Introduction
Липосомы интенсивно исследовали и служить в качестве одного из наиболее биосовместимых биомедицинских систем доставки лекарственных средств для клинического применения 1,2. Они, в основном, состоит из фосфолипидов и холестерина, оба из которых являются биосовместимыми соединения, имитирующие части природных клеточных мембран. В то время как гидрофильные вещества могут быть заключены в водном внутреннем пространстве, липофильные агенты могут быть включены в липосомальной фосфолипидный бислой 3. Инкапсуляция веществ в водном внутреннем пространстве липосом предоставляет защиту от деградации в естественных, а также предотвращает хост-системы от токсических эффектов цитотоксических лекарственных средств, используемых для лечения заболеваний, например химиотерапевтических направленных на разрушение опухолевых клеток. Модификация липосомной поверхности полимеров, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГилирование) дополнительно увеличивает время циркуляции крови в липосомальной естественных вследствие стерических стабилизации 4. Moreovэр, липосомы могут улавливания высокие концентрации различных веществ, таких как белки 5,6, гидрофильных веществ и ферментов 7,8 9. Таким образом, они служат в качестве надежного клинического лечебно-диагностические инструменты, которые заслуживают свое согласие на поставку цитотоксических препаратов, таких как доксорубицин для лечения рака 4. Благодаря своей гибкости, липосомы также могут быть загружены с флуорохромами для диагностических и графических наведением хирургических целей.
Флуоресцентной томографии обеспечивает экономически эффективный и неинвазивный в естественных условиях диагностического инструмента, которые, однако, требует некоторых основных требований. Это может быть продемонстрировано, что флуорохромы, которые подходят лучше для визуализации в естественных условиях имеют характеристическое поглощение и максимумов излучения в диапазоне, где дисперсия света и рассеяния, а также ткани аутофлюоресценция, происходящих из воды и гемоглобина является низким. Таким образом, такие датчики имеют свою абс / EM максимумов между 650 и 900 нм 10. Кроме того, стабильность флуорохромов в пробирке и в естественных условиях имеет решающее значение, так как опсонизация и быстрое оформление может значительно ограничить их применение для естественных изображений в 11. Другие эффекты, такие как плохой стабильностью и низкой чувствительности или цитотоксических эффектов на органы-мишени, как видно с индоцианина зеленого (ICG) 12-16, являются нежелательными и должны быть приняты во внимание при разработке зондов для визуализации в естественных условиях. Эти наблюдения привели к активному развитию нескольких доклинических NIR флуорохромии наночастиц, а также новых методов для визуализации в естественных условиях воспалительных процессов, рака и для имиджа наведением хирургии 17-20. Несмотря на стабильность большинства доклинических NIRF (ближней инфракрасной флуоресценции) красителей в пробирке, их быстрое перфузии и оформление через печень и почки препятствовать их использование в в естественных условиях оптической визуализации заболеваний и воспалительных процессов.
ntent "> Поэтому мы приводим протокол для инкапсуляции флуорохромами, таких как хорошо охарактеризованы в ближней инфракрасной области флуоресцентным красителем DY-676-COOH, известный своей склонностью к себе закалки при относительно высоких концентрациях 21 в липосомы. При высоких концентрациях Н димеров и / или пи-укладки взаимодействия между молекулами флуорофора, расположенных в пределах Ферстер результате друг друга радиуса в Ферстер резонанс переноса энергии (FRET) между флуорохромом молекул. При малой концентрации пространство между увеличением молекул флуорофорные, тем самым предотвращая пи-укладки взаимодействия и Н-димеров и приводит к высокой эмиссии флуоресценции. переключение между высокой и низкой концентрации и прилагаемых тушение флуоресценции и активации является многообещающей стратегией, которая может быть использована для оптического изображения 22. В этом отношении, инкапсуляция высоких концентраций красителя NIRF DY-676-COOH в водном внутреннем липосом является более FAvorable для визуализации в естественных условиях, чем свободного красителя. Задача метода заключается в первую очередь в правильном инкапсуляции и, во-вторых, в проверке преимущества, вытекающие из инкапсуляции высокие концентрации красителя. Сравнивая свойства изображений закаленных липосом с этим свободного красителя, а также с не останавливают липосомной композиции с низким содержанием красителя не обойтись. Покажем на простом, но очень эффективном фильм гидратации и экструзии протокола в сочетании с альтернативными замораживания и оттаивания, что инкапсуляция тушения концентрации DY-676-COOH в липосомы возможно. Другие способы, используемые для получения липосом, такие как метод с обращенной фазой испарения 23, а также методом впрыска этанола 24 включить липосомного препарата с высокой эффективностью инкапсуляции для многих гидрофильных веществ. Однако природа вещества, которое необходимо инкапсулировать может влиять на эффективность инкапсуляции. В действительности,Фильм гидратации и экструзии протокол, представленные здесь показал высокую эффективность для инкапсуляции DY-676-COOH. Чтобы проиллюстрировать преимущества липосомальной инкапсуляции DY-676-COOH, в зимозаном-индуцированного отека модели, которая позволяет изучать воспалительных процессов в течение нескольких часов, был использован. Здесь показано, что липосомы с высокой концентрацией инкапсулированного DY-676-COOH являются более подходящими для всего тела в естественных условиях оптической визуализации воспалительных процессов, чем свободного красителя или не-гасили липосомной композиции с концентрацией низких красителей. Таким образом, основной протокол обеспечивает простой и быстрый способ получения закаленных люминесцентные липосомы и проверку их активации и визуализации потенциала как в пробирке и в естественных условиях.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры утверждаются областным комитетом животных и в соответствии с международными стандартами по этическим использования животных.
1. Подготовка материалов и инструментов
- Подготовка спонтанно образуется пузырек дисперсии (SFV)
- Растворить и подготовить исходные растворы следующих фосфолипидов: 214 мг / мл яичного фосфатидилхолина (ЕРС), 134 мг / мл холестерина, 122 мг / мл 1,2-distearoyl- Sn глицеро-3-phosphoethanolamine- N - [метокси (полиэтиленгликоль гликоль) -2000] (соль аммония) (MPEG 2000 -DSPE) и 2 мг / мл 1,2-dioleoyl- SN глицеро-3-phosphoethanolamine- N - (7-нитро-2-1,3-benzoxadiazol-4 ил) (соль аммония) (NBD-DOPE) в хлороформе и в магазине в стеклянных флаконах.
- Отделка примерно 3 мл хлороформа в круглодонную колбу и передавать соответствующий объем раствора фосфолипида в круглодонную колбу, чтобы подготовить липосомы, состоящие из ЕРС: Чхор: MPEG 2000 -DSPE в молярном соотношении 6,5: 3: 0,5. Для двойной флуоресценции маркировки липосом добавить 0,3 моль% НБД-DOPE в липидной раствора.
- Упаривают хлороформ из органического раствора фосфолипида при пониженном давлении (300 мбар) при 55 ° С с помощью роторного испарителя.
- После однородный фосфолипид пленка образуется, уменьшить давление до 10 мбар в течение 1-2 ч, чтобы удалить остаточный депозит хлороформом.
- В то время как хлороформ выпариванием, растворяют DY-676-COOH (6,181 мкМ) в 10 мМ Трис-буфера, рН 7,4, и заполнить сосуд Дьюара с жидким азотом. Переключатель на ультразвуковой бане и установлен на 50 ° C.
- Передача соответствующий объем (0,5-1 мл) DY-676-COOH (6,181 мкМ) раствора в круглодонную колбу дл гидратации сухого фосфолипидов пленки и вихрь энергично, пока спонтанно формируется пузырек (SFV) дисперсии форм. Убедитесь, что все фосфолипиды диспергированы, чтобы избежать потери липидов.
- Тщательно траnsfer круглодонную колбу, содержащую дисперсию SFV в жидкий азот и заморозить дисперсию в течение 3-5 мин. Поместите круглодонную колбу в ультразвуковой бане при 50 ° С, чтобы растопить дисперсию затем вихрь дисперсию энергично в течение 1-2 мин. Повторите эту процедуру шесть раз, делая в общей сложности семь замораживания и оттаивания.
- Экструзия SFV, чтобы сформировать однородные липосом пузырьки
- Передача дисперсии SFV в 1 мл шприца (шприц-а), и прессовать дисперсии через поликарбонатную мембрану 100 нм с использованием LiposoFast-Базовая экструдера в шприц-B.
- Выдавите дисперсии от шприца-б, обратно в шприц-а, затем повторите цикл десять раз. Благодаря экструзии, раствор в шприц из изменений в туманной внешнему виду четкой дисперсии во времени. После десяти циклов (двадцать отдельные шаги в профиле) удалить шприц-б от устройства и выдавите дисперсию в течение последнего времени от шприца непосредственно в стерильный1,5 мл реакционной трубки.
- Очистка липосомальных инкапсулированные DY-676-СООН от свободного красителя
- Приготовьте на колонке с силикагелем, используя шарики G25 смоченные в 10 мМ Трис-буфер рН 7,4 (колонка длиной 28 см, диаметр 0,8 см).
- Передача 0,5 мл экструдированного дисперсии пузырьков на кровать гель и пусть слива пробы в гелевой матрице.
- Элюируйте липосом с 10 мМ трис-буфера, рН 7,4 (фиг.1А) и не промывки колонки до тех пор, канализацию свободного красителя полностью из колонны. Если это будет необходимо, собирать и перерабатывать бесплатный красителя, обессоливания и обезвоживания в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Концентрат элюированной липосом с помощью ультрацентрифугирования (200000 х г, 2 ч при 8 ° С), а затем диспергировать их в надлежащем объеме стерильной 10 мМ Трис буфера, рН 7,4,.
- Количественное инкапсулированного концентрации DY-676-COOH
- Подготовка калибровочной кривой путем растворения DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 нМ) в 10 мМ трис-буфера, рН 7,4, содержащем 0,1% Triton X100.
- Растворить 2 мкл (100 нмоль окончательного липида из 50 ммоль / л наличии) липосом в течение 5 мин при комнатной температуре в 100 мкл трис-буфера, содержащего 1% Triton X100, чтобы разрушить пузырьки и освободить инкапсулированный краситель. Затем разбавленные образцы с 10 мМ трис-буфера, рН 7,4 до конечной концентрации Тритон-X100 0,1% (об / об), что делает общий объем 1 мл. Подготовка всех образцов в двух экземплярах.
- Измерьте поглощение и испускание всех образцов (бесплатно DY-676-СООН и Тритон-X100 лечение липосомы) на возбуждение λ = 645 нм и эмиссии λ = 700 нм. Создание и использование калибровочной кривой свободного красителя для определения концентрации инкапсулированного красителя.
- Липосомы характеристика
- Определить размеры и дзета-потенциал липосом динамического рассеяния света. Развести образцы липосомальных с фильтром стерилизованного (0,2 мкм) 10 мМ Трис-буфер рН 7,4 в переменного токаoncentration 100-300 мкм (липидов). Передача разбавленных образцов в низких объемов располагаемых кювету и измеряют образец в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Определение характеристик липосом с помощью электронного микроскопа, чтобы подтвердить размер, целостность и однородность липосомальных везикул в соответствии со стандартными протоколами.
2. Проверка флуоресценции закалки и активация готовых липосом
- Физико-химический анализ флуоресценции закалки и активации
- Приготовьте два 1,5 мл трубы для губ-Q и 2 трубы для свободного DY-676-COOH. Передача 100 нмоль общих липидов (2,38 мкл 42 ммоль / л для губ-Q маточного раствора, содержащие 138 мкг / мл инкапсулированного DY-676-COOH) в соответствующих трубах. Трансфер бесплатный DY-676-СООН эквивалент к содержимому красителя для губ-Q (0,38 мкг, что приводит, например, от 138 мкг / 1000 мкл х 2,38 мкл Лип-Q используется). Выдержите одна ваннае каждого зонда при 4 ° С и заморозить второй трубки при температуре -80 ° С в течение ночи (16 ч).
- Нагревают нагревательный блок до 30 ° С. Заполните охлаждающей коробку с колотым льдом и уравновешивают аликвоту 10 мМ трис-буфера с рН 7,4 при комнатной температуре.
- Удалить зонды из 4 ° С и уравновешивают при комнатной температуре (заворачивали в алюминиевую фольгу для защиты от света) и быстро оттаивают зондов от -80 ° С при 30 ° С в течение 5 мин. Холод талой зондов на льду в течение 1 мин перед передачей их до комнатной температуры (также заворачивали в алюминиевую фольгу для защиты от света).
- Добавить 10 мМ трис-буфера (рН 7,4) для каждого из зондов к 100 мкл конечного объема, и равновесие все зонды при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Внесите 80 мкл каждого зонда в стеклянной кювете малого объема и измерения поглощения каждого зонда от 400-900 нм на спектрометре. Вернуться зонд для соответствующих труб.
- Передача 80 мкл каждого зонда в подходящую стеклянную кюветуи измерить излучение флуоресценции на спектрофлуорометра, возбуждая датчиков на 674 нм и измерения флуоресценции от 694-800 нм.
- Клеточного поглощения и активация флуоресценции
- Получить и культура следующие клеточные линии в их соответствующей культуральной среде в соответствии со стандартными условиями (37 ° С, 5% СО 2 и 95% увлажненной атмосфере). Здесь используют мышиные линии клеток макрофагов J774A.1 (Дульбекко модифицированной среде Игла, дополненной 10% (об / об) фетальной сыворотки теленка), линии клеток глиобластомы человек, U-118MG (MEM, содержащей необходимые витамины и 10% (об / V) эмбриональной телячьей сыворотки) и линии клеток человека фибросаркомы, HT-1080 (RPMI с 5% FCS).
- Пальто 8-а камера скользит с поли-L-лизина (добавить 100 мкл 0,001% поли-L-лизин в каждую лунку и инкубировать при 37 ° С в течение 10 мин. Решение набирая и пусть камерные слайды высохнуть в течение по крайней мере 4 ч при комнатной температуре на стерильной верстаке. Промойте камеры слайды 3раза забуференным солевым раствором 200 мкл Хэнка затем запечатать их парафином и алюминиевой фольги и хранят при температуре 4 ° С до необходимости.
- В то время как камера скользит иссякают, фильтр-стерилизации липосом и раствор красителя и хранить при 4 ° С до необходимости.
- Для поглощения зонд анализа со всем телом в естественных условиях NIR системы флуоресцентной томографии, подготовить 5 небольших флаконах для культуры для каждой из линий 3 тестовых клеток (15 колбы в общей сложности). Семена 2 × 10 6 J774A.1, U-118MG и HT-1080 клеток на колбу культуры с 5 мл соответствующей культуральной среды (в пятерок) и расти в течение 16-24 ч. Параллельно с колбы с культурой, семена 30000 клеток каждой клеточной линии (J774A.1 и HT-1080) или 20000 клеток (U-118MG) 2 лунки камеры слайд, соответственно, и расти в 500 мкл культуральной среды в течение 16-24 часов ,
- На следующий день, добавить 100 нмоль (окончательная сумма липидов) губы-Q 2 колбы на клеточной линии и одну лунку каждой клеточной линии на камеру слайда.Сразу передачи 1 колбу на одну клеточную линию до 4 ° С и вторую колбу обратно в инкубатор.
Примечание: объем зондов добавляют в колбы и камера скользит те же, что делает концентрацию на камере слайдов 10 раз выше (5 мл до 500 мкл культуральной среды). Это необходимо потому, что Микроскопическое исследование является менее чувствительным, чем система визуализации флуоресценции NIR, где сотовые таблетки из колб в образ. - Добавьте бесплатный DY-676-COOH в концентрации, эквивалентной к содержанию красителя для губ-Q к клеткам в 2 колбы на клеточной линии и одну лунку каждой клеточной линии на камеру слайд, а затем немедленно передать 1 флакон на одну клеточную линию 4 ° C (истощение энергии), а другой колбу вместе с камерой скользить назад в инкубатор. Инкубируйте все клетки в течение 24 ч при соответствующих условиях. Клетки в колбе без зонда служат в качестве необработанного контроля.
- NIRF изображений и полуколичественный анализ
- После 24 продолжительности инкубационного ч, урожай клеток в колбах промывкой клеток 2-го раза Хенкса раствор соли (HBSS), то скрести клеток в 500 мкл HBSS и осадок центрифугированием (5 мин при 200 мкг) в 500 мкл трубки.
- Место труб с клеточного осадка (и ССРХ) в тепловизора NIRF и изображения с помощью фильтров для возбуждения (615-665 нм) и эмиссии (CUT IN> 700 нм).
- Минус аутофлуоресценцию и оценить интенсивность цели по сравнению с автофлуоресценции соответствии с инструкциями производителя. Это даст полуколичественного уровней интенсивности флуоресценции как среднего сигнала (в пересчете имп / сек), который представляет уровнях насчитывается после масштабирования для времени экспозиции, увеличение камеры, биннинга и битовой глубины, так что измерения сопоставимы друг с другом.
- Конфокальной микроскопический анализ
- После 24 ч инкубации сбора клеток на камерных промыванием слайдов 2 раза с 500 мкл HBSS.
- Закрепите CEзаполняет с 200 мкл HBSS, содержащего 3,7% (об / об) формальдегида в течение 30 мин при комнатной температуре.
- В то время как фиксация происходит, разбавить пятно ДНК, Hoechst-33258 1:50 с монтажной решения.
- После фиксации промыть клетки 2 раза ССРХ затем отделить камер от стеклянных слайдов. Добавить 50 мкл раствора, содержащего монтажную ДНК-пятно на каждой точке, соответствующей лунки камеры слайдов. Обложка клетки с покровные стекла, печать края с прозрачным лаком для ногтей и воздушно-сухой в течение 10 мин при комнатной температуре (темный).
- Клетки изображение на подходящем флуоресцентного микроскопа или конфокальной микроскопии. Используйте следующие параметры возбуждения и эмиссии для визуализации соответствующих компонентов: ядра (Hoechst-33258: возбуждение 405 нм, эмиссия 420-480 нм). НБД-DOPE (липосомальной липид: возбуждение 488 нм, излучение 530 нм). DY-676-COOH (NIR флуоресцентный краситель: возбуждение 633-645 нм, эмиссия 650-700 нм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что флуоресцентный микроскопмодели шириной оснащен соответствующих фильтров, которые позволяют возбуждение и эмиссию длин волн выше, чем 630 нм.
3. на основе липосом in vivo с флуоресцентной визуализации воспаления
- Получение животных и материалов
- Дом 8-12-недельных самцов мышей NMRI весом примерно 36 г в стандартных условиях с пищей и водой вволю.
- Через семь дней до начала экспериментов, дают все мыши низкую феофорбид диету, чтобы уменьшить ткани аутофлюоресценция.
- Через двадцать четыре часа до начала каждого эксперимента, брить мышей в желаемой области (например, всю заднюю область, если изображения отека задней ноги желательно).
- Взвешивание животных и рассчитать количество зонда, который будет введен на мышь (Lip-Q и Lip-DQ на 10 мкмоль (концентрации липидов) на кг массы и свободного DY-676-COOH (эквивалент для окрашивания содержание губ-Q используется) ,
- Изображение животных вВсе тело NIR флуоресценции тепловизор с теми же настройками, используемыми для сотовых гранул. Это измерение обеспечивает аутофлюоресценция животных.
- Растворите 10 мг зимозаном-A в 1 мл изотонического солевого раствора и хранить в течение ночи при 4 ° С.
- Индукция воспаления и в естественных NIRF изображений
- Подготовьте 3 шприцы на мышь, содержащие следующие решения. Заполните один шприц с 50 мкл зимозаном раствора (10 мг / мл), а второй шприц с 50 мкл изотонического солевого раствора. Заполните третий шприц с зондами, в результате чего Lip-Q и Lip-DQ (10 мкмоль / кг массы (липидный)) предназначены для подопытных животных и бесплатным DY-676-COOH (концентрации, как в Лип-Q) для контрольных животных. Убедитесь, что зонды разбавляют стерильной HBSS до 150 мкл конечного объема.
- Нанесите крем для глаз на глазах животных, чтобы избежать сухости и обезболить животных с 2% изофлуран пока они глубоко спит и не реагируют при прикосновении на лапах (Это займет около 2 мин).
- Наведите на теплой коврик (еще под наркозом) и ввести зимозаном решение подкожно на правой задней ноги и солевой раствор на левой задней ноге. Сразу вводят зонд внутривенно и изображение животного после затем рекордное время впрыска / измерения (как Т = 0 ч). Сохраните полученные изображения как изображение кубиков и повторите эти шаги для всех других животных и соответствующих датчиков.
- Image животные каждые 2 ч в течение после инъекции 10 ч, а затем в 24 ч после инъекции, убедившись, что этап измерительной камере тепло (например, путем размещения теплый коврик под) для того, чтобы избежать переохлаждения. После каждого измерения, установите животных в клетке с пищей и водой вволю и поместить клетку в умеренном камеры животных. Усыпить животных от первого обезболивающие с 2% изофлуран до животные больше не реагируют на ощупь, то усыпить углекислым газом в течение 5-10 мин, что делаетУбедитесь, что животные полностью остановить дыхание и трупное окоченение происходит.
- Проанализируйте мышей в соответствии со стандартными протоколами, которые могут быть использованы для определения в Интернете (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) и изображение органов.
- Оценка результатов измерений в соответствии с инструкциями изготовителя сначала вычитанием общего флуоресценции животных (расслоение), то назначая регионах, представляющих интерес для флуоресценции (левой задней лапы с физиологическим раствором) и целевой флуоресценции воспаленной области (правой задней лапы зимозаном-A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Инкапсуляция высоких концентраций флуоресцентных красителей, таких как NIRF красителя DY676-COOH используемых здесь, в водном внутреннем пространстве липосом приводит к высоким уровнем тушения флуоресценции. Шение флуоресценции, явление видели со многими флуорофорами в высокой концентрации, может быть использована в нескольких в естественных условиях и обработки изображений, где высокая чувствительность и надежность обнаружения целевой области востребованы. Использование липосом также обеспечивает защиту красителя, которая необходима для применения в естественных условиях. Тщательный характеристика липосом необходимо, и включает в себя несколько факторов, таких как уровень красителя инкапсулированный, стабильности и размер липосом, тушение флуоресценции и активности инкапсулированного красителя в пробирке, а также применимости для целей визуализации в естественных условиях. Сравнение свободного красителя, DY-676-COOH и закаленных липосомы (Lip-Q), а также не закаленных липосомы (Lip-DQ) с очень низкой ОБОГАЩЕНИЯРацион инкапсулированном красителя Поэтому крайне важно, особенно для характеристик в естественных условиях.
Липосомы, приготовленные с использованием пленки гидратации и способ экструзии с последовательными замораживания и оттаивания перед экструзией содержать остаточные молекулы свободного красителя, которые могут быть успешно отделены от липосом вследствие их более длительного удержания в матрице дл гель-фильтрации, по сравнению с липосомами, которые элюируются быстрее ( Фиг.1В). В зависимости от уровня разрежения после гель-фильтрации, необязательная стадия включает ультрацентрифугирования концентрации липосом, как показано (фиг 1С). На основании поглощения и испускания свойств инкапсулированного красителя, концентрация инкапсулированного красителя определяется с помощью калибровочной кривой, свободного красителя (рис 1D). Кроме концентрации инкапсулированного красителя, важно, чтобы определить размер и однородность липосом на кормеподготовка э. Как видно на рисунке 1E, электронные микрофотографии липосом, приготовленных по основной метод выявить в основном однослойные морфологию липосом пузырьков, содержащий внутрипузырное DY-676-COOH либо в пределах концентрационного тушения (Lip-Q; 606-846 мкмоль DY-676 ) или при концентрации, не закаленных красителя (Lip-DQ, 25 мкМ DY-676). Кроме того, они показывают гомогенное распределение по размерам примерно 120 нм и полидисперсности пор ниже 1 (таблица 1). Благодаря тушения флуоресценции, Lip-Q показывает два максимума поглощения в водном буфере, в результате чего один пик характеризуется сдвигом по отношению к синих длин волн. В соответствии с этим, флуоресцентное излучение является очень низким по сравнению со свободным красителем (фиг.2А и В, справа). Замораживание-повреждение липосом приводит к выпуску красителя, который получает разбавленного в окружающем растворе. Сине-смещается пик поглощения поэтому диsappears, в результате чего один пик поглощения Lip-Q. В соответствии с этим, увеличение интенсивности флуоресценции от замерзания поврежденных губ-Q видим, что указывает на активацию флуоресценции молекул, опубликованным на красителях состоялась. Свободного красителя показывает только один максимум поглощения и высокую интенсивность флуоресценции, которые остаются на том же уровне, независимо от замораживания (рис 2А и В, слева). Это открытие предполагает, что инкапсуляция красителя в липосомы, как в Lip-Q защитит краску от окружающей среды, сохранить высокую концентрацию и связанный с ним тушение флуоресценции и если активирован целевых триггеров позволит обнаружить за счет увеличения флуоресценции.
Липосомальные зонды с основной липидного состава выявить преобладающий фагоцитарную поглощение которых ингибируется энергетического истощения. Это можно увидеть с помощью поглощения Lip-Q от высокой фагоцитарной мышиного J774A.1 клеточной линии макрофагов иумеренно фагоцитарной линии клеток глиобластомы человек U-118MG при 37 ° С и ингибирование при 4 ° С (фиг.3А и В). Свободное краситель DY-676-COOH, показывает поглощение в фагоцитирующих клеточных линий и при 37 ° С и при 4 ° С, который указывает, что зонд липосомальной губ-Q не содержит остаточный краситель в растворе и может только пройти активное поглощение. Конфокальной лазерной сканирующей микроскопии изображения дополнительно обосновать захват и активацию Лип-Q в фагоцитирующих клеток (рис 3в). Кроме того, отсутствие флуоресценции в не-фагоцитарной линии фибросаркома клеток человека, HT-1080 показывает, что поглощение Лип-Q, в основном, путем фагоцитоза и, таким образом, будет вполне подходящим для работы с изображениями воспаления, где фагоциты моноциты / макрофаги участвуют.
В соответствии с фагоцитарной поглощения липосом видел в культуре клеточных линий, а благодаря тушение флуоресценции внутривенную инъекцию Lip-Q приводит к заданного интервала временизависит увеличение интенсивности флуоресценции отека в моделях мышей (фиг.4А, Lip-Q), с очень низкой фоновой флуоресценции. Максимальная интенсивность флуоресценции отека обнаружен 8-10 ч после инъекции губ-Q. Наоборот, относительно сильный БИК-флуоресценции всей мыши видно после применения свободного DY-676-COOH (фиг.4А, DY-676-COOH) или всегда на липосомы, Lip-DQ (фиг.4А, Lip-DQ ). По сравнению с Lip-Q, быстрого перфузии и клиренса свободной DY-676-COOH, как видно из 0-4 ч после инъекции, мешает визуализации, так что надежное обнаружение отека не возможно (4А, DY-676-COOH ). Кроме того, не-гасили липосомы, Lip-DQ показывает максимальную флуоресценцию отека в течение 2-4 ч после инъекции, которая остается почти постоянной до 8 ч, а затем постепенно уменьшается аналогично закаленного флуоресценции отека губ Q-основе. Выполнение полуколичественного анальныйyses, в результате чего регионах, представляющих интерес (трансформирования) устанавливаются для купирования против фоне, можно сделать выводы о различных уровнях обнаружения с различными зондами. Согласно полуколичественного анализа 5 животных на группу (зонда), отек может быть более значительной (p = 0,001), детектируемого с Lip-Q, чем при свободном DY-676-COOH или не-гасили, Lip-DQ (фиг 4В).
Визуализации органов мышей умерщвляли 24 ч после инъекции зондов показывают умеренный Экс Vivo флуоресценции печени / желчного пузыря и почек и очень низким или нулевым флуоресценции селезенки, легких и сердца (рис 5), который служит в качестве доказательства для устранения зондов через гепатобилиарной маршруту.
Рисунок 1: Получение DY-676-СООН-загруженной липосомыс. (AC) схематический обзор стадий синтеза, участвующих. () Установка пленки гидратации и экструзии с ближней инфракрасной краситель DY-676-COOH. (B) Изображение самодельного установки для гель-фильтрации, показывая интерфазу между неинкаплусированных (бесплатно) красителя и липосомы. Липосомы вымывается первым и появляются сине-зеленый из-за инкапсулированном DY-676-COOH (синий) и включены зеленый фосфолипидов, НБД-DOPE. (C) представитель образ липосом осадков (Lip-Q), после концентрации ультрацентрифугированием. ( D) представитель градуировочная кривая DY-676-COOH в 10 мМ Трис, рН 7,4 (содержащий 1% Тритон X100) используется для количественной оценки липосомальной красителя. (E) электронов Cryo-передачи микрофотографии Лип-Q. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть Более крупная версия рисунка.
Рисунок 2:. Физико-химические определение флуоресценции закалки и активации в пробирке (А) Спектры поглощения Lip-Q (справа) и свободным DY-676-COOH (слева) измеряется в 10 мМ Трис-буфера, рН 7,4, до или после замораживания при - 80 ° С. Обратите внимание на характерный двойной пик губы-Q по сравнению со свободными DY-676-COOH и исчезновения сине-сдвинуты пика после замораживания-повреждения губ-Q. (B) Соответствующая спектры флуоресценции излучения Лип-Q (справа) и свободный DY-676-COOH (слева) измеряется в 10 мМ Трис-буфера, рН 7,4, до или после замораживания при -80 ° С.
Рисунок 3: клеточное поглощение и флуоресценции активации губы osomes. Изображения в (а), были получены с помощью NIR флуоресценции визуализации осадков клеток после воздействия соответствующих зондов в течение 24 ч при указанных температурах. HT-1080 клетки не выжить 24 ч инкубации периоды при 4 ° С. В баре диаграммы в (б) представляют полуколичественного уровни сигналов флуоресценции получили путем присвоения трансформирования в клеточных осадков в А. Каждая полоса обозначает среднюю интенсивность N = 3 экспериментов ± SD. Изображения в (С) были приобретены конфокальной лазерной сканирующей микроскопии клеток, подвергшихся воздействию зондов по культуре камерных слайдов в течение 24 ч при 37 ° С. Обратите внимание на высокий уровень флуоресценции в высокой фагоцитарной мыши J774A.1 макрофагов клеточной линии и умеренное флуоресценции в мягкой фагоцитарной линии человеческого клеток глиобластомы U-118MG. Номера для фагоцитарной человек фибросаркома клеточная линия HT-1080 не показывает флуоресценцию зондов. НБД-DOPE: зеленый флуоресцентный фосфолипидов.нагрузка / 52136 / 52136fig3highres.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.
Рисунок 4. В естественных условиях оптической визуализации зимозаном-индуцированного отека у мышей. () Мыши изображение слева показывает позиции подкожно применяется зимозаном-A (500 мкг в 50 мкл физиологического раствора) и управления солевой раствор (50 мкл) на левом фланге. Внутривенное введение указанных зондов и всего тела NIR флуоресценции изображений в указанных временных точках выявить постепенное, но высокий рост флуоресцентных сигналов отека и низкая фоновых сигналов для губ-Q (верхняя панель) с максимумом флуоресценции при после инъекции 8 ч. Свободного красителя показывает, перфузии и быстрое оформление в течение после инъекции 4 ч (средняя панельл), в то время как Lip-DQ показывает обнаружение отека с низкой интенсивности сигнала и общей высокой фоновой флуоресценции. Графическое представление в (Б) повторить наблюдаемые сигналов флуоресценции отека обнаруженного с каждого датчика по сравнению с контрольной области (физиологический раствор) в N = 5 животных в каждой группе. Каждый участок представляет собой среднее сигналов флуоресценции (п = 5) ± SEM. С графиков, максимальный сигнал флуоресценции отека обнаружены с каждого зонда легко отличить (Lip-Q, 8 ч; Lip-DQ 2-4 ч и свободно DY-676-COOH, 2 ч после инъекции). Существует значительно (P = 0,001) выше интенсивность флуоресценции отека губ-Q против Lip-DQ при Т = 0-24 ч и с Лип-Q против свободного DY-676-COOH при Т = 4-24 час. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.
Рисунок 5: Био-оптические экс виво изображения органов у мышей применением сообщение зонда 24 ч и соответствующее полуколичественный анализ интенсивности флуоресценции органов. Каждый бар представляет собой среднее интенсивности флуоресценции (N = 4) ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию рисунка.
| Формулировка липосомы | Размер [нм] | Показатель полидисперсности (PI) | Зета Потенциал [мВ] |
| Lip-DQ (dequenched) | 123,4 ± 0,6 | 0,055 ± 0,02 | -10,6 ± 0,4 |
| Lip-Q (гасят) | 118,5 ± 0,7 | 0,04 ± 0,02 | -9 ± 2 |
| Lip-NBD (б / н DY-676-COOH) | 123,0 ± 1,4 | 0,04 ± 0,03 | -11 ± 1 |
Таблица 1: Характеристика липосом динамического рассеяния света.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Поскольку липосомы могут также служить в качестве систем доставки для флуоресцентных красителей, они дают возможность визуализации целевых заболеваний. Инкапсуляция высоких концентраций флуоресцентных красителей, таких как краски, NIRF DY676-COOH используемых здесь, приводит к высокому уровню флуоресценции закалки захваченного красителя. Шение флуоресценции, явление видели со многими флуорофорами при высокой концентрации может быть использована в нескольких в естественных изображений приложениях, где высокая чувствительность и надежность обнаружения целевой области востребованных. Использование липосом также обеспечивает защиту красителя, которая необходима для применения в естественных условиях.
Методика пленка гидратации и экструзии является широко используемым методом, который дает успешное получение липосом с различными диапазонами размеров в зависимости от необходимости, и позволяет модификации, такие как капсулы из множества различных веществ 25. Таким образом, он подходит для подготовки кромкиosomes инкапсулируется БИК флуоресцентного красителя, DY-676-COOH в целях визуализации. Метод дает липосомы 600-840 мкМ концентрации внутрипузырное красителей, которые находятся в пределах погашенной концентрации красителя. LiposoFast-Базовая экструдер вручную используется для гомогенизации спонтанно формируется пузырьков дисперсии подходит для приготовления липосом в небольшом лабораторном масштабе, из-за совместимости с устройством, со шприцами до 1 мл объема. Для крупных препаратов использование больших гомогенизаторов высокого давления, которые способны гомогенизации пузырьков дисперсий с мощностью 1000 л в час рекомендуется. Гель-фильтрации (гель) хроматография важный шаг, который обеспечивает разделение инкапсулированном липосомальной красителя из некапсулированных молекул (бесплатно) красителей 26. Длина гель-фильтрационную колонку является жизненно важным для эффективного разделения липосом от свободного красителя. Таким образом, необходимо подготовить колонну длиной по крайней мере 28 см тO успешно разделить липосом из свободного DY-676-COOH, используемого здесь. Интересно, что эта длина в два раза до тех пор, как использовать для очистки карбоксифлуоресцеин (CF), загруженные липосомы бесплатный карбоксифлуоресцеина. Основным недостатком гель-фильтрации является разведение 5:55 раза из очищенных образцов. Это может быть компенсировано посредством ультрацентрифугирования, если высококонцентрированные липосомы необходимы. Во ультрацентрифугирования липосомы осадок и надосадочную жидкость может быть легко удалена 27. Другие способы концентрат липосом, такие как диализом 28 больше времени, чем ультрацентрифугирования.
Кроме того, метод пленка гидратации и экструзии, способ с обращенной фазой испарения 23, а также метод этанола инъекции 24 включить липосомного препарата с высокой эффективностью инкапсуляции для многих гидрофильных веществ. Тем не менее, наши исследования показали фильм увлажнение в сочетании с замораживании и оттаивании циклас наиболее подходящим способом в течение достаточного intraliposomal инкапсуляции DY-676-COOH. Увеличение начальной концентрации DY-676-COOH, используемый для пленки гидратации повышает эффективность и концентрацию красителя intraliposomal, когда фиксированную концентрацию липидов 30 мМ используется. Несмотря на это инкапсуляции эффективности с помощью метода при замораживании и оттаивании не превышает 10% от концентрации исходного красителя, используемого, но тем не менее достаточно для инкапсуляции концентрации, необходимой для тушения изображений. Кроме того, свободный краситель отделена от липосом путем гель-фильтрации могут быть переработаны путем обессоливания и обезвоживания в соответствии с инструкциями производителя, что делает повторную герметизацию возможно и общая потеря красителя минимальна. Герметизация красителя на нижележащий протокол не имеет никакого влияния на размер и морфологию липосом, как видно по показателям полидисперсности и на электронной микрофотографии губы-Q.
Несколько простых методов могут быть использованы для evaluatе активность подготовленной флуоресцентного liposomes.DY-676-COOH имеет высокую склонность к самостоятельному закалки при высоких концентрациях 21,29, вероятно, в результате образования H-димера и пи-укладки взаимодействий между молекулами красителя. Эти взаимодействия, которые происходят из-за близости к Ферстер радиусов молекул красителя при высоких концентрациях, могут быть уничтожены путем разбавления 30. Таким образом, инкапсуляция высоких концентраций DY-676-COOH не только защищает краску от опсонизации в естественных условиях, но и от окружающей буфера, тем самым сохраняя его высокую концентрацию и удержание тушение флуоресценции, которые могут быть обнаружены в сине-сдвинуты поглощения Пик и низкой эмиссии флуоресценции, как показано на фиг.2. Замораживание постепенно липосом при -80 ° С приводит к образованию кристаллов льда в водном внутреннем пространстве 31, которое вызывает повреждение липосомальной мембраны, когда необдуманно оттаивали при 30 ° С. Релиз, разведение и флуоресценции ACTiнение в внутри липосомального DY-676-COOH в буфере после замораживания раскрывается в виде единственного пика поглощения и почти 2,5-кратное увеличение в интенсивности флуоресценции (фиг.2), который указывает, что губы-Q, таким образом, изолирует высокий, закалка концентрации DY-676-COOH и активируемый. Другие способы повредить липидный бислой липосом, таких как использование моющего средства или органических растворителей не свидетельствуют четкие различия между свободной красителя и липосомальной инкапсулированный краситель, так как они оба влияют на спектральные свойства многих люминесцентных красителей 32. Медленное замораживание и резкий способ оттаивания сообщил Поэтому здесь служит более надежным и перспективным методом для проверки высокий инкапсуляции флуорофорами в липосомы и, как следствие тушение флуоресценции. Из спектров поглощения и испускания неповрежденной Лип-Q (рис 2), некоторый уровень остаточного флуоресценции может быть обнаружено. Это может привести к из мономеров, не являющихся закалки красителя в рамках липосакциихромосом, а также от электростатического взаимодействия и влияния инкапсулированного красителя по фосфолипидных полярных головных групп 33.
Как можно видеть на фиг.3, отличается накопление Lip-Q в высокой фагоцитарной мышиного макрофага и легкой фагоцитарной линии клеток глиобластомы человека, U-118MG 34, но не в не-человеческого фагоцитарной клеток фибросаркомы линии НТ-1080, указывает, что Lip-Q- основе изображений воспаления было бы выгодно, так как фагоциты являются ключевыми игроками воспалительных процессов. Тот факт, что истощение энергии отменяет поглощение Lip-Q, но не поглощение свободной DY-676-COOH обосновывает специфику фагоцитарной поглощения Lip-Q и показывает, что губы-Q остается неизменным в ходе эксперимента, то высвобождение красителя и зависит от энергии поглощения будет иметь место, ведущую к флуоресценции обнаружения. Включение зеленый флуоресцентный фосфолипид, НБД-DOPE в липосомы бислоя позволяет микроскопических изображений и discriminatioн между Неискаженный от клеточных деградированных липосом, особенно если зависящие от времени эксперименты поглощения выполняется как сообщалось ранее 32. Микроскопические изображения показывают, NIR-флуоресценцию DY-676-COOH, который, коррелирует с уровнем интенсивности флуоресценции клеток гранул, как определено полуколичественного анализа после инкубации при 37 ° С. В соответствии с этим, мышиные клеточные линии макрофагов показывают самую высокую флуоресценцию, в то время как глиобластомы человека показывают, нижний флуоресценцию как DY-676-COOH и НБД-DOPE, чем первый. Как и ожидалось, линию клеток фибросаркомы человека, HT-1080 не обнаружено никаких флуоресценции либо липосомальных красителей или свободного DY-676-COOH, который укрепляет тот факт, что поглощение Lip-Q, является преимущественно путем фагоцитоза.
Для изучения возможностей для губ-Q на основе фагоцитоза приводом в естественных изображений воспаления, несколько элементов управления были рассмотрены. Учитывая, что бесплатно DY-676-COOH может быть рассмотрен phagocytОзис, опсонизации Lip-Q может привести к высвобождению красителя, которые могут быть приняты до фагоцитами. Чтобы избежать этого, Lip-Q был приготовлен с 5 моль% ПЭГ. Кроме того, необходимо проводить различие между поглощением из-за воспаления на основе эффекта ЭПР и активного поглощения и активации флуоресценции. Для решения этой проблемы, оценка и сопоставление трех различных зондов, а именно всегда на, губы-DQ, погашенной Лип-Q и свободного DY-676-COOH у мышей, несущих отек зимозаном-индуцированной было необходимо. Зимозаном которые получают из клеточных стенок дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE и Candida Albicans является естественным стимулятором секреции цитокинов через dectin-1 и платной-подобный рецептор TLR 2/6 (2/6). Секретируемые цитокины, в свою очередь вызывают активацию вниз по течению каскадов, которые приводят к сосудистых утечек, тем самым облегчая intravasation / экстравазацию моноциты / макрофаги селезенки резервуара 35, а также нейтрофилов, а также их миграции воспалительных сайтов(Отек) 36-39. Процесс зимозаном основе моноциты / макрофагов кровоизлияние и миграции нужно только 4,5-6 ч, что делает Зимозан стратегический инструмент для изучения воспалительных процессов 36-39. Из-за сосудистых утечек, которые приводят при воспалении, внутривенно вводят зонды могут быть либо приняты до моноциты / макрофаги (фагоцитов) во время их миграции к месту воспаления или extravasate и будут рассматриваться на сайте отека (EPR эффект) 40. Использование без закалки губ-DQ показывает общую сильный фон отека сигналов, чем Лип-Q, и увеличение флуоресценции отека, который отражает миграцию моноцитов и макрофагов. В действительности, максимальная флуоресценция отека видно уже после нанесения 2-4 ч Lip-DQ и остается почти постоянной до 8 часов. Против Lip-DQ и Lip-Q, свободный DY-676-COOH, подвергается быстрому перфузии после инъекции и очищается течение 4 ч, так что различные изображения отека невозможно. Вterestingly, использование результатов Lip-Q в стойкое повышение интенсивности флуоресценции отека и очень низких фоновых сигналов. Это стойкое повышение интенсивности флуоресценции с Лип-Q объясняется флуоресценции активации липосомальной выпущен красителя. Взятые вместе, можно сделать вывод, что вклад ЭПР-эффекта в визуализации для губ-В на основе минимально, так как губы-DQ показывают максимальную флуоресценцию (ЭПР эффект и миграцию моноцитов) после инъекции на 4 ч. Таким образом, липосомальной инкапсуляции обеспечивает защиту и отличную доставку DY-676-COOH, в свою очередь, позволяет более надежно в естественных изображений отека, исключительно после интернализации и деградации (активация флуоресценции) фагоцитами. До сих пор, использование отека задней ноги зимозана индуцированного для проверки свойств изображений флуоресцентных липосом является новым. Протокол сообщалось здесь, могут быть расширены как по инкапсуляции различных флуоресцентных красителей и визуализации влияния различных ингибирующей друГЦБ на индукции воспаления, и, следовательно, представляет собой полезный инструмент для подготовки и характеристики зондов, пригодных для биомедицинских изображений.
Еще один важный шаг на пути к подходящие зонды изображений является проверка их фармакологических свойств и ликвидации маршрутов. Распределение зондов в органах, которые играют жизненно важную роль в экскреции, таких как печень и почки, а также их короткий сохранения и соответствующей исключения из этих органов, как правило, признак, что зонды не будет много всего показывают, никаких неблагоприятных эффектов на пациента. В соответствии с этим, органы мышей подготовлен 24 ч после инъекции губ-Q или свободного DY-676-COOH выявить лишь небольшое флуоресценции печени / желчного пузыря и почек, что означает предпочтительный ликвидации липосомальной флюорофора через гепатобилиарной маршрут. Короче говоря размещение датчиков в этих органах и их эффективного устранения обосновывается в 7-ВОЛСд больше сигналы флуоресценции органов подготовлены 6 ч после инъекции губ-Q или свободного DY-676-COOH 32. Эти наблюдения в соответствии с ликвидацией липосом 41 и создает резервные копии важность включения биологического распределения исследований при характеристике зондов. Хотя неблагоприятные побочные эффекты, такие как раздражение кожи и активацию комплемента 42,43 сообщалось для липосомальных композиций, используемых в клинической практике, такие эффекты не были обнаружены с основными липосом. Кроме того, наблюдение иммунодефицитных мышей в течение двух недель после инъекции зонда приводит к полному зазор зондов из органах мышей (не показано).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Немецкое исследовательское общество HI-698 / 10-1 и RU-1652 / 1-1. Мы благодарим Дорин мая за отличную техническую помощь и компании DYOMICS GmbH, Йена их поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9%) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
References
- Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
- Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
- Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
- Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
- Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
- Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
- Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
- Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
- Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
- Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
- Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
- Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
- Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
- Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
- Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
- Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
- Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
- Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
- Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
- Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
- Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
- Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
- Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
- New, R. R. C. Liposomes a practical approach. , IRL Press at Oxford University Press. (1990).
- Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, 2806-2810 (1977).
- Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
- Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging--influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
- Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
- Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
- Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
- Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
- Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14 (2005).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
- Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
- Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
- Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
- Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
- Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H.
- Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
- Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).
