Abstract
在开发过程中，造血干细胞源自血管内皮细胞的一个专门的子集，hemogenic内皮细胞（HE）。建模何发展体外为内皮造血过渡和造血规范机理研究必不可少的。在这里，我们描述了用于有效诱导贺从人多能干细胞（hPSCs）由不同组的转录因子表达的方式的方法。 ETV2和GATA1或GATA2转录因子的组合被用于诱导他以泛粒细胞潜力，而GATA2和TAL1转录因子的结合允许生产的贺红系和巨核细胞潜力。加入LMO2到GATA2和TAL1组合显着加快分化，增加红系和巨核细胞的生产。这种方法提供何感应的有效且迅速的方式从hPSCs并且允许进行观测的内皮hematopoieti的在文化菜C的过渡。该协议包括hPSCs转导程序和HE的转导后分析和血液祖细胞。
Introduction
人多能干细胞（hPSCs）的自我更新和分化为三个胚层，包括血细胞，使它们的有价值的工具为造血发育的机理研究，血液病的模型，药物筛选的独特能力，毒性研究，以及细胞疗法的发展。因为通过内皮的造血转变1,2血液形成从hemogenic内皮细胞（HE）的胚胎进行，HE的文化的产生是必须研究调节内皮细胞造血转变和造血规格的分子机制。目前的方法进行HE的研究是基于感应hPSCs与造血-支持基质细胞6,7或在二维培养与细胞外的hematoendothelial分化的聚集体（EBS）通过加入造血细胞因子3-5，和共培养矩阵和cytokines 8,9。这些经典的差异化方法的基础上推出的作用于细胞表面和启动的分子途径，最终导致转录程序指导hematoendothelial发展激活级联外部信号。因此，hPSCs分化在这些系统的效率依赖于有效的感应这些信号，信号转导到细胞核，将得到的特定转录调节子活化。此外，他在常规分化培养物中研究需要使用细胞分选分离HE细胞的附加步骤。在这里，我们描述了一个简单的协议，直接诱导HE和血液的造血转录因子的表达。这个方法允许有效地诱导贺在培养皿中并直接观察内皮造血过渡而不使用笨重细胞分选过程的必要性，HE的隔离。
何的形成和血液从人多能干细胞可以通过超表达只是几个转录因子（TF）被有效地诱导。能够从hPSCs诱导强大的泛骨髓造血转录因子的优化组合包括ETV2和GATA1或GATA2。与此相反，GATA2和TAL1的组合诱导erythromegakaryocytopoiesis 10。通过对这些因素的过度编程hPSCs分化hPSCs直接对VE-CAD + CD43 - CD73 - HE细胞逐渐获得 由早期造血标志物CD43 7表达定义的造血型。这种慢病毒为基础的方法的人多能干细胞的方法的直接编程适用于生成HE和血细胞的机理研究，内皮造血过渡研究，和造血发育和说明书的转录调控。虽然C使用，类似的结果可以用改性的mRNA 10来获得转基因的组成型表达urrent协议描述血液生产。
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Protocol
1.病毒制剂和转录因子组合
- 制备用含有编码蛋 白质的DNA的供ETV2，GATA1，GATA2，TAL1和LMO2（表1）PSIN-EF1α启动慢病毒表达质粒的解决方案。
- 测量通过记录紫外吸收用分光光度计在230nm，260nm处，和280nm用于慢病毒生产的质粒制备物的浓度和纯度。注：DNA制备展示A260 / 280和A260 / 230的值大于1.8通常被认为是良好的品质。低级A260 / 280值可以指示蛋白污染，而较低的A260 / 230值指示与盐或某些溶剂如苯酚杂质。推荐质粒浓度为1-3微克/微升。
- 在此前公布的协议11说明生产慢病毒的转导。感应HE与泛粒细胞潜力，需要共同表达ETV2和GATA1，或ETV2和GATA2的。感应HE与赤和巨核细胞潜力需要GATA2和TAL1。加入LMO2的显著改善赤型巨核细胞从hPSCs在GATA2和TAL1 10的存在的产率。
2. hPSCs文化协议
- 传代之前，锐边成长的多能干细胞集落紧至70-80％汇合。马克和删除传代细胞前自发分化的殖民地。
- 稀释商用细胞外基质凝胶（ 见表 2）根据制造商的说明书和外套6孔板过夜，在4℃，或者用于至少一个使用前小时，在37℃。前传代细胞，吸出基质中，添加2毫升新鲜商业完整culturemedium（ 见表 2），并保持在平板37 ℃，5％的CO 2，直至细胞准备播种。
- 通道hPSCs
- Aspira从6孔板与hPSCs之一汇合井，并添加1.5的预温热的Dispase II溶液忒介质（2毫克/毫升的DMEM / F12中，通过0.22微米的过滤器过滤灭菌）。孵育5-7分钟，在37℃，5％的CO 2，直至菌落的边缘开始从表面抬起。
- 抽吸分散酶II溶液并小心两次加入，然后吸移2毫升新鲜DMEM / F12培养基洗涤菌落。然后，用5ml的血清学玻璃吸管，游离hPSCs用3ml新鲜商业完全培养基（ 见表 2）通过吸取细胞悬液上下数次。
- 添加0.5 ml的细胞悬液，每孔一个6孔板含有1.5 ml的商用完全培养基的（ 见表 2）。搅动板来回和从右到左几次，以确保均匀的细胞分布境的板放入培养箱时。保持细胞在37℃，5％CO 2的18-24小时。
- 第二天换液，以新鲜的商业完全培养基（ 见表 2），并检查hPSCs形态。成功的传代导致小，良好的附着的菌落保留HPSC形态。 hPSCs必须以2.5-3毫升freshmedium每被馈送孔，每天传代每4-5天在不超过70-80％汇合更多。
注意：如果人iPS细胞维持在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），它们需要被转移至无饲养条件和传代转导前2-3次，以确保有效的分化。
从hPSCs（0天，hPSCs的转导）3.感应Hematoendothelial Pprecursors的
- 为了制备反应介质结合1.3商业完整无血清培养基（ 见表 2），病毒，聚凝胺，和Y27632 ROCK抑制剂（表1）：添加1.3微升10毫ROCK抑制剂以1.3毫升培养基至最终concentra灰为10μM，以及聚凝胺至终浓度6微克/毫升。
- 在0.5-1.0 MOI每个细胞每种病毒的最终浓度（感染复数）添加病毒浓缩物（S）的一个适当的量。保持反应介质在冰上或在4℃下，直到单细胞悬液是准备好了。
注：在GATA1 / ETV2，GATA2 / TAL1每种病毒的相同数量的MOI和GATA2 / TAL1 / LMO2的反应混合物是最佳的诱导分化。然而，在ETV2 / GATA2转导培养倍增教学语言GATA2，相对于ETV2，提高差异化。因此，对于这些培养物，比1：为ETV2的MOI和GATA2 1 MOI 2建议（例如，如果病毒的浓缩物，估计大约6.8×10 7个粒子/ ml，加10微升ETV2和20微升GATA2病毒浓缩物至每ETV2 / GATA2反应0.68×10 6细胞在6孔板的35毫米孔）。
- 在0.5-1.0 MOI每个细胞每种病毒的最终浓度（感染复数）添加病毒浓缩物（S）的一个适当的量。保持反应介质在冰上或在4℃下，直到单细胞悬液是准备好了。
- 在单个小区停赛制备hPSCsension。
- 如在第2节第4天生长在无饲养条件hPSCs下面的最后一段，观察倒置显微镜下细胞密度和形态。 hPSCs应在紧菌落边缘锋利成长没有自发分化和达到〜60-70％汇合的转导的天。
- 吸出培养基，加入1.5-2毫升每孔商用细胞解离试剂（ 表1）和在37℃，5％CO 2的5-7分钟。
- 收集细胞分化成商业完全培养基等体积的（ 见表 2）与10μM的ROCK抑制剂的，计数细胞并确定存活率。离心沉淀细胞，在200×g离心5分钟，然后重悬细胞在商业完全培养基用10μM的ROCK抑制剂的每毫升3.4-5×10 6个细胞的浓度。
注：细胞活力是成功的病毒转导和随后分化的关键。通常情况下，转导前细胞存活率超过90％。
- 加入200微升细胞悬浮液，含有0.68-1×10 6个细胞 ，成1.3 3.1制备的反应介质的溶液中。
- 吸在从2.2制备的过夜涂覆6孔板的基质溶液，将反应混合物转移6孔板的一个孔和均匀分布的细胞。在37℃，5％CO 2的24小时。 24小时后，至少80％的细胞应附到基质。
从hPSCs 4.感应Hematoendothelial前体（1-7天）
- 后24小时转导，除去含病毒的培养基，并与商业的不完整的细胞培养基洗涤附着的细胞（见表1），然后每商业不完全细胞培养介质中含有孔加入3毫升的造血细胞因子：SCF 100纳克/毫升，TPO 50纳克/毫升，20的bFGF纳克/毫升（以下称为3F-介质）。
- 替换总培养基用新鲜3F-介质上天2,3和4天以去除死细胞和碎片。 4天后，当浮动造血细胞不断涌现，更换一半3F-媒体隔日在保持总量以4ml。
注：PSIN-EF1α启动慢病毒表达质粒掺入嘌呤霉素抗性基因，从而允许阳性筛选转导细胞。在1μg/ ml的嘌呤霉素的可在第一1-2天的分化被加入到培养基，以消除任何残余的未分化hPSCs。 - 观察第4天的细胞形态在倒置显微镜下：紧细胞簇与典型的内皮形态的开始出现（ 图2A，3A）。圆形的血细胞似乎从第5天到分化的第7天，而一些地区可能保留hPSCs形态。如下所述分析HE和造血细胞分化。
注：成功hematoendothelial不同iation导致产生松散地附着到底层平面的内皮细胞显示为折射圆形细胞的血细胞。这些细胞增殖活跃地形成小聚集体，并最终分离和浮子（图2A和3A）。现场的血细胞可以从基于其反射光，并扩大培养条件的能力死者和垂死的细胞在视觉上区分开来。
5.分化Hemogenic内皮细胞（HE）阶段的分析。
- 用显微镜观察细胞的内皮形态检测何的天3和4分化之间的形成。有没有漂浮的血细胞的培养在这个阶段的分化。何的存在可以通过免疫荧光染色确认，用VE-钙粘蛋白，CD73，CD226和CD43的抗体流式细胞仪分析。
- 要在第3天评估流式细胞仪分析使用细胞HE形成4日从一个实验。通过将培养物与商业细胞解离试剂收集细胞（ 见表 1）5-10分钟，在37℃，5％的CO 2，然后用高达每染色反应1×10 5个细胞（流式细胞术中所述染色步骤12）。
注：VE-钙粘蛋白+ HE细胞获得的早期造血标志物CD226表达，但缺乏CD73和CD43 6的表达。与此相反，非何细胞表达CD73（ 图2B，3B）。
- 要在第3天评估流式细胞仪分析使用细胞HE形成4日从一个实验。通过将培养物与商业细胞解离试剂收集细胞（ 见表 1）5-10分钟，在37℃，5％的CO 2，然后用高达每染色反应1×10 5个细胞（流式细胞术中所述染色步骤12）。
- 免疫荧光染色HPSC源性何。
- 洗涤细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）的附单层，然后固定细胞在4％多聚甲醛为30〜60分钟，在室温下进行。
- 洗涤细胞再次用PBS清洗，然后透化使用在PBS中的0.1％的Triton X-100进行20分钟，在室温下进行。
- 在PBS 2洗涤细胞三次，然后在孵育封闭缓冲液由PBS中，用10％胎牛血清（FBS），30至120分钟。
- 制备染色溶液，同时含有初级抗体（1：1000稀释）的小鼠抗人CD43和兔抗人VE-钙粘蛋白在PBS有5％FBS，（ 表1）。
- 从细胞吸出封闭缓冲液并添加每染色缓冲孔1ml与添加的初级抗体;孵育3小时，在室温下，或过夜，在4℃。
- 加入2毫升的PBS有5％FBS洗涤细胞三次。
- 制备第二染色缓冲液，含有二抗以1：500在PBS中稀释有5％FBS：驴抗兔缀合绿色荧光染料，和抗小鼠缀合红色荧光染料（见表1）。加入1毫升每二次染色缓冲井和在室温下孵育1小时。
- 无血清洗涤三次，用PBS。染色细胞300nM的DAPI工作液中的dh2 O 10-15分钟。
- 用PBS洗涤细胞两次，加2-3毫升的PBS成很好地与着色细胞。观察荧光绿，红，蓝镜过滤器。
诱导造血前体6.分析
- 维持分化培养物，直到漂浮细胞显著扩大，达10-14天，更换一半3F-介质，如在3.1中描述，每两天。
- 分离并收集由用市售细胞解离试剂处理的细胞分化的细胞的单层（见表1）在37 5-10分钟 ℃，5％的CO 2。
- 执行流式细胞仪使用抗VE钙粘蛋白，CD43和CD45抗体，以评估造血培养12。需要注意的是一个大级分的细胞，至多ETV2和GATA2转导的细胞的40％，共表达VE-CAD和CD43。以下抗体可用于检测以下电子特定细胞谱系xpansion或诱发血液祖细胞分化：CD235a（红细胞），CD41a（巨核细胞），CD32（所有类型的骨髓细胞），CD66b（中性粒细胞）和CD163（巨噬细胞）。
- 使用根据制造商的说明市售克隆培养基（ 表1）进行的CFC-测定。
- 转移1-2×10 4个细胞于3ml商业克隆培养基（ 见表 3）以评估集落形成细胞和类型的造血集落的数目。最佳接种密度允许单个菌落分别增长相互不重叠的鉴定和分离。接种密度可根据分化效率实验之间有所不同，但应不超过每毫升克隆形成商业介质的1×10 4个细胞。
- 混合细胞克隆商业中由温和的震荡，而传输3毫升悬浮液中，以两张35毫米超低附着菜CFC的试验，1.5毫升悬浮液中每道菜。均匀分布介质和孵育在37℃，5％CO 2的14天。避免干扰的菜;观察第7天及测定第10天的集落形成。
- 根据自己的第14天的形态识别和计数造血集落。
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Representative Results
HE和从hPSCs通过转录因子过度表达血诱导的示意图示于图1。ETV2与GATA1或GATA2组合诱导泛骨髓造血，而一个GATA2，TAL1 +/- LMO2组合诱导主要赤型巨核造血。这两个TF组合直接诱发HE细胞随后转变为血液祖细胞与造血细胞分化的一个独特的光谱。从多能状态血液hPSCs分化产生，他对平均4天。圆形血细胞首次出现由分化第5天。随后，无数的漂浮的血细胞出现，并扩大在文化。为了最大限度地提高浮动血细胞的数量，转导后培养物可以延长到10-14天。细胞的所需谱系可以与造血细胞因子的适当组合的低粘附条件进行扩展。 图2 DEM的onstrates诱导血液使用ETV2 hPSCs和GATA1或GATA2转录因子。以下转导ETV2和GATA2，细胞获得了典型的内皮形态由分化的第4天，并最终转变成圆形的血细胞（6-8天的分化的（图2A）。收集天细胞3-4分化表现出典型VE-钙粘蛋白+ CD226 + CD73 - 。何表型（图2B，3B）通过分化的第7天的50％以上的VE-钙粘蛋白+细胞获得造血CD43 +表型 （图2C）的CFC-测定GATA2 / ETV2的。诱导的细胞显示，菌落由高增殖潜力（HPP）氟氯化碳，红细胞（E）氟氯化碳，巨噬细胞（M）氟氯化碳和粒细胞（G）的氟氯化碳（ 图2E），在hPSCs的hematoendothelial分化以下GATA2的过度表达和TAL1单独或与LMO2示于图3，HE阶段最好确定在培养物与GATA2和TAL1。加入LMO2的加速分化和明显收缩何阶段。单独或与LMO2的GATA2和TAL1组合表明分化和血液祖细胞的成熟大多红系和巨核细胞图3D和3E，图中H1人类胚胎干细胞用GFP慢病毒（A）转染效率和细胞死亡和分化效率4所示优化文化与转GATA2 / TAL1 / LMO2高，低MOI。
图1：协议诱导hemogenic内皮和血细胞的转录因子，通过卡通的强制表达示意图概述了主要的实验步骤和时间表。以下制备的单细胞悬液，hPSCs被转导与TF秒和在完全商业无血清培养基中接种在基质。第二天，培养基被替换为补充有bFGF的，TPO和SCF（3F中）生长因子自由的商业平台。继3-4天的培养，他就形成了。随后，他接受内皮与形成多种血细胞的造血转变。
图2：hPSCs的ETV2 / GATA2诱导分化（A）的ETV2 / GATA2诱导分化的人类胚胎干细胞的H1在天2，4，6和8转导后的相衬图像;比例尺，100微米。 （ 乙 ）ETV2 / GATA2诱导细胞经历内皮造血过渡在3分化天的流式细胞术分析：VE-钙粘蛋白+ HE细胞表达CD226和CD73缺乏表达。血管内皮细胞的一小部分表达CD73（非HE）。 （ 三）流式细胞术一ETV2 / GATA1-和ETV2 / GATA2诱导H1 hPSCs的第7天转导后nalysis。 （D）的扩大培养基补充有胎牛血清和SCF，IL3，IL6，GM-CSF，G-CSF和EPO的14天ETV2 / GATA2诱导造血细胞的流式细胞仪分析。 （五）从ETV2 / GATA2转导的细胞中CFC-法和相应的赖特-染色细胞离心涂片代表红细胞（E），巨噬细胞（M），粒细胞（GR）和高增殖潜能集落（高潜质）形成造血集落的类型。比例尺为CFC-分析，250微米，用于细胞离心涂片，20微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：GATA2 / TAL1和hPSCs的GATA2 / TAL1 / LMO2诱导分化GATA2（一）相衬图像/ TAL1 / LMO2诱导分化的人类胚胎干细胞的H1在天2，4，6和8;比例尺，100微米。 （ 乙 ）GATA2 / TAL1诱导细胞经历内皮造血过渡上分化的3天的流式细胞术分析：VE-钙粘蛋白+细胞获得HE标记物CD226的表达。血管内皮细胞的一小部分表达CD73（非HE）。 （ 三）在H1人类胚胎干细胞，一日5次GATA2 / TAL1诱导分化免疫荧光染色; VE钙粘蛋白+细胞（绿色）收购造血标志物CD43（红色）的表达。 （D）GATA2 / TAL1 /流式细胞仪分析LMO2致 在悬浮液中后第14天，转导如下扩展在补充有SCF，TPO，EPO和bFGF的无血清培养基中培养造血; （ 五）由相应的赖特染色的细胞离心涂片代表红细胞（E），巨噬细胞（M）和M GATA2 / TAL1 / LMO2分化cellsand形成CFC-检测造血集落的类型egakaryocytes（MK）。比例尺为CFC-分析，250微米，用于细胞离心涂片，20微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：慢病毒转导过程优化 H1胚胎干细胞（A）转染绿色荧光蛋白的慢病毒不同的教学语言。 （B）的细胞生存力和在培养物在低转导GATA2 / TAL1 / LMO2分化效率（每个病毒）和高（2对每种病毒）感染复数。
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Discussion
对于hPSCs通过转录因子的过表达造血分化的上述方法，表示了快速和有效的方法为HE和髓系和erytho-magakaryocytic祖细胞的产生由hESCs和iPS细胞，由此允许生产多达30百万血细胞从百万多能干细胞10。这种方法在多个人类胚胎干细胞和iPS细胞系10表现出一致的差异。在分化ETV2和GATA2，GATA1因素以及GATA2和TAL1因素，细胞形成的血液产生内皮细胞，他和经历的内皮细胞造血转变。何的形成天3和4分化的间所观察的通常。此外LMO2，TAL1的转录辅助因子，向GATA2和TAL1组合，显著增加分化的稳健性，而何阶段变得明显收缩。
针对不同点的成功hPSCs通过转录因子和灰主要取决于（ⅰ）有效递送核酸进入细胞，（ⅱ）细胞活力以下遗传操作，以及在细胞内的外源性转录物（iii）一种有效的翻译。
之一所描述的方法的关键步骤是生产有效的慢病毒单位，这取决于确切缓冲液pH为HEK 293T细胞的转染，和没有内毒素污染物的所有步骤的病毒产生和转导实验。所有构建体，包括包装和包膜质粒的完整性，如果病毒的生产在HEK 293T细胞中没有任何迹象观察到13必须验证。
使用转录因子组合的差异化方案设计应考虑几个变量。病毒转导的高效率对于成功的差异化很重要。由于转导效率取决于方法用于病毒生产和纯化，使用GFP-慢病毒载体，建议（图4A）优化HPSC转导。病毒整合以下转导应用基因组PCR用转基因特异性引物（见表3）进行验证。分化优化还应包括调整在反应混合物中慢病毒浓度。相对低量的病毒，0.5-1 MOI，能够诱导HPSC分化。而较高的感染复数增加分化的效率，这也增加了细胞死亡（ 图4B）。额外的优化步骤可以包括惯性矩比值调整为在反应混合物中每种病毒。在GATA2 / ETV2转导培养物，所述的MOI倍增为GATA2，相对于ETV2，增加分化的功效。对于GATA1 / ETV2，GATA2 / TAL1和GATA2 / TAL1 / LMO2等于MOI对每种病毒是最佳的。
继转导与转录因子，细胞的绝大多数underw耳鼻喉科angiohematopoietic分化，而只有极少数细胞保持未分化的形态。因为PSIN-EF1α启动慢病毒载体包括抗生素抗性，治疗培养嘌呤可用于消除残余未分化的细胞。
细胞具有特征性的内皮形态，和随后的轮血细胞的形成，表示成功的分化。平均起来，GATA2 / ETV2组合产生CD43的40-50％+ VE-钙粘蛋白+/-血细胞分化的9-10天剩余高达30％的细胞VE-钙粘蛋白+ CD43 - 。 GATA1 / ETV2组合更快地诱导CD43表达和产生相比，GATA2 / ETV2组合更大数目CD43 +细胞 。在这些文化中，大多数CD43 +细胞共表达VE-cadherin的。在培养转导的GATA2 / TAL1，CD43 +细胞的数目通常达到40-的50％。加入LMO2至GATA2 / TAL1基本上加速和增强的血液的生产，并显着收缩发展的内皮阶段。
菌落形成测定法应被用来确定诱发的造血祖细胞的频率和类型。集落形成细胞的性质可以通过制备莱特染细胞离心涂片从单个菌落被确认。 hPSCs转导ETV2和GATA2主要产生大的（大于0.5毫米的直径）高增殖潜能（HPP）髓组成未成熟粒和单核细胞的，具有一定的成熟骨髓细胞和偶尔红细胞和巨核细胞集落。在GATA2平均超过80％的氟氯化碳/ ETV2转导的文化是髓高潜质。此外，这些培养产生红细胞和巨噬细胞集落（图2E），这通常包括总的氟氯化碳小于20％。 HPSC转导ETV2和GATA1显著增加日CFC-E电子商务比例高达50％。 TAL1和GATA2转导的文化产生主要是红细胞（超过80％的总氟氯化碳）和巨核细胞集落（氟氯化碳总量超过10％），与极少数细胞巨噬细胞集落（氟氯化碳总量小于5％）。加入LMO2到TAL1和GATA2组合显著增加集落形成细胞的频率与赤型巨核细胞潜力10。氟氯活性以下转导与转录因子的所述组合模式是在不同的人类胚胎干细胞和hiPSC线10一致。
综上所述，在hPSCs慢病毒介导的过表达是一种相对快速和有效的工具，它使用的TF诱导贺和血液。这个系统也可用于评估其他转录因子的分化能力，并确定那些所需要的内皮细胞和造血规范。然而，当前协议已经为前有限的研究工具胞信令涉及何的诱导，因为它使用的TF绕过表面受体介导的信号传导。虽然目前的协议描述血液生产中使用的转基因的组成型表达，类似的结果可以用改性的mRNAs 10来获得。
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Disclosures
IS是创始股东和顾问Cynata。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells. |
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| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture. |
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| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration. |
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| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ -->3’ | Reverse (Rev) 5’-->3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | -- | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
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