Abstract
개발하는 동안, 조혈 세포가 혈관 내피 세포의 전문 집합에서 발생, hemogenic 내피 (HE). 체외에서 모델링 HE 개발은 내피 - 조혈 전환 및 조혈 사양의 기계 론적 연구에 필수적이다. 여기서, 우리는 전사 인자의 다른 세트의 과발현로서 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)로부터 HE의 효율적인 유도하는 방법을 설명한다. GATA2 TAL1 및 전사 인자의 결합은 적혈구 및 거핵 세포 가능성 HE의 생성을 허용하면서 ETV2 및 GATA1 또는 GATA2과 TF들의 조합은 팬 - 골수 가능성 HE를 유도하기 위해 사용된다. GATA2 및 TAL1 조합에 LMO2의 추가는 실질적으로 차별화를 가속화하고 적혈구와 거핵 세포 세포의 생산을 증가시킨다. 이 방법에서 hPSCs HE 유도 효율적이고 빠른 방법을 제공하고 내피 hematopoieti의 관찰을 허용배양 접시에서 C 전환. 이 프로토콜은 hPSCs 전달 절차 및 HE의 후 전달 분석 및 혈액 전구 세포를 포함한다.
Introduction
자기 갱신과 혈액을 포함한 세 가지 배엽의 세포로 분화하는 조혈 개발의 역학적 연구에 그들에게 가치있는 도구를 만들어, 혈액 질환의 모델링, 약물 검사에 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)의 독특한 능력, 독성 연구 및 세포 요법의 개발. 내피 조혈 전환 1, 2를 통해 (HE) hemogenic 내피 세포에서 배아 진행 혈액 형성, 문화 HE의 발생 조혈 전환 및 조혈 사양 내피 조절 분자 메커니즘을 연구하는 것이 필수적 것 때문에. 그는 연구에 대한 현재의 방법은 조혈-지지 기질 세포 6,7 또는 세포 외 두 개의 차원 문화 hPSCs의 조혈 사이토 카인 3-5의 추가와 골재 (사채)에서 hematoendothelial 분화 유도 및 공 배양을 기반으로 행렬과 C8,9 ytokines. 이러한 고전 분화 방법은 세포 표면에서 작용하는 결국 hematoendothelial 개발을 유도 전사 프로그램의 활성화로 이어질 분자 경로 캐스케이드를 개시하는 외부 신호의 도입에 기초한다. 따라서, 이러한 시스템에서의 분화 hPSCs의 효율은 그 신호의 효과적인 유도 핵 신호 전달 및 특정 전사 레귤레이터 얻어진 활성화에 의존한다. 또한, 기존의 분화 배양 년의 연구는 세포 정렬을 사용하여 HE에게 세포를 분리하는 추가 단계가 필요합니다. 여기, 우리는 조혈 전사 인자의 과발현에 의해 그와 혈액의 직접 유도를위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 복잡 셀 정렬 절차를 사용하여 HE의 분리를위한 필요없이 요리와 조혈 전환에 내피의 직접 관찰 년의 효율적인 유도 할 수 있습니다.
인간 만능 줄기 세포에서 HE의 형성과 혈액을 효율적으로 몇 전사 인자 (TFS)를 과발현에 의해 유도 될 수있다. hPSCs에서 강력한 팬 골수 조혈을 유도 할 수있는과 TF의 최적 조합은 ETV2 및 GATA1 또는 GATA2을 포함한다. 대조적으로, GATA2 및 TAL1의 조합 erythromegakaryocytopoiesis 10을 유도한다. CD73 - - 점차적으로 초기 조혈 마커 CD43 (7)의 발현에 의해 정의 된 조혈 표현형을 획득 그는 세포 이러한 요소의 과발현을 통해 hPSCs를 프로그래밍 직접에 hPSCs가 VE-CAD + CD43을 구별합니다. 인간 다 능성 줄기 세포에있어서의 직접 프로그래밍이 렌티 기반 방법은 역학적 연구 조혈 전이 내피에 대한 연구, 개발 및 조혈 및 명세서의 전사 조절을위한 HE 및 혈액 세포의 생성에 적용 할 수있다. C 있지만urrent 프로토콜은 유사한 결과가 수정 10의 mRNA를 사용하여 얻을 수 있었다 유전자의 구성 적 발현을 이용한 혈액 생산을 설명한다.
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Protocol
1. 바이러스 준비 및 전사 인자 조합
- pSIN-EF1α 렌티 바이러스 발현 플라스미드 ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 및 LMO2 (표 1)에 대한 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 솔루션을 준비합니다.
- 230 나노 미터, 260 나노 미터, 그리고 280 nm에서 분광 광도계 UV 흡수를 기록하여 렌티 바이러스 생산을 위해 사용 된 플라스미드 제제의 농도 및 순도를 측정한다. 참고 : 1.8보다 큰 DNA 준비 시연 A260 / 280과 A260 / 230의 값은 일반적으로 좋은 품질로 간주됩니다. 저급 A260 / 230 값이 염 또는 일부 용제와 같은 페놀 불순물을 표시하면서 하부 A260 / 280 값은 단백질 오염을 나타낼 수있다. 권장 플라스미드 농도는 1-3 μg의 / μL이다.
- 이전에 발행 된 프로토콜 (11)에 설명 된대로 transductions에 대한 렌티 바이러스를 생성합니다. 팬 골수 잠재력을 가진 그는 유도는 ETV2 및 GATA1, 또는 ETV2 및 GATA2의 공동 발현을 필요로한다.적혈구와 거핵 세포 잠재력을 가진 그는 유도는 GATA2 및 TAL1을 필요로한다. LMO2 첨가 크게 GATA2 TAL1 및 (10)의 존재하에 hPSCs 에리스로 거핵 세포에서 세포의 수율을 향상시킨다.
2. hPSCs 문화 프로토콜
- 계대 배양하기 전에 70~80%의 포화 상태에 날카로운 모서리에 꽉 식민지에서 만능 줄기 세포를 성장. 마크 제거는 자발적으로 세포를 계대 전에 식민지를 차별화.
- 4 ° C에서 하룻밤 제조업체의 지침과 코트 6 웰 플레이트에 따라 상업 세포 외 기질 젤 (표 2 참조) 희석, 또는 사용하기 전에 37 ° C에서 한 시간 이상. 세포를 계대 전에, 매트릭스 대기음 신선한 완전 상용 culturemedium 2 ㎖를 추가 (표 2 참조)를 37 ℃에서 플레이트를 유지 ° C는 세포까지 5 % CO 2는 파종을위한 준비가되어 있습니다.
- 통로 hPSCs
- ASPIRA(0.22 μm의 필터를 통해 여과하여 멸균 DMEM / F12 2 ㎎ / ㎖) 하나의 합류 hPSCs와 6 웰 플레이트의 잘 미리 예열 스파 아제 (Dispase) II 솔루션의 1.5 ml의 추가에서 테 매체. 콜로니의 에지면으로부터 들어 올려 시작할 때까지 37 ° C, 5 % CO 2에서 5-7 분 동안 배양한다.
- 기음 스파 아제 (Dispase) II 솔루션 조심스럽게 추가하고 신선한 DMEM / F12 배지 2 ㎖를 흡입에 의해 두 번 식민지를 씻는다. 다음에, 5 ㎖ 혈청 유리 피펫을 사용하여, 완전한 상용 신선한 배지 3 ㎖에 hPSCs 해리를 위아래로 수회 세포 현탁액으로 피펫 팅 (표 2 참조).
- 각 웰 완전한 상용 배지 1.5 ml를 함유하는 6- 웰 플레이트에 세포 현탁액 0.5ml를 추가하기 (표 2 참조). 인큐베이터에 접시를 situating 때 균일 한 세포 분포를 확인하기 위해 앞뒤로 및 오른쪽에서 왼쪽으로 여러 번에 판을 선동. 37 ℃, 5 % CO 2 1을위한에서 세포를 유지8-24 시간.
- 신선한 완전 상용 배지에 그 다음날 변화 매체 (표 2 참조) hPSCs 형태를 검토한다. hPSC 형태를 유지하는 작은, 잘 부착 식민지에서 성공적인 계대 결과. hPSCs 잘 매일 2.5-3 ml의 freshmedium 당으로 공급하고 70~80% 합류보다 더 이상 매일 4-5일를 계대해야합니다.
참고 : hiPSCs는 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)에서 유지 된 경우, 그들은 공급 장치가없는 상태로 전송하고 효율적으로 차별화를 위해 전달하기 전에 2 ~ 3 회 계대 배양 할 필요가있다.
hPSCs (일 0, hPSCs의 형질 도입)에서 Hematoendothelial Pprecursors 3. 유도
- 반응 매질 상업적 완전한 혈청 배지 1.3 ㎖의 결합 제조하려면, 바이러스, 폴리 브렌, 및 Y27632 ROCK 억제제 (표 1) (표 2 참조) : 최종 집중하고 1.3 ml의 배지에 10 밀리미터 ROCK 억제제 1.3 μL를 추가6 μg의 최종 농도 / ㎖ 내지 10 μM의 기, 및 폴리 브렌.
- 셀 당 각 바이러스의 0.5-1.0 방어의 최종 농도 (감염의 다중성)에서 바이러스 농축 (들)의 적절한 금액을 추가합니다. 단일 세포 현탁액이 준비 될 때까지 얼음 상 또는 4 ℃에서 반응 매질을 유지한다.
참고 : GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1의 각 바이러스에 대한 방어의 동일한 금액 및 GATA2 / TAL1 / LMO2 반응 혼합물은 분화 유도에 최적입니다. ETV2에 대해 GATA2에 대한 방어를 두 배로 그러나 ETV2에 / GATA2 형질 문화, 차별화를 강화한다. 따라서 이러한 문화에 대한, 비율 1 : ETV2의 관성 모멘트와 GATA2 1 MOI 2 권장 (바이러스 농축이 약 6.8 × 10 7 입자 / ㎖ 추정되는 경우, ETV2 10 μL 및 GATA2 바이러스 농축의 20 μL를 추가 예를 들어, 6 웰 플레이트의 35mm의 잘 하나 ETV2 / GATA2 반응 당 0.68 × 10 6 세포).
- 셀 당 각 바이러스의 0.5-1.0 방어의 최종 농도 (감염의 다중성)에서 바이러스 농축 (들)의 적절한 금액을 추가합니다. 단일 세포 현탁액이 준비 될 때까지 얼음 상 또는 4 ℃에서 반응 매질을 유지한다.
- 단일 세포 SUSP에 hPSCs 준비ension.
- 하루 4 일 2 항에서 기술 한 마지막 구절 다음 공급 장치가없는 상태에서 hPSCs 성장 거꾸로 현미경으로 세포의 밀도와 형태를 관찰한다. hPSCs는 전달의 날 ~ 60~70%의 포화 상태없이 자발적 분화와 날카로운 모서리에 꽉 식민지에서 성장하고 도달해야한다.
- 대기음 매체는, 웰 당 세포 해리 상업적 시약 (표 1) 1.5 mL를 추가하고 5-7 분 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양한다.
- 상업적 완전 배지 같은 부피로 세포를 수집하고 세포를 세고 생존력을 결정 ROCK 억제제의 10 μM과 (표 2 참조). 원심 분리에 의해 펠렛 세포 5 분 200 XG에 한 다음 ml의 당 3.4-5 × 10 6 세포의 농도로 ROCK 저해제의 10 μm의 상업 완전 배지에서 세포를 재현 탁.
참고 : 세포 생존에 성공 바이러스 전달 및 후속 차별화를위한 중요합니다.전형적으로, 전달 전에 세포 생존율이 90 %를 초과한다.
- 3.1에서 제조 한 반응 매질의 1.3 ml의 X10 0.68에서 1 사이에 106 세포를 함유하는 세포 현탁액 200 μl를 추가.
- 2.2 제조 밤새 코팅 된 6- 웰 플레이트에서 매트릭스 용액을 대기음., 6 웰 플레이트의 한 웰에 반응 혼합물을 전송 및 분배를 균등 세포. 24 시간 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양한다. 24 시간 후 세포의 적어도 80 %는 매트릭스에 부착되어야한다.
hPSCs에서 Hematoendothelial 전구체 (4) 유도 (주 7)
- SCF 100ng의 / ㎖, TPO : 24 시간 후 형질 도입, 바이러스 - 함유 배지를 제거하고 상업적 불완전한 세포 배양 배지와 함께 첨부 된 세포를 세척 조혈 사이토킨 (표 1 참조), 그리고 상업용 불완전한 세포 배양 배지의 잘 함유 당 3 mL로 추가 50 ng를 / ㎖, bFGF를 (이하 3F 매체 라 함) 20 ng를 / ㎖.
- 죽은 세포와 파편을 제거하는 일 2, 3, 4 일에 신선한 층 중간에 총 매체를 교체합니다. 부동 조혈 세포가 신흥 때 4 ml의에서 전체 볼륨을 유지하면서 4 일 후, 매일 3 층 매체의 절반을 교체합니다.
주 : pSIN EF1α-렌티 바이러스 발현 플라스미드시켜 형질 세포의 양성 선별을 허용 퓨로 마이신 내성 유전자를 통합. 퓨로 마이신의 1 μg의 / ㎖의 잔여 미분화 hPSCs을 제거 분화 제 1~2일 동안 배지에 첨가 할 수있다. - 거꾸로 현미경으로 4 일에 세포 형태를 관찰 : 전형적인 내피 형태와 세포의 꽉 클러스터가 나타나기 시작 (도 2A, 3A). 일부 지역은 hPSCs 형태를 유지할 수있는 반면 라운드 혈액 세포는 분화 일 7 일 5에서 나타납니다. 아래에 설명 된대로 그와 조혈 차별화를 분석합니다.
참고 : 성공적인 hematoendothelial 다른iation 느슨하게 기본 평면에 부착 된 내피 세포와 같은 굴절 둥근 세포 나타나는 적혈구의 생산을 초래한다. 이 세포들은 적극적으로 분리 및 플로트 (도 2A 및 3A) 결국 작은 집합체를 형성 증식합니다. 라이브 혈액 세포는 광을 반사 및 배양 조건에서 확장 할 수있는 능력에 기초하여 죽은 세포와 죽어 시각적으로 구별 될 수있다.
5. 차별화의 Hemogenic 내피 (HE) 단계의 분석.
- 내피 형태와 세포의 현미경 관찰에 의해 일 3과 분화의 4 사이의 HE의 형성을 감지합니다. 차별화의이 단계에서 문화에 부동 혈액 세포가 없습니다. HE의 존재는 면역 형광 염색에 의해 확인 및 VE-cadherin의, CD73, CD226 및 CD43 항체를 사용하여 유세포 분석을 흐르게 할 수있다.
- 3 일에 유세포 분석을 사용 세포에 의해 그는 형성을 평가하기 위해한 실험에서 하루 4. 상업적 세포 해리 시약 배양 배양하여 세포를 수집하고 37 ℃에서 50-10 분 동안 (표 1 참조), 그 다음 5 % CO 2 및 염색 반응 당 1 × 105 개의 셀을 사용 (에 기재된 염색 절차 유동 세포 계측법 12).
참고 : 카데 린을 VE + 그는 세포는 초기 조혈 마커 CD226의 발현을 취득하지만, CD73 및 CD43 (6)의 표현이 부족하다. 대조적으로, 비 - HE 세포는 CD73 (도 2B, 3B)을 표현한다.
- 3 일에 유세포 분석을 사용 세포에 의해 그는 형성을 평가하기 위해한 실험에서 하루 4. 상업적 세포 해리 시약 배양 배양하여 세포를 수집하고 37 ℃에서 50-10 분 동안 (표 1 참조), 그 다음 5 % CO 2 및 염색 반응 당 1 × 105 개의 셀을 사용 (에 기재된 염색 절차 유동 세포 계측법 12).
- hPSC 파생 HE에 대한 면역 형광 염색법.
- 인산 완충 식염수 (PBS)으로 세포의 부착 단층을 세척하고,이어서 실온에서 30 분 내지 60에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정한다.
- 세척 된 세포를 다시 PBS와 함께 실온에서 20 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100을 사용 Permeabilize 하시려면.
- 세 번 PBS 두 세포를 세척 한 다음에 품어30~120 분간, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)과 PBS로 이루어진 차단 버퍼.
- 일차 항체를 모두 포함하는 염색 액을 제조 (1 : 1000 희석) 마우스 항 - 인간 CD43의 토끼 항 - 인간 5 % FBS와 PBS에, (표 1)를 헤린 VE.
- 세포로부터 블로킹 버퍼를 대기음 첨가 일차 항체로 염색 완충액 웰 당 1 ㎖의 추가; 실온에서 3 시간, 또는 밤새 4 ° C를 품어.
- 5 % FBS와 PBS 2 ㎖를 첨가하여 세포를 세 번 씻으십시오.
- 1 차 항체를 포함, 두 번째 염색 버퍼를 준비 : 5 % FBS와 PBS 500 희석 : 당나귀 녹색 형광 염료, 및 적색 형광 염료 (표 1)과 결합 항 - 마우스가 결합 항 - 토끼를. 이차 염색 완충액 웰 당 1 ml에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
- 혈청없이 PBS로 3 회 세척 할 것. 300 nm의 DAPI는 DH에 솔루션을 작업하는 얼룩 세포10 ~ 15 분 동안 2 O.
- PBS로 세포를 두 번 씻고에 잘 염색 된 세포와 PBS의 2-3 ml를 추가합니다. 녹색, 빨간색과 파란색 현미경 필터와 형광을 관찰한다.
유도 조혈 전구 물질 6. 분석
- 3.1에 설명 된대로 떠있는 세포가, 3 층 중간의 절반을 변경, 10-14일까지 크게 확장 될 때까지 이틀, 차별화 문화를 유지한다.
- 해리 및 상업용 세포 해리 시약으로 처리하여 세포를 세포의 단층을 구별 수집 37에서 50-10 분 동안 (표 1 참조) ° C, 5 % CO 2.
- 문화 (12)의 조혈을 평가하기 위해 안티 - VE-cadherin의, CD43 및 CD45 항체를 사용하여 유동 세포 계측법을 수행합니다. 최대 ETV2 및 GATA2 형질 세포의 40 % 세포의 많은 부분이, 공동 표현은 VE-CAD 있고 CD43을합니다. 다음의 항체는 다음과 같은 예를 특정 세포 계통을 검출하는데 사용될 수있다xpansion 또는 유도 된 혈액 전구 세포의 분화 : CD235a (적혈구 세포), CD41a (거핵 세포), CD32 (골수 세포의 모든 유형), CD66b (호중구) 및 CD163 (대 식세포).
- 제조업체의 지시에 따라 상용 클론 원성 배지 (표 1)을 사용하여 CFC-분석을 수행한다.
- 상업적 클론 원성 배지 3 ㎖에 1-2 × 104 세포를 전송 콜로니 형성 세포 및 조혈 콜로니의 종류의 수를 평가하기 (표 3 참조). 최적의 시딩 밀도는 서로 별개로의 성장과 겹치지 않는 단일 콜로니의 동정 및 분리 가능하다. 시드 밀도는 분화 효율에 따라 실험에 따라 다를 수 있지만, 상업 클론 원성 배지 1 ㎖ 당 1 × 104 세포를 초과하지 않아야합니다.
- 부드러운 텍싱에 의해 상업 클론 원성 배지에서 세포를 혼합, 2 개의 35mm 매우 낮은 첨부 요리에 정지 3 ㎖를 전송CFC 분석, 각각의 접시에 서스펜션의 1.5 ml를합니다. 균등 매체를 배포하고 14 일 동안 37 ℃, 5 % CO 2에서 품어. 요리를 방해하지 마십시오; 7 일 및 분석의 날 (10)에 콜로니 형성을 관찰합니다.
- 14 일에 자신의 형태학에 따라 조혈 식민지를 확인하고 계산합니다.
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Representative Results
GATA2가, TAL1는 +/- LMO2 조합은 주로 에리스로 거핵 세포 조혈을 유도하면서 그와 전사 인자의 과발현에 의해 hPSCs에서 혈액 유도의 개략도는 팬 골수 조혈을 유도 GATA1 또는 GATA2 조합 그림 1. ETV2에 표시됩니다. 두 TF 조합 직접적이어서 조혈 분화 구별 스펙트럼 혈액 선조로 변환 HE 세포를 유도. 혈액 만능 상태에서 hPSCs의 차별화 그는 평균 사일 취 생산. 둥근 혈액 세포의 분화는 제 5 일에 의해 등장. 그 후, 다수의 부동 혈액 세포가 표시와 문화에 확장합니다. 혈액 세포를 부동의 수를 최대화하기 위해, 포스트 - 형질 배양 10-14 일 동안 연장 될 수있다. 세포 계보 원하는 조혈 사이토킨의 적절한 조합으로 둘러 접착 조건으로 확장 될 수있다.도 2의 DEMonstrates ETV2을 사용 hPSCs 및 GATA1 또는 GATA2과 TF에서 혈액의 유도. ETV2과 GATA2와 전달에 이어, 세포 분화의 날 (4)에 의한 전형적인 내피 세포 형태를 획득, 결국 라운드 혈액 세포 (하루 6-8 분화 (그림 2A)로 변환. 일에 수집 된 세포를 분화 3-4 전형을 보여 + CD226 + CD73-cadherin의를 VE -. 그는 (그림 2B, 3B)를 표현형 분화 7 일까지의 50 % 이상은 VE-cadherin의 + 세포는 조혈 CD43 + 표현형 (그림 2C)을 취득 GATA2 / ETV2의 CFC-분석을. 유도 된 세포 식민지가 높은 증식 전위 (HPP) CFC가 구성되어 있음을 밝혀, 적혈구 (E) 프레온, 대 식세포 (M) 프레온 및 과립구 (G), 프레온 (그림 2E). hPSCs의 hematoendothelial 차별화 GATA2의 과발현 다음과 TAL1 혼자 또는 함께LMO2이 그림 3. 그는 무대에 표시됩니다 최고의 GATA2 및 TAL1와 문화에서 식별됩니다. LMO2의 추가는 차별화를 가속화하고 크게 HE에게 무대를 계약. GATA2 및 TAL1 조합 단독으로 또는 LMO2와 주로 적혈구와 거핵 세포 세포 그림 3D 및 3E가.에 GFP 렌티 바이러스 (A)를 사용하여 H1 인간 배아 줄기 세포의 전달 효율 및 세포 사멸과 분화 효율의 4는 최적화 그림 분화와 혈액 전구 세포의 성숙을 보여줍니다 문화는 높고 낮은 관성 모멘트에 GATA2 / TAL1 / LMO2 형질 도입.
그림 1 :. TF가 만화의 강제 표현을 통해 hemogenic 내피 세포와 혈액 세포의 유도를위한 프로토콜의 개략도 주요 실험 단계 및 일정을 설명합니다. 단일 세포 현탁액의 제조 다음, hPSCs TF는 형질 도입되고S와 완전 상용 무 혈청 배지에서 매트릭스에 접종. 다음 날, 매체의 bFGF, TPO 및 SCF (3 층 중간)와 보충 성장 인자 무료 광고 매체로 대체됩니다. 배양 3~4일 다음, HE가 형성된다. 이어서, HE는 여러 혈액 세포의 형성과 조혈 전이에 내피 겪는다.
그림 2 :. hPSCs의 ETV2 / GATA2 유도 분화 (A) 일 2, 전달 후 4, 6, 8에서 H1 인간 배아 줄기 세포에서 ETV2 / GATA2 유도 분화의 위상 콘트라스트 이미지; 스케일 바, 100 μm의. (B) 하루 분화의 3에서 조혈 전환에 내피를 겪고 ETV2 / GATA2에 의한 세포의 유세포 분석 :-VE cadherin의 + 그는 세포는 CD226을 표현하고 CD73의 발현이 부족하다. 내피 세포의 작은 비율은 CD73 (비 HE)을 표현한다. (C) 흐름 세포 측정7 일 후 전달에 ETV2 / GATA1- 및 ETV2 / GATA2 유도 H1 hPSCs의 nalysis. (D) 14 일 동안 FBS와 SCF, IL3, IL6, GM-CSF, G-CSF와 EPO 보충 매체에 확장 ETV2 / GATA2에 의한 조혈 세포의 유세포 분석. (E) 적혈구 (E), 대 식세포 (M), 과립구 (할머니)과 높은 증식 잠재적 인 식민지 (HPPs)를 나타내는 ETV2 / GATA2 CFC-분석에서 형질 세포와 대응 라이트 묻은 cytospins 형성 조혈 식민지의 종류. cytospins에 대한 CFC-분석, 250 μm의에 대한 스케일 바, 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. GATA2 / TAL1 및 hPSCs의 GATA2 / TAL1 / LMO2 유도 분화 GATA2의 (A) 위상 콘트라스트 이미지 / TAL1은 / LMO2일 2, 4, 6, 8에서 H1의 인간 배아 줄기 세포에서 유도 된 분화; 스케일 바, 100 μm의. (B) 분화 3 일에 조혈 전환에 내피를 겪고 GATA2 / TAL1에 의한 세포의 유세포 분석 : VE-cadherin의 + 세포는 그가 마커 CD226의 발현을 획득. 내피 세포의 작은 비율은 CD73 (비 HE)을 표현한다. (C) H1 hESC의, 5 일에 GATA2 / TAL1 유도 분화의 면역 형광 염색; VE-cadherin의 + 세포 (녹색) 조혈 마커 CD43 (적색)의 식을 취득. (D) GATA2 / TAL1이 /의 유세포 분석 LMO2는 유도 SCF, TPO, EPO와 bFGF를 보충 무 혈청 배지에서 확장 다음 14 일 후 전달에 서스펜션의 조혈 문화; (E) 적혈구 (E), 대 식세포 (M) 및 M을 대표하는 라이트 묻은 cytospins 해당 GATA2 / TAL1 / LMO2 차별화 된 술로으로 CFC-분석 형성 조혈 식민지의 종류egakaryocytes (막). cytospins에 대한 CFC-분석, 250 μm의에 대한 스케일 바, 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 렌티 바이러스 전달 과정의 최적화 GFP의 렌티 바이러스의 다른 MOI와 H1 인간 배아 줄기 세포의 (A) 형질 도입.. (B) 세포 생존과 (각 바이러스 2) 차별화 (각 바이러스 1) 낮은에서 GATA2 / TAL1 / LMO2로 형질 문화의 효율성과 높은 관성 모멘트.
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Discussion
TF가의 과발현 hPSCs의 조혈 분화 상기 방법은 인간 배아 줄기 세포 및 이에 최대 30 수백만 혈액 세포의 생산에서 허용 iPSCs로부터 HE 및 골수와 erytho-magakaryocytic 전구 세포의 생성을위한 빠르고 효과적인 방법을 나타낸다 백만 만능 줄기 세포 (10). 이 방법은 다수의 hESC iPSCs 및 라인 (10)에 일관된 분화를 나타내었다. ETV2 및 GATA2로 분화하는 동안, GATA1 요인뿐만 아니라 GATA2 및 TAL1 요인, 세포, 그는 혈액 생산 내피 세포를 형성하고 조혈 전환에 내피를 받다. HE의 형성은 일반적으로 3 일 및 분화 (4) 사이에 관찰된다. 그는 무대가 현저하게 축소 된 반면 LMO2, TAL1의 전사 보조 인자를 첨가, GATA2 및 TAL1 조합에 크게 분화의 견고성을 증가했다.
감독 differentia의 성공전사 인자에 의해 hPSCs 기의 중심 (I)의 세포 내로 핵산의 효율적인 전달, (ⅱ) 세포 생존 유전자 조작에 따라, 상기 셀 내부의 외인 성적 (ⅲ) 유효한 번역에 의존한다.
상술 한 방법의 주요 단계 중 하나는 HEK 293T 세포의 형질 감염을위한 정확한 완충액 pH에 따라 유효 렌티 유닛의 제조 및 바이러스 생산 및 전달 실험의 모든 단계에서 내 독소 오염의 부재이다. HEK의 293T 세포에서 바이러스 생산의 흔적 (13)를 관찰되지 않은 경우 포장 및 봉투 플라스미드를 포함한 모든 구조의 무결성 확인해야합니다.
전사 인자의 조합을 사용하여 분화 프로토콜 디자인은 여러 가지 변수를 고려해야합니다. 바이러스 성 전달의 높은 효율을 성공적으로 차별화를 위해 중요하다. 전달 효율이 방법에 의존하기 때문에 바이러스에 사용생산 및 정제, 권장 (그림 4A)를 GFP - 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 hPSC 전달을 최적화 할 수 있습니다. 바이러스 성 통합 다음의 전달은 유전자 특이 적 프라이머 (표 3)과 게놈 PCR을 이용하여 확인해야합니다. 분화 최적화는 반응 혼합물 중의 농도 조정 렌티 바이러스를 포함한다. 바이러스 중 비교적 낮은 양, 0.5의 MOI는 hPSC 분화를 유도 할 수있다. 높은 MOI가 분화의 효율을 향상하면서, 또한 세포 사멸 (도 4b)을 증가시킨다. 추가적인 최적화 단계는, 반응 혼합물의 각 바이러스에 대한 MOI 비율 조정을 포함 할 수있다. GATA2에서 / ETV2가 GATA2의 관성 모멘트를 두 배로, 문화를 형질 도입, ETV2를 기준으로, 차별화의 효과를 증가시킨다. GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1 및 GATA2 / TAL1 / LMO2 각각의 바이러스에 대한 동일한 MOI에 최적입니다.
TF들과 함께 형질 도입 후, 세포의 대부분은 underw단지 아주 소수의 세포가 미분화 형태를 유지하면서 angiohematopoietic 차별화 이비인후과. pSIN EF1α-렌티 바이러스 벡터는 항생제 내성을 포함하기 때문에, 퓨로 마이신과 함께 배양 처리 잔여 미분화 세포를 제거하기 위해 사용될 수있다.
내피 모폴로지 특성 및 후속 라운드 혈액 세포와 세포의 형성은, 성공적인 분화를 나타낸다. 평균적으로, GATA2 / ETV2 조합 CD43 40-50 %의 생산 + VE-cadherin의 나머지 30 %의 세포 분화의 일 9-10 의해 +/- 혈구 VE-cadherin의 CD43 +가 -. GATA1 / ETV2 조합보다 신속 CD43의 발현을 유도하고 GATA2 / ETV2 조합에 비해 CD43 + 세포의 큰 수를 생성한다. 이러한 문화에서, + 세포가 같이 발현 CD43의 대부분은 VE-cadherin의를. / TAL1, CD43 + 세포의 수는 일반적으로 도달 GATA2 형질 문화 40-50 %. GATA2에 LMO2의 추가 / TAL1 실질적 가속 혈액 생산을 강화하고, 현저하게 발달 내피 스테이지를 축소.
콜로니 형성 분석은 유도 조혈 전구 세포의 빈도와 유형을 결정하는 데 사용되어야한다. 콜로니 형성 세포의 자연 개별 콜로니로부터 라이트 염색 cytospins를 제조함으로써 확인 될 수있다. ETV2 및 GATA2 형질 도입 hPSCs은 대부분 대형 (직경보다 0.5 ㎜) 일부 성숙 골수 세포와 가끔 적혈구와 거핵 세포 세포, 미성숙 과립구와 단핵구 세포로 구성 높은 증식 전위 (HPP) 골수 식민지를 생산하고 있습니다. GATA2에서 CFC를 평균 80 % 이상에서 / ETV2 형질 문화 골수 HPPs이다. 또한,이 배양 물은 일반적으로 총 프레온의 20 % 미만을 포함 할 적혈구 식세포 콜로니 (도 2e)를 생성한다. ETV2과 GATA1와 hPSC 전달이 크게 일을 증가50 %까지 CFC-E의 E 비율. TAL1 및 GATA2 형질 배양과 거의 식세포 콜로니 거핵 세포 콜로니 (프레온 전체의 10 % 이상) (프레온 전체의 5 % 미만) (프레온 전체의 80 %)의 대부분 적혈구 생산. TAL1에 LMO2 및 GATA2 결합의 첨가는 대폭으로 콜로니 형성 세포의 빈도를 증가 에리스로 거핵 세포 10 전위. 전사 인자의 조합 기재된 형질 다음 CFC 활동의 패턴과는 다른 hESC의 hiPSC 라인 (10) 사이에서 일치한다.
요약하면, hPSCs에서 렌티 바이러스 매개 과발현과 TF를 사용하여 HE의 유도 및 혈액에 대한 상대적으로 신속하고 효율적인 도구입니다. 이 시스템은 또한 다른과 TF의 분화 능력을 평가하기 위해 사용되며, 내피 및 조혈 명세서에 요구 된 것을 식별 할 수있다. 그러나, 현재의 프로토콜은 EX의 연구를위한 제한된 유틸리티가그것은 표면 수용체 매개 신호를 우회과 TF를 사용하기 때문에 tracellular, 그는의 유도에 관여하는 시그널링. 현재의 프로토콜의 구성 적 유전자 발현을 이용한 혈액 생산을 설명하지만, 유사한 결과가 수정 된 mRNA를 사용하여 10를 수득 할 수 있었다.
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Disclosures
IS는 Cynata을위한 창립 주주 및 컨설턴트이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells. |
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| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture. |
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| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration. |
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| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ -->3’ | Reverse (Rev) 5’-->3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | -- | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
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