Summary
הפרוטוקול הנוכחי מפרט שיטה למדידת הפעילות של אנזימים תפקודי הומולוגי deubiquitinating. בדיקות מיוחדות קוולנטית לשנות את האנזים ולאפשר לגילוי. שיטה זו מחזיקה את הפוטנציאל לזהות מטרות טיפוליות חדשות.
Abstract
לאחרונה מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום הייתה מעורבת בפתולוגיות שונות כולל מחלות ניווניות וסרטן. לאור זאת, טכניקות ללימוד מנגנון הרגולציה של מערכת זו הן חיוניות להבהרת התהליכים התאיים ומולקולריים של המחלות הנ"ל. השימוש בבדיקות היוביקוויטין hemagglutinin נגזר המתוארות במאמר זה משמש ככלי רב ערך למחקר של מערכת זו. מאמר זה מפרט שיטה המאפשרת למשתמש לבצע מבחני שנותנים להדמיה ישירה של deubiquitinating פעילות אנזים. אנזימי Deubiquitinating לשלוט השפלה proteasomal ולשתף הומולוגיה פונקציונלית באתרים הפעילים שלהם, המאפשר למשתמש לחקור את הפעילות של אנזימים רבים בassay אחד. מתקבל lysates דרך הפרעה תא מכאנית עדינה וטופחו עם בדיקות מכוונות אתר פעיל. אנזימים פונקציונליים מתויגים עם הבדיקות תוך אנזימים פעילים יישארו מאוגד. על ידי הפעלהנינג assay זה, המשתמש מקבל את המידע משני הפעילות וביטוי פוטנציאל של אנזימי deubiquitinating מרובים באופן מהיר וקל. השיטה הנוכחית היא באופן משמעותי יעילה יותר באמצעות נוגדני פרט למאה האנזימים deubiquitinating חזו בתא האנושי.
Introduction
מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום (UPS) משמשת כאחד ממסלולי השפלה המרכזיים בתא היונקים. מצעים מחויבים לפירוק בפרוטאזום מתויגים קוולנטית עם פולימרים של היוביקוויטין (UB) 1. לפני המצע הממוקד נכנס לפרוטאזום לשפלה, יש להסיר את תג פולי-יוביקוויטין. כיתה של אנזימים המכונים deubiquitinating אנזימים (dubs) אחראית לפינוי והמיחזור של מולקולות יוביקוויטין 2. זה כבר חזה מהגנום האנושי שיש כמעט מאה ממכן עובד בתא 3. עם מספר כה גדול של ממכן שליטה תהליכים תאיים בתיווך UB, לומד אנזימים אלה מציב אתגר מאז טכניקות mRNA לא נותנים מידע על פעילות ומערבית סופג רק נותן מידע על רמות ביטוי.
השימוש בhemagglutinin השפעת (HA) מתויג, UB-נגזר בדיקות אתר מכוונות פעילים מאפשר לmod קוולנטייםification של ממכן הפונקציונלי ולכן נותן להדמיה ישירה של הפעילות של אנזימים אלה על כתם מערבי 4. יש בדיקות קבוצה תגובתי תיאול C-מסוף המשמשת כמצע להתאבדות שאריות ציסטאין אתר הפעיל 5. עם בדיקות אלה, ניתן ללמוד את הפעילות וביטוי פוטנציאל של ממכן רבים תחת שני מצבים פתולוגיים ופיסיולוגיים של התא.
שינויים בפעילות DUB היו מעורבים במגוון של מצבים פתולוגיים כגון פרקינסון, אלצהיימר, אנמיה וסוגי סרטן שונים 6-10. טכניקה זו מספקת כלי רב עוצמה לחקר המחלה. בעבודה הנוכחית, אנו מציגים את היישום של טכניקה זו בתאי הלה וM17 שכבר lysed באמצעות חרוזים זכוכית. בנוסף, אנו מתארים כיצד להשתמש בשיטה זו בדגימות רקמת חוט השדרה עכבר. המידע שהתקבל מטכניקה זו יכול לשמש כנקודת פתיחה לזיהוימטרות טיפוליות, כמו גם דגמי ההקמה לחקר תנאי מחלה שונים. השירות האמיתי של טכניקה זו הוא ביכולתה לספק מידע על ממכן מרובה בassay אחד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תמוגה הצפת הכנה
- לפזר סוכרוז במים ללא יונים (DI) כדי להפוך את פתרון מניות 2 M. סנן פתרון 2 M של סוכרוז באמצעות ואקום מונע 0.22 מיקרומטר פלואוריד polyvinylidene מסנן (PVDF).
- לפזר dithiothreitol (DTT) במי DI לעשות פתרון 500 מ"מ מניות וחנות בתנאים אנאירוביים. לפזר מגנזיום כלוריד (MgCl 2) במי DI לעשות פתרון מניות 100 מ"מ. לפזר אדנוזין טריפוספט disodium מימה (ATP) במי DI לעשות פתרון מניות 50 מ"מ.
- איפור פתרון טריס בpH 7.4 ידי המסת hydrochloride Trizma במי DI והתאמת pH באמצעות נתרן הידרוקסידי (NaOH).
- לשלב חלקים מפתרונות המניות במים די כדי להפוך את מאגר תמוגה עם ריכוז סוכרוז של 250 מ"מ, ריכוז DTT של 1 מ"מ, MgCl 2 ריכוז של 5 מ"מ, ריכוז ה- ATP של 1 מ"מ וריכוז טריס של 50 מ"מ . לדוגמא, לערבב 535.3 μl של טריס, 500 μl של MgCl 2, 1.25 מיליליטר של סוכרוז, 20 μl של DTT, 200 μl של ה- ATP ו7.4947 מיליליטר של מים די כדי להפוך את 10 מיליליטר של חיץ תמוגה. זה יכול לשמש לכ -20 ניסויים.
2. תאים culturing לניסוי
- להפוך את התקשורת על ידי aliquoting 30 מיליליטר של DMEM + 10% בסרום שור עוברי (FBS) לצינור חרוטי 50 מיליליטר.
- העבר את תאי M17 או הלה קפוא מאחסון חנקן נוזלי לכוס קטנה עם מים פושרים.
- להעביר את תאי צינור חרוטי 50 מיליליטר. ראשית, להוסיף קצת תקשורת לבקבוקון התא. לאחר מכן להעביר את תאי resuspended בתוך 5 שניות של הפשרה.
- צנטריפוגה ההשעיה התא ב 450 XG במשך 5 דקות כדי לקבל תא גלולה. הוסף 20 מיליליטר של תקשורת לתוך בקבוק T75.
- הסר את המדיה מהתאים באמצעות יניקה. הוסף 5 מיליליטר של תקשורת טריות לתא גלולה וגלול.
- מעבירים את ההשעיה התא 5 מיליליטר ל -20 מיליליטר של תקשורת בבקבוק T75 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס. ChAnge התקשורת בכל 3 ימים.
קציר 3. סלולארי
- הסר את המדיה באמצעות יניקה, נזהר שלא לגעת בתאים.
- לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS). הסר PBS באמצעות יניקה.
- להוסיף 3 מיליליטר של חומצת טריפסין-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לבקבוק T75 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
- הוסף 6 מיליליטר של תקשורת טריות לבקבוק וresuspend התאים.
- מעבירים את ההשעיה לצינור חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 290 × גרם במשך 5 דקות.
- הסר את supernatant ולהוסיף 5 מיליליטר של PBS. לטפוח בעדינות את החלק התחתון של הצינור כדי לשבור את גלולה. צנטריפוגה ב 290 XG במשך 5 דקות.
- חזור על שלב 3.6 שלוש פעמים.
- הסר PBS וresuspend התאים 1 מיליליטר של PBS הטרי. העברה לצינור Eppendorf (1.5 מיליליטר). ספין ב290 XG במשך 5 דקות.
4. תא תמוגה
- מדוד את הנפח המשוער של גלולה באמצעות פיפטהd לשקול את חרוזי זכוכית במסה: יחס נפח של 1: 1. להוסיף פעמיים הנפח של גלולה במאגר תמוגה.
הערה: להוסיף למאגר לפני הוספת חרוזי הזכוכית. - Lyse התאים בצינור Eppendorf בתסיסה המרבית למשך 30 דקות ב 4 ° C על ידי vortexing בחדר קר.
- בקצרה צנטריפוגות ב XG 200 במשך 30 שניות כדי ליישב את חרוזים. לאסוף את supernatant.
- להוסיף את אותו הנפח של חרוזי זכוכית כמו קודם לsupernatant.
- מערבולת שוב בתסיסה המרבית למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- בקצרה צנטריפוגות ב XG 200 במשך 30 שניות כדי ליישב את חרוזי הזכוכית. לאסוף את supernatant.
- צנטריפוגה ב 5,030 XG במשך 5 דקות כדי להסיר את הגרעינים, וקרומי תאים רצופים. לאסוף את supernatant, המהווה את lysate התא.
Homogenization 5. רקמות
- הפוך המוני: נפח של 1: 9 פתרון של רקמת חוט השדרה עכבר למאגר תמוגה.
הערה: שיטה זו ישימה למגוון שונהדגימות רקמה אף אוזן גרון. - Homogenize הרקמות באמצעות הגדרה של רמה 2 על homogenizer למשך 30 שניות כדי לוודא שאין גושים שנותרו.
- ספין למטה ב5,030 XG במשך 3 דקות כדי להסיר את הגרעינים, וקרומי תאים רצופים.
- לאסוף את supernatant, המהווה את lysate.
Derivatization 6. לדוגמא
- בצע חומצת bicinchoninic (BCA) בניתוח צלחת 96-היטב כדי לקבוע את ריכוז החלבון של lysate הרקמות באמצעות קורא צלחת 96-היטב colorimetric כמפורט בפרוטוקול ערכת assay חלבון BCA פירס.
- להביא aliquot המתאים עד 20 מיקרוגרם של חלבון הכולל 50 μl באמצעות מים מיוננים דה (DI).
- הוסף 2 μl של 1.35 מיקרומטר של sulfone HA-UB-ויניל (VS) לפתרון דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. התוצאה 20 מיקרוגרם של lysate 50 ננומטר של בדיקה בתערובת התגובה הסופית. זה בעודף טוחנת גדול כדי להבטיח תיוג של ממכן פונקציונלי.
- אניncubate המדגם במאגר המדגם של Laemmli במשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס. לתגובת שימוש נפח 52 μl 26 μl של חיץ מדגם 2x, 13 μl של חיץ מדגם 4x או 8.87 μl של חיץ מדגם 6x.
- מגניב על קרח לפני טעינת ג'ל.
7. מערבי כתם
- לטעון 4-20% ג'ל טריס-גליצין 12 גם עם 40 μl של המדגם מוכן
- הפעל את הג'ל על 95 V עד חזית היון מגיעה לתחתית.
- לבצע העברת לילה של הג'ל על קרום difluoride polyvinylidene (PVDF).
- דגירה הקרום בכתם השחור amido ולסרוק membane לקבל תמונה המציגה את כמות החלבון בכל מסלול.
- Destain קרום דגירה ב 5% בחלב PBS עבור שעה 1 לחסום.
- דגירה הקרום בנוגדן אנטי HA העיקרי בריכוז של 1: 10,000 בחלב 5% ב PBS או לילה ב 4 מעלות צלזיוס או במשך 4 שעות בטמפרטורת חדר.
- בצע 3 שוטף Fאו 5 דקות כל אחד בPBS עם 0.1% אבקת Tween-20.
- דגירה הקרום בperoxidase חזרת עכבר בריכוז של 1: 10,000 בחלב 5% ב PBS לפחות 2 שעות.
- בצע 3 שוטף במשך 5 דקות כל אחד בPBS עם 0.1% אבקת Tween-20.
- לבצע שטיפה 1 למשך 5 דקות בPBS.
- דגירה הקרום במגיב איתור chemiluminescent במשך 10 דקות ולזהות באמצעות גלאי chemiluminescent. השתמש בחשיפה האוטומטית הגדרה בגלאי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאי M17 והלה תרבותיים נקצרו בשיטה מפורטת ב( קציר Cell 3.) פרוטוקול ורקמת חוט השדרה עכבר הושגה. תא גלולה / רקמת חוט השדרה הוצבה בצינור עם חיץ תמוגה המתואר בסעיף הכנת מגיב. כדורי תא היו lysed באמצעות חרוזים זכוכית (איור 1 א) ודגימות רקמת חוט השדרה עכבר היו הומוגני באמצעות homogenizer (איור 1). לאחר תמוגה או הומוגניות, המדגם centrifuged אז ב5,030 XG להסיר את חרוזי זכוכית ו / או קרומים רצופים ואברונים (איור 2). שתי שיטות אלה הם אמצעים מכאניים של תמוגה לשמר פעילות האנזימטית. ריכוז החלבון של התאים היה אז נקבע באמצעות שיטת BCA. 20 מיקרוגרם של חלבון כולל הודגר עם 2 μl של חללית 1.35 מיקרומטר עבור שעה 1 ב 37 ° C (איור 3). הדגימות אז הודגרו בLaemmli 4x שלמאגר המדגם ב 95 מעלות צלזיוס כדי להרוות את התגובה. הדגימות מוכנות הועמסו על ג'ל טריס-גליצין 4-20% ולהפעיל ב 95 V עד חזית היון הגיעה לתחתית. החלבונים הועברו לילה על קרום PVDF. טעינת החלבון נבדקה באמצעות הכתם amido השחור (איור 4). צעד שליטה זו מבטיח כי ההבדלים בפעילותם בשל תהליכים תאיים בפועל וטעינת חלבון לא שוויונית. כמויות חלבון שווים שמשו בניסוי הראשון (איור 4 א). בניסוי השני, כמויות חלבון שוויוניות הועמסו בשל ההבדלים הצפויים בפרופילי הפעילות של שורות תאים השונות (איור 4). זה נעשה על מנת להבטיח הגילוי של פרופיל פעילות לlysates תא M17 מודגרות עם -ethylmaleimide N (Nem), שבו הוא מעכב ציסטאין וצריך להוביל לאות מופחתת על הכתם המערבי. ממברנות הודגרו באנטי-HA נוגדן ראשוני, h עכברperoxidase orseradish ולאחר מכן זוהה באמצעות ההדמיה chemiluminescent (איור 5). תיוג מוצלח של ממכן באמצעות תוצאות הבדיקות בפרופיל בכל מסלול של הקרום (איור 5 א ', ג'). עוצמת הלהקות במשקל מולקולרי שונה תואמת את רמת הפעילות של אנזים DUB. ההבדלים ברמות פעילות של ממכן שונים ברחבי שורות תאים להיות ברורים כאשר חלבונים דומים כגון UCHL1 מושווים בתאי הלה וM17 (איור 5). ההדמיה chemiluminescent של ג'ל היא קריטית משום שבניגוד הכתם השחור amido, אשר מציג את כמות החלבון הטעון, זה מראה את כמות החלבון הפעיל שהגיב עם הבדיקות. התמונה של אור הסטנדרטים משקל המולקולריים (איור 5) משמשת כמדריך לזיהוי ממכן השונים. המסה של החללית צריכה להוסיף לגודל של החלבון במהלך ניתוח התוצאות לאפיין DUB ים במשקל המולקולרי הנכון.
איור 1:. תמוגה שיטות לתאים ורקמות תמונה מראה תמוגה תא באמצעות חרוזים זכוכית ב() לעומת תמוגה Polytron ב( B).
איור 2: מוצרי צנטריפוגה של תאים ורקמות lysate תא המציגים את חרוזים זכוכית המיושבות וקרומים רצופים ואברונים בתחתית לאחר תמוגה וצנטריפוגה ב (א).. lysate רקמה מראה את הקרום ואברונים רצופים בתחתית לאחר הומוגניזציה וצנטריפוגה ב( B).
700 "/>
איור 3:.. מנגנון לתיוג של מדבב סכמטי המציג הצמדה קוולנטיים בין שאריות ציסטאין האתר הפעילים והקבוצה הפונקציונלית של HA-UB-VS אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: כתמים שחורים Amido של ממברנות ממברנות מראים הכתמים amido השחורים נעשו על lysates מודגרות עם -ethylmaleimide N (Nem), מתויגים עם HA-UB-VinylSulfone (VS) ולהפעיל על כתם מערבי.. הדגימות הן כדלקמן משמאל לימין - (א) הלה - nem, הלה + nem; (ב) מר תקנים, M17 -. Nem, M17 + nem אנא Click כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: תוצאות כתמים מערביים ממברנות מראים את רמות הפעילות של ממכן השונים כפי שנקבע על ידי חיטוט לאנטי-HA.. הדגימות הן כדלקמן משמאל לימין - (א) הלה - nem, הלה + nem; (ב) תקני מר; (ג) M17 -. Nem, M17 + nem אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאז ubiquitination היא פעילות סלולרית בסיסית, הבנת מנגנוני הרגולציה יכולה להיות המפתח לחושף את תהליכי המחלה ופתולוגיה. השימוש בHA מתויג בדיקות אתר מכוונות פעילים נגזרות UB דיווחו כאן מספקת שיטה קלה, אבל זה אפשרי מאוד ללימוד פירוק חלבונים בתיווך UB. שיטה זו היא מהירה יותר וזול יותר מאשר לימוד כל אחד מממכן בנפרד.
בשיטה זו, תמוגה של התאים מושגת באמצעים מכאניים - באמצעות חרוזי הזכוכית. שיטה עדינה זה של תמוגה שומרת תמונה תאית חילוף חומרים. עם זאת, חסרון עיקרי של שיטה זו הוא תמוגה היעילות הנמוכה של% על 60-70. זה אומר הרבה של תאים נדרשים על מנת להבטיח lysates מרוכז מספיק לניסויים. יש להשתמש בשכבות תאים ומחוברות 90% כדי לייצר lysate מרוכז - צלוחיות T75 עם 80. יתר על כן, צעד trypsinization הניסוי הוא קריטימשום שרוב התאים המצורפים חייבים להיות מושעה בפתרון. בדוק את הבקבוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שחלק משמעותי של התאים בתרבית צף לפני העברה לשפופרת 50 מיליליטר. אי trypsinize כראוי תאים חסיד יגרום גלולה קטנה יותר ועל ידי lysate פחות הארכה בריכוז נמוך יותר. Lysates שאינם בשימוש יש לאחסן ב -80 ° C, הועבר ל-20 ° C שעות 24 לפני השימוש ומופשר על קרח יום שימוש. זה מאפשר lysate להפשיר באופן שווה ומפחית את הנזק לאנזימים מהפשרה מהירה.
כדי להחיל שיטה זו לרקמות או dounce או homogenizer Polytron ניתן להשתמש במקום של חרוזי זכוכית 11. Lysate הושג יכול להיות מתויג עם הבדיקות באופן מיידי או מאוחסן לשימוש ב -80 ° C. אם dounce או Polytron משמש להשגת lysate אז לא אמורים לשמש חרוזי זכוכית. זה מוביל לירידה בריכוז החלבון הכולל של lysate.lternatively, תוך שימוש בשיטות תרבות תא ראשוני דגימות הרקמה מוצקות יכולות להיות מתורבתות ראשונה ולאחר מכן lysed עם חרוזי הזכוכית.
מגבלה עיקרית של שיטה זו היא שלמרות שזה מאפשר למשתמש לחזות את הפעילות של האנזימים, זה לא נותן מידע מדויק על דפוסי הביטוי של ממכן הבודד. שיטה זו משתמשת הומולוגיה פונקציונלית באנזימים לא הומולוגיה מבנית. לכן, ניסויים נוספים עם נוגדני האדם יצטרכו לעשות כדי להסביר אם הירידה בפעילות היא תוצאה של פגמים באתר הפעיל או הפסד בפועל של האנזים. בנוסף, שיטת תמוגה שימוש בפרוטוקול זה לא לפרוץ את הגרעינים של התאים. ממכן בגרעין יכול לספק מידע קריטי נוסף על תהליכי מחלה.
עם זאת שיטה זו היא ייחודית ביכולתה לספק מידע שלא ניתן להשיג מכל מקור אחר. שני RNA methoDS והשימוש בנוגדנים בודדים אינם מספקים מידע פונקציונלי על אנזימים. בעתיד, קיים הפוטנציאל ליישום של שיטה זו לimmunohistochemical מכתים (IHC). צביעת IHC לא רק לתת מידע על הפעילות של האנזימים, אבל זה יהיה גם לספק תובנות המיקום ברקמות שבו ממכן השונים פעילים. כמו כן, שיטה זו יכולה להיות בשילוב עם טכניקת חלוקה subcellular כגון אחד מפורט על ידי אל colla et. בשנת 2012 כדי ללמוד את הפעילות של ממכן באברונים קרום נכנסים 12. למרות שזה הוא טכניקה חדשה יחסית בביולוגיה מולקולרית, יש פוטנציאל עצום להרחבת היישומים. באמצעות בדיקות מולקולריות אתר מכוון פעילים עשוי להחזיק את המפתח להבהרת אטיולוגיה של מחלות רבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות למעבדה שלי באוניברסיטת מינסוטה למתן דגימות רקמת חוט השדרה העכבר שהיו בשימוש. עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה לתכנית ביטחון סרטן השחלות מחקר (OCRP) OC093424 לMB, על ידי חקר הסרטן וקהילה קרן רנדי מכונת גילוח לMB ועל ידי השחלות ברית סרטן מינסוטה (MOCA) לMB. היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PowerGen 125 (homogenizer) | Fischer Scientific | 14-261-02P | |
| Vacuum-driven filters 0.22 µm | BPV2210 | ||
| Glass beads, acid washed ≤106 µm (~140 U.S. sieve) | Sigma-aldrich | G4649-10G | |
| Sucrose | Fischer Scientific | S6-212 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-092 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Tissue culture flask 75 cm2 w/ filter cup 250 ml 120/cs | Cellstar | T-3001-2 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| HI FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag) | Enzo Life Sciences | BML-UW0155-0025 | |
| Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, reducing) | Boston BioProducts | BP-110R | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 |
References
- Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
- Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
- Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
- Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
- Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
- Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
- Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
- Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
- Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
- Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
- Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).
