过超速离心（200000×g离心2小时，在8℃）浓缩该洗脱的脂质体，然后它们分散在无菌的10mM Tris缓冲液的pH值，7.4足够体积。
- 封装DY-676-COOH浓度的定量
- 通过溶解DY-676-COOH（0，82，124准备校准曲线，247，494，988纳米）在10mM Tris缓冲液，pH 7.4中含有0.1％的Triton X100。
- 溶解的脂质体的2微升（的50毫摩尔/升的库存100纳摩尔最终脂质）中5分钟，在室温下，在含有1％Triton X100的破坏囊泡和释放包封的染料加入100μl的Tris缓冲液中。然后稀释用10mM Tris缓冲，pH为7.4至0.1％的最终的Triton-X100浓度样品（V / V）制备1毫升的总体积。准备好所有的样品一式两份。
- 测量所有样品的吸收和发射（免费DY-676-COOH和Triton-X100处理的脂质体）在激发λ= 645 nm和发射λ= 700纳米。建立和使用游离染料的校准曲线来确定包封染料的浓度。
- 脂质体的表征
- 确定脂质体通过动态光散射的大小和ζ电位。稀释的脂质体的样品与过滤灭菌（0.2微米）的10mM Tris缓冲液pH 7.4到交流oncentration 100-300微米（脂）。传送稀释的样品置于低体积一次性杯，并根据制造商的说明测量样品。
- 通过电子显微镜表征脂质体根据标准方法来证明脂质体囊泡的大小，完整性和均匀性。
2.验证荧光淬灭，并准备脂质体的激活
- 荧光猝灭和激活的理化分析
- 准备两个1.5毫升管的唇-Q和2管免费DY-676-COOH。传输100纳摩尔总脂质（2.38微升的42毫摩尔/ L的唇-Q原液，含有包封的DY-676-COOH的138微克/毫升）成相应的管中。自由转会DY-676-COOH相当于唇-Q的染料含量（0.38微克导致例如，从138微克/ 1000微升2.38 X微升唇-Q使用）。孵育1桶每个探针在4℃下的e和冻结第二管在-80℃下过夜（16小时）。
- 升温的加热块至30℃。填用碎冰冷却箱和平衡的10毫摩尔Tris缓冲液pH 7.4的等分试样至室温。
- 从4℃除去探针和在室温下平衡（用铝箔包裹以避光），并迅速解冻探针-80℃，在30℃下进行5分钟。将它们转移至室温（也包在铝箔避光保护）之前寒意在冰上解冻的探针1分钟。
- 添加的10mM Tris缓冲液（pH7.4）中，以各探针的100微升最终体积并平衡所有的探针在RT 10分钟。
- 吸管80微升每种探针的进入低容积的玻璃比色杯中，并从上一个分光计400-900毫微米测量每个探测器的吸收。将探头返回到其相应的管中。
- 转移80微升每个探针到合适的玻璃比色杯并测量通过激励探针上的荧光分光光度计的荧光发射在674 nm和从694-800纳米测量荧光。
- 细胞吸收和荧光激活
- 根据标准条件（37℃，5％CO 2和95％潮湿气氛）得到并培养在其相应的培养基以下细胞系。这里，使用鼠巨噬细胞系J774A.1（Dulbecco改良的Eagle培养基补充有10％（V / V）胎牛血清），人成胶质细胞瘤细胞系，U-118MG（含有必需的维生素和10％MEM（体积/ ⅴ）胎牛血清）和人纤维肉瘤细胞系HT-1080（RPMI，用5％FCS）中。
- 外套8孔腔室载玻片用聚L-赖氨酸（添加100微升0.001％聚-L-赖氨酸，以每孔，并孵育在37℃下进行10分钟。吸溶液并让室载玻片干涸至少4小时，在RT在无菌工作台，冲洗玻片3用200μlHank氏缓冲盐溶液次直到需要再密封它们与石蜡和铝箔，并储存在4℃。
- 而该腔室载玻片枯竭，直到需要过滤消毒脂质体和染料溶液，并储存于4℃。
- 探头摄取分析全身体内 NIR荧光成像系统，准备5个小培养瓶每个3测试细胞系（15瓶计）。种子2×10 6 J774A.1 U-118MG和每个培养瓶中的HT-1080细胞用5ml各自的培养基中（在五元组），并生长16-24小时。平行于培养瓶中分别接种30,000个细胞每个细胞系（J774A.1和HT-1080）或20,000个细胞（U-118MG）至2孔腔室载玻片中生长和在500μl培养基中16-24小时。
- 第二天，加入唇-Q 100纳摩尔（脂质终量），以每细胞系，并在腔室载玻片每个细胞系的一个孔2烧瓶中。立即传输每个细胞系1烧瓶至4℃，并在第二个烧瓶回培养箱。
注：该探针的量添加到该烧瓶中，并在腔室玻片是相同的，使得上腔室玻片的浓度高10倍（5毫升是500微升培养基）。这是必要的，因为微观检测比在来自瓶中的细胞沉淀被成像的近红外荧光成像系统较不敏感。 - 添加游离DY-676-COOH在相当于唇-Q的染料含量的细胞中每个细胞系，并在腔室载玻片每个细胞系的一个孔2烧瓶的浓度，然后立即传送每个细胞系1烧瓶至4℃（能量消耗），并一起另一烧瓶与腔滑动回到培养箱中。孵育所有细胞24小时，在相应的条件。将细胞在烧瓶中不含探针用作未处理的对照。
- NIRF成像和半定量分析
- 经过24小时培养的持续时间，通过用Hanks洗涤细胞2次收获细胞在烧瓶缓冲在500μl管盐溶液（HBSS），然后通过离心（5分钟，在200×g离心）刮去细胞在500μl的HBSS和沉淀。
- 放置管子与细胞小球（和HBSS）在一个NIRF成像和图像使用滤波器对激励（615-665纳米）和发射（切> 700纳米）。
- 扣除自体荧光，并根据制造商的说明书评估靶的强度与自体荧光。这会给荧光强度作为平均信号（定标计数/秒），这代表缩放对于曝光时间，相机增益，分级和比特深度后计数的水平，从而使该测量是在彼此之间可比较的半定量水平。
- 共聚焦显微镜分析
- 经过24小时培养后，洗涤2次，用500μL的HBSS收获上腔室载玻片中的细胞。
- 修复了CELLS用含有3.7％（V / V）的甲醛进行30分钟，在室温加入200μlHBSS中。
- 而固定是怎么回事，淡化色斑DNA，赫斯特-33258 1:50安装解决方案。
- 固定后，洗涤细胞2次用HBSS，然后从玻璃载片分开的腔室。添加包含在对应于所述腔室玻片的孔中的每个点的DNA的染色50μl的安装方案。覆盖细胞用玻璃盖玻片，密封透明指甲油和风干10分钟边在室温（暗）。
- 在合适的荧光显微镜或共焦显微镜图像的细胞。用于相应部件的可视化下面的激发和发射设置：原子核（赫斯特-33258：激发405纳米，发射420-480纳米）。 NBD-DOPE（脂质体脂质：激发488纳米，发射530纳米）。 DY-676-COOH（NIR荧光染料：激发波长633-645，650-700的发射波长）。
注：确保荧光显微镜vailable配备合适的过滤器，允许激发波长和发射超过630纳米高。
3.脂质体为基础的炎症活体荧光成像
- 动物和材料的制备
- 房子8-12周龄雄性NMRI小鼠体重与食物和水随意在标准条件下约36克
- 实验开始七天前，让所有小鼠的低脱镁叶绿饮食，以减少组织自发荧光。
- 每个实验开始二十四小时之前，剃小鼠在期望区域（ 例如，整个如果后腿水肿成像所需的背部区域）。
- 称重动物并计算探针的量将每只小鼠（LIP-Q和唇dQ的以10微摩尔（脂质浓度喷射）每公斤体重和自由DY-676-COOH（相当于染料的唇-Q使用的内容） 。
- 图像中的动物全身NIR荧光成像器与用于细胞沉淀相同的设置。这种测量提供了动物的自发荧光。
- 溶解10毫克酵母聚糖-A在1ml等渗盐水溶液和过夜储存于4℃。
- 诱导炎症和体内 NIRF成像
- 准备每只小鼠3注射器包含以下解决方案。填充1注射器用50μl酵母聚糖A溶液（10毫克/毫升）和第二注射器用50μl等渗盐水溶液。与探针，即唇-Q和唇-DQ（10微摩尔/ kg体重（脂肪））被指定为试验动物和免费DY-676-COOH（集中在唇-Q）控制动物填补第三注射器。确保探针用无菌HBSS稀释至150微升最终体积。
- 适用于动物的眼睛眼霜以避免干燥，麻醉动物用2％异氟醚，直到他们都深深睡着了，在爪子触摸时没有反应（这大约需要2分钟）。
- 放置在鼠标上的暖垫（仍在麻醉）和注入的右后腿的酵母聚糖A溶液皮下和在左后腿的盐溶液。立即静脉注射探头和图像的动物之后再注入/测量记录时间（T = 0小时）。保存生成的图像作为图像数据集，并重复上述步骤，对所有其他动物和相应的探针。
- 图像中的动物，每2小时，10小时后喷射，然后在24小时后喷射，确保在测量室的阶段是温暖（例如，通过将暖垫下方），为了避免低温。每次测量后，将动物的食物和水随意一个笼子里，放在笼中温带动物室。安乐死的动物通过首先麻醉用2％异氟烷，直到动物不再反应以触摸，然后用二氧化碳安乐死5-10分钟，使得确保动物停止呼吸完全尸僵发生。
- 根据该可在线评估器官的标准协议（http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/）和图像解剖小鼠。
- 根据制造商的说明，通过首先扣除动物（去混合），然后分配的自体荧光的兴趣（左后腿与盐水）和发炎区域的目标荧光（右后腿与酵母聚糖-A）中的区域的整体荧光评估测量结果。
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Representative Results
高浓度的荧光染料，如这里所使用的脂质体的含水内部的NIRF染料DY676-COOH的封装导致荧光猝灭的一个高的水平。荧光猝灭，这种现象可见有许多荧光团以高浓度，可以利用几种体内成像应用，其中一个高灵敏度的目标区域的可靠的检测要求较高。使用脂质体还提供了保护，这是不可缺少的用于体内应用的染料。脂质体的彻底的表征是必要的，包括几个因素，如染料包封，稳定性和脂质体的大小，荧光猝灭和体外包封染料的活性，也适用于体内成像的目的的程度。游离染料的比较，DY-676-COOH和猝灭脂质体（唇-Q），以及一个非淬火脂质体（唇DQ）具有非常低的concent包封的染料的配给因此特别适用于在体内表征的关键。
制备用薄膜水化和挤压技术与连续冷冻和解冻循环挤出前脂质体含有残余游离的染料分子可以从由于其较长保留在凝胶过滤基质的脂质体可以成功地分离出，相比于其中洗脱较快的脂质体（ 图1B）。根据凝胶过滤后的稀释水平，可选超速离心步骤使脂质体的所示（ 图1C）的浓度。基于包封染料的吸收和发射特性，包封染料的浓度与游离染料（ 图1D）的校准曲线的帮助下确定的。除了包封染料的浓度，它以确定的脂质体尾部的尺寸和均匀性是很重要的呃准备。正如图1E，制备底层方法的脂质体的电子显微镜照片揭示脂质体囊泡的大多单层的形态，含有囊内DY-676-COOH或者淬火的浓度范围内（LIP-Q; 606-846微米的DY-676 ），或在非调质染料浓度（LIP-DQ; 25μMDY-676）。此外，他们揭示的约120nm和多分散性指数远低于1（ 表1）的均匀的粒度分布。由于荧光猝灭，唇-Q示出了两个最大吸收在含水缓冲液中，由此一个峰的特征在于向蓝波长的移位。在与此线，相对于游离的染料（ 图2A和B， 右 ）的荧光发射是非常低的。冷冻损害的脂质体的结果，在色素，这将会稀释在周围溶液的释放。蓝移吸收峰，因此迪sappears，造成唇-Q的单一吸收峰。与此相应，增加了冷冻损坏唇-Q荧光强度可以看到的，这表明释放的染料分子的该荧光活化发生。游离染料揭示只有单个最大吸收和高的荧光强度而保持在同一水平，而不论冷冻（ 图2A和B中， 左边 ）。这一发现表明在脂质体中，该染料的封装，如在唇-Q将保护染料从环境，保持高浓度和相关的荧光猝灭并且如果由目标触发器激活将使检测由于增加的荧光。
脂质体探针与底层脂质成分显示它是由能源枯竭抑制一个主要的巨噬细胞吞噬。这可以通过对唇-Q的摄取由高度吞噬鼠巨噬细胞系J774A.1中可以看出，与轻度吞噬的U-118MG人类成胶质细胞瘤细 胞系，在37℃，并抑制在4℃（ 图3A和B）。游离染料DY-676-COOH揭示摄取的吞噬细胞系都在37℃，并在4℃下这表明脂质体探针唇-Q不含有残余游离染料在溶液中，并且只能进行活性摄取。共聚焦激光扫描显微图像进一步充实的唇-Q在吞噬细胞（ 图3C）的摄取和激活。此外，由于缺乏荧光在非吞噬人纤维肉瘤细胞系HT-1080指示的唇-Q的摄取主要是通过吞噬作用，因此，将适用于炎症的成像吞噬的单核细胞/巨噬细胞参与其中。
符合见于培养的细胞系的脂质体的巨噬细胞吞噬，而且由于荧光猝灭静脉注射的唇-Q导到一个时间在水肿的小鼠模型（ 图4A， 唇-Q）的荧光强度依赖性增加，具有非常低的背景荧光。水肿的最大荧光强度检测8-10小时后注射唇-Q。相反，比较强的近红外荧光的整个鼠标的应用自由DY-676-COOH（ 图4A，DY-676-COOH）或始终在线脂质体，唇-DQ（ 图4A， 唇dQ的后可见）。相比唇-Q快速灌注和自由DY-676-COOH的间隙从0-4小时后喷射所看到，干扰成像，使得可靠检测水肿是不可能的（ 图4A，DY-676-COOH ）。此外，该非调质的脂质体，唇dQ的揭示水肿在2-4小时后喷射而几乎保持恒定，直至8小时的最大荧光，然后逐渐减小类似于猝灭唇-Q基水肿荧光。进行半定量肛门yses，由此感兴趣的区域（ROI的）是为水肿对背景设置，可以做出关于不同水平的检测与不同的探针的结论。根据每个组（探针）5只动物的半定量分析，水肿可更显著（P = 0.001）与唇-Q检测比用游离DY-676-COOH或未淬火，唇-DQ（ 图4B）。
小鼠成像器官安乐死后24小时注射探针揭示肝/胆和肾脏和非常低的或没有荧光脾脏，肺和心脏（ 图5），其用作证据为消除轻度体外荧光通过肝胆途径的探针。
图1：DY-676-COOH加载脂质体的制备第（AC）的所涉及的合成步骤的示意概述。（A）的膜水化和挤压带的近红外染料DY-676-COOH的安装程序。（B）中的图片自制凝胶过滤设置表示相间的之间的非包封的（自由）的染料和脂质体。脂质体洗脱第一和出现蓝绿色由于包封的DY-676-COOH（蓝色）和并入的绿色磷脂，NBD-DOPE。（C）的脂质体沉淀（LIP-Q）代表的图像通过超速离心浓缩后。（ D）DY-676-COOH在10毫米的Tris pH值7.4（含1％的Triton X100）用于染料脂质体的量化。（E）的唇-Q低温，透射电子显微镜代表校准曲线。 请点击这里查看一个更大的版本的身影。
图2：物理化学测定荧光猝灭和激活在体外的唇-Q（右）和（A）的吸收光谱自由DY-676-COOH（左）在10mM Tris缓冲液pH 7.4测定前或在冷冻后- 80℃。注意的唇-Q特性双重峰相比自由DY-676-COOH和后唇-Q冷冻损伤的蓝移峰的消失。（B）的相应的唇-Q（右）的荧光发射光谱和自由DY-676-COOH（左）测定在10mM Tris缓冲液pH 7.4之前或在-80℃下冷冻后。
图3：唇部的细胞吸收和荧光激活 osomes，在图像（A）接触24小时，相应的探测器在指定温度后制备细胞团的近红外荧光成像。在HT-1080细胞没有生存在4℃24小时的潜伏期。棒图中的（B）分别表示荧光信号通过分配的ROI到细胞沉淀中答每个条形表示的n = 3的实验±标准差的平均强度得到了半定量水平。通过细胞在37℃暴露探头文化玻片24小时的激光共聚焦扫描显微镜收购（C）的图像。注意在高吞噬小鼠巨噬细胞株J774A.1的高水平的荧光和温和的荧光在温和吞噬人脑胶质瘤细胞系U-118MG。在非吞噬的HT-1080人纤维肉瘤细胞系没有显示荧光探针。 NBD-DOPE：绿色荧光磷脂。加载/ 52136 / 52136fig3highres.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看图的放大版本。
图4. 在小鼠酵母聚糖诱导的水肿的体内光学成像。（A）中左边的鼠标图为皮下的位置施加酵母聚糖A（500微克在50μl盐水中）和对照生理盐水溶液（50μl）左翼。静脉注射的指示探针和全身NIR荧光成像在所指示的时间点的揭示渐进的，但与在8小时后喷射的最大荧光效率已提高了唇-Q（上图）水肿和低背景信号的荧光信号。免费的染料显示在4小时后注射灌注和快速清除（中间窗格升），而唇dQ的揭示检测水肿的低信号强度和一个较高的总的背景荧光。在（B）中的图形表示重申与每个探针检测到的水肿相比，n中的控制区域（盐水）=每组5只动物所观察到的荧光信号。每个小区代表（N = 5）±SEM平均荧光信号。随着图形，水肿，每个探头检测到的最大荧光信号很容易区分（LIP-Q，8小时;唇-DQ 2-4小时，免费DY-676-COOH，2小时后注射）。有水肿唇-Q与唇-DQ在t = 0-24小时的显著（P = 0.001），较高的荧光强度，并用唇-Q与免费DY-676-COOH在t = 4-24小时。 请点击此处查看图的放大版本。
图5：从小鼠后24小时探针应用生物光学体外图像的器官 ，以及器官的荧光强度相应的半定量分析。每个条表示荧光强度的平均值（N = 4）±SEM。 请点击此处查看图的放大版本。
| 脂质体剂型 | 尺寸[纳米] | 多分散性指数（PI）的 | Zeta电位[毫伏] |
| 唇-DQ（dequenched） | 123.4±0.6 | 0.055±0.02 | -10.6±0.4 |
| 唇-Q（淬火） | 118.5±0.7 | 0.04±0.02 | -9±2 |
| 唇NBD（W / O DY-676-COOH） | 123.0±1.4 | 0.04±0.03 | -11±1 |
表1：脂质体通过动态光散射表征。
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Discussion
因为脂质体还可以作为递送系统用于荧光染料，它们使目标疾病的成像。高浓度的荧光染料如NIRF染料，这里使用DY676-COOH的封装导致截留染料的荧光淬灭的高水平。荧光猝灭，这种现象以高浓度看到的许多荧光团可被利用在几种体内成像应用，其中，具有高灵敏度的目标区域的可靠的检测被征求。使用脂质体还提供了保护，这是不可缺少的用于体内应用的染料。
薄膜水化和挤压技术是一种广泛使用的方法，该方法能够成功地制备视需要而定的不同尺寸范围的脂质体，并允许修改，如许多不同的物质25的封装。因此，它适合于唇部的制备osomes封装与近红外荧光染料，DY-676-COOH成像的目的。该方法得到的脂质体用600-840微米囊内染料浓度，这是染料的猝灭浓度范围内。用于自发形成囊泡分散体的均匀化的LiposoFast-基本手挤出机是适合的脂质体制剂在小的实验室规模，由于该装置的兼容性，用注射器达到1ml体积。对于大规模制备使用较大的高压均化器，其能够均匀小泡囊分散液的容量为1000升每小时，推荐。凝胶过滤（尺寸排阻）层析是保证从非包囊（免费）的染料分子26的脂质体包封的染料的分离的关键步骤。凝胶过滤柱的长度为脂质体的从游离染料有效地分离是至关重要的。因此，有必要准备的至少28厘米长吨的柱Ø成功地从这里免费使用DY-676-COOH分离脂质体。有趣的是，这个长度是2倍，只要其用于从游离羧基纯化羧基（CF）装入脂质体。凝胶过滤的主要缺点是五到六倍稀释纯化的样品。这可以通过超速离心得到补偿，如果需要高度浓缩的脂质体。在超速离心脂质体沉淀和上清液可以很容易地27被除去。其他的方法来集中脂质体，例如通过透析28顷更耗时比超速离心。
除了 薄膜水化和挤压方法，该反相蒸发法23以及乙醇注入法24使脂质体制剂具有高包封率的许多亲水性的物质。然而，我们的调查显示，电影水化结合冻融循环s至是最合适的方法DY-676-COOH的足够脂质体内包封。增加用于膜水合起始DY-676-COOH浓度增加的疗效和所述脂质体内染料，当30mm的固定的脂质浓度使用的浓度。尽管与冷冻和解冻方法本的包封效率是低于所用的起始染料浓度为10％，但却是足够的成像所需淬火浓度的封装。此外，游离染料，通过凝胶过滤从脂质体中分离可通过脱盐，并根据制造商的说明书脱水，使得重新封装可能的，并且整体最小染料损失可以回收。由底层协议的染料的封装具有的大小和脂质体的形态没有影响所看到的多分散性指数和唇-Q的电子显微照片。
几种简单的方法可以用来evaluatË准备荧光liposomes.DY-676-COOH的活性具有较高的倾向，自我淬火高浓度21,29可能是由H-二聚体的形成与染料分子之间的π堆积相互作用产生。这些相互作用，从而发生因染料分子在高浓度的福斯特半径的亲近，可以通过稀释30全军覆没。因此，高浓度的DY-676-COOH的封装不仅保护该染料从调理作用的体内 ，而且还从周围的缓冲液，从而保持其高浓度和保留其中，可以检测作为蓝移吸收荧光猝灭峰和如在图2中看到的低荧光发射。在-80℃下逐渐冻结脂质体导致了含水内部31，其造成损害的脂质体膜时贸然解冻，在30℃的范围内形成的冰晶。释放，稀释和荧光ACTI帧内脂质体DY-676-COOH的VATION在缓冲结冰显露在一个单一的吸收峰和后的荧光强度几乎增加2.5倍（ 图2），这表明，唇-Q从而螯合高，淬火浓度DY-676-COOH并激活。其他的方法来破坏脂质体的脂质双层，如使用的洗涤剂或有机溶剂没有揭示该自由染料和脂质体包封的染料之间明确的差异，因为它们都影响许多荧光染料32的光谱特性。缓慢冷冻和这里报告因此苛刻解冻方法作为更可靠的和有希望的方法来验证荧光团在脂质体中的高封装和随之而来的荧光淬灭。从完整的唇-Q（ 图2）的吸收光谱和发射光谱时，可检测残留荧光的某一水平。这会导致从脂内非淬火染料单体萨姆也从静电作用和封装染料的磷脂极性头组33的影响。
如可在图3中可以看出，唇-Q在高度吞噬小鼠巨噬细胞和中性细胞吞噬人类成胶质细胞瘤细 胞系能使堆积，U型118MG 34，而不是在非吞噬的HT-1080人纤维肉瘤细胞系，表示炎症的唇，Q-基于成像是有利的，因为吞噬细胞的炎症过程的关键球员。该能量耗尽废除的唇-Q摄取但不摄取游离DY-676-COOH的事实证实的唇-Q吞噬摄取的特异性和揭示了唇-Q在实验过程中保持完好，染料的其他释放和能源独立的摄取会发生，导致荧光检测。嵌入的绿色荧光磷脂，NBD-DOPE的脂质体双层使显微成像和discrimination的非降解细胞从退化的脂质体特别是如果时间依赖性摄取实验完成正如前面32报道。显微图像揭示的NIR荧光DY-676-COOH的，关联与细胞沉淀的荧光强度的水平，通过培养后半定量分析，在37℃的测定。按照这一点，在小鼠巨噬细胞系显示最高荧光，而在人脑胶质瘤揭示两者DY-676-COOH和NBD-DOPE比前者低荧光。正如预期的那样的人纤维肉瘤细胞系，HT-1080显示无荧光无论是脂质体染料或免费的DY-676-COOH，这加强了一个事实，即唇-Q的摄取，主要是通过吞噬。
调查潜在的唇-Q型吞噬驱动炎症体内成像，几个控件进行了审议。考虑到游离DY-676-COOH可以采取由phagocyt肌病，对唇-Q调理作用可能导致释放染料，其可以采取由吞噬细胞。为了避免这种情况，唇-Q制备用5％（摩尔）聚乙二醇化。此外，有必要摄取区分因炎症为基础的EPR效应和主动摄取和荧光活化。为了解决这个问题，评价和三种不同的探针，即始终在线，唇-DQ，淬火唇-Q和游离DY-676-COOH在小鼠酵母聚糖诱导的水肿的比较是必要的。这是从酿酒酵母和白色念珠菌的细胞壁制备酵母聚糖-A是细胞因子分泌的经由dectin-1的和toll样受体2/6（TLR 2/6）一个天然的兴奋剂。反过来分泌的细胞因子诱导其导致血管渗漏下游级联的活化，从而减轻了单核细胞/巨噬细胞的血管内/外渗从脾贮存35以及中性粒细胞，以及它们对炎症部位 的迁移（水肿），36-39。在酵母多糖为基础的单核/巨噬细胞外渗和迁移过程只需要4.5-6小时，这使得酵母多糖的研究炎症过程36-39的战略工具。由于炎症过程中导致血管渗漏，静脉注射探头既可以自己在迁移过程中采取了由单核/巨噬细胞（吞噬细胞）的炎症部位 或渗出，并采取了在水肿部位（EPR效应）40。利用未淬火唇-DQ的揭示一个整体强背景比唇部-Q水肿信号和水肿的荧光增加反映单核细胞和巨噬细胞的迁移。实际上，水肿最大荧光已经见到唇-DQ 2-4小时后应用和几乎保持不变，直到8小时。反对唇-DQ和唇-Q的自由DY-676-COOH经历快速灌注注射后4小时内被清除，从而使水肿鲜明成像是不可能的。在terestingly，在水肿的荧光强度和很低的背景信号持续增加使用唇-Q结果。在荧光强度与唇-Q这种持续增长归因于荧光活化脂质体释放染料。两者合计，可以得出结论，EPR效应在唇-Q基于成像的贡献是最小的，因为唇dQ的揭示的最大荧光（EPR效应和单核细胞的迁移），在4小时后喷射。因此，脂质体封装提供了保护和不同的递送DY-676-COOH，从而使能在水肿的体内成像的更可靠，内化和降解（荧光活化）通过吞噬细胞后完全的。到目前为止，使用的酵母多糖诱发的后腿水肿验证荧光脂质体的成像特性是新的。本文报道的协议既可由不同的荧光染料的封装和由成像不同的抑制DRU的影响扩大关于炎症的诱导GS，并且因此代表了制备和合适的生物医学成像探针表征的有用工具。
朝向限定合适的成像探针的另一个关键步骤是它们的药理学性质和消除路由的验证。探针在器官，在排泄起到至关重要的作用，如由这些器官中的肝脏和肾脏，以及它们的短的保留和合适的消除分布通常是一个指示，该探针将多可能显示对患者没有不利的影响。按照这一点，小鼠的器官制备后24小时注射的唇-Q或游离DY-676-COOH揭示肝/胆只有轻微荧光和肾脏，其通过表示一个优选消除脂质体荧光团的肝胆路线。在这些器官探头及其有效消除短期的住宿是由7 FOL证实D组的荧光器官的信号准备6小时后注射唇-Q或免费DY-676-COOH 32。这些观察是按照消除脂质体41和备份包括生物分布研究表征探针时的重要性。虽然不利的副作用，例如皮肤刺激和补体激活42,43已经报道在临床应用中使用的脂质体制剂，并没有与底层脂质体检测到这种效果。此外，观察免疫缺陷小鼠探针注射导致完全从小鼠器官的探针的间隙后两周（未示出）。
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Acknowledgments
这项工作是由德意志研究联合会授予 HI-698 / 10-1和RU-1652 / 1-1的支持。我们感谢琳五月优秀的技术援助和公司DYOMICS有限公司，耶拿的盛情支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9%) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
References
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