Introduction
Наноструктурированные поверхности в последнее время привлекли значительное внимание из-за их различных потенциальных применений, в том числе структурирование, культуры клеток, очистки и переключения поверхности. Например, сверхгидрофобные поверхности вдохновленные наноструктуры листа лотоса и других чувствительных поверхностей способны реагировать на внешние раздражители 1-4.
Пленка Ленгмюра является одним из наиболее широко изученных полимерных покрытий. Пленка Ленгмюра формируется путем сбрасывания амфифильных молекул на интерфейс воздух-вода 5-8. Затем пленка может быть передана на твердую поверхность с помощью физической или химической адсорбции, и конформации молекулы на твердой поверхности , можно контролировать с помощью вертикальных и горизонтальных методы переноса 9-12. Плотность пленки Ленгмюра можно точно регулировать путем сжатия раздела воздух-вода. В последнее время этот метод также доказал свою эффективность для изготовления наноразмерных море остров СтруктурЕ. С. за счет использования амфифильных полиэфирных блок-сополимеров. Наноструктуры предполагаются состоят из ядра гидрофобных сегментов и оболочкой из гидрофильных сегментов 13-17. Кроме того, количество наноструктуры на поверхности регулируется путем регулирования площади на молекулу (м) блок - сополимера на границе раздела фаз.
Мы сосредоточились на оригинальной, уникальной каркасного свободной ткани инженерный подход, сотовый листовой инженерии, с помощью температуры реагирующих поверхности культуры. Разработанная технология была применена для регенеративной терапии для различных органов 18. Температура поверхности реагирующих культура была изготовлена прививкой поли (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), молекула температуры реагирующих, на поверхность 19-27. PIPAAm и его сополимеры демонстрируют более низкую критическую температуру раствора (НКТР) в водной среде при температуре около 32 ° C. Поверхность культуры также выставлены температуры реагирующих alternati на между гидрофобности и гидрофильности. При 37 ° С, PIPAAm привитым поверхность становилась гидрофобной, и клетки легко присоединены и пролиферируют на поверхности, а также на обычной тканевой культуры, полистирола. При понижении температуры до 20 ° С, поверхность стали гидрофильными, и клетки спонтанно отделяться от поверхности. Таким образом, культивированные сливные клетки на поверхности может быть собран в виде интактного листа путем изменения температуры. Эти клеточной адгезии и отслойка свойства также отображаются на поверхности сфабриковано пленочным покрытием Ленгмюра для лабораторной демонстрации 26, 27. Ленгмюра пленка блок - сополимеров , состоящих из полистирола (P (St)) и PIPAAm (St-IPAAm) был изготовлен. Пленка Ленгмюра с конкретнее м может быть горизонтально переданы гидрофобно модифицированной стеклянной подложке. Кроме того, оценивали клеточную адгезию на отрыв и от подготовленной поверхности в ответ на температуру.
_content "> Здесь мы описываем протоколы для изготовления наноструктурированного Ленгмюра пленки, состоящей из термореактивных отзывчивым амфифильные блок-сополимеры на стеклянной подложке. Наш метод может обеспечить эффективный метод изготовления для органических нанопленками в различных областях науки о поверхности и может способствовать более эффективный контроль клеточной адгезии на спонтанный и отрыв от поверхности.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Синтез Polystyrene- блока -poly (N -isopropylacrylamide) двухступенчатым Реверсивный Сложение фрагментации цепи передачи (RAFT) радикальной полимеризации
- Растворите стирол (153,6 ммоль), 4-циано-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) sulfanylpentanoic кислоты (ЕСТ; 0,2 ммоль), и 4,4'-азобис (4-cyanovaleric кислота) (ACVA; 0,04 ммоль) в 40 мл 1, 4-диоксана. Замораживание раствора в жидком азоте в вакууме в течение 15-20 мин, чтобы удалить реакционноспособные частицы и постепенно оттаивают при комнатной температуре. Убедитесь, что раствор полностью оттаяли и повторите эту сублимационной насос-оттаивания дегазацией три раза.
- Получение полистирола (ПСТ) (молекулярная масса: 13500) в качестве макро RAFT агента путем полимеризации при 70 ° С в течение 15 часов на масляной бане.
- Выпавший PSt макро ПЛОТА агент 800 мл эфира и сушат в вакууме.
- Растворите IPAAm мономер (4,32 ммоль), ПСТ макросъемки RAFT агент (0,022 ммоль) и ACVA (0,004 ммоль) в 4 мл 1,4-диоксана.
- Удалитькислород в растворе циклами дегазации сублимационной насос-оттаивание, как указано в пункте 1.1.
- Провести полимеризацию при 70 ° С в течение 15 часов на масляной бане после дегазации. Получить синтезированную молекулу Санкт-IPAAm (Mw: 32800) в том же порядке, что и макро RAFT агента ПСТ.
2. Приготовление силанизированы Гидрофобный модифицированными стеклянных подложках
- Wash стеклянные подложки (24 мм х 50 мм) с избытком ацетона и этанола и разрушать ультразвуком в течение 5 мин для удаления поверхностных загрязнений.
- Сухие субстраты в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение 30 мин. Затем с помощью кислородной плазмы (400 Вт, 3 мин) для активации поверхности подложек при комнатной температуре.
- Погружают субстратов в толуоле, содержащем 1% гексилтриметоксисилан в течение ночи при комнатной температуре, чтобы silanize субстрат.
- Промыть силанизированы субстратов в толуоле и погружают в ацетоне в течение 30 мин для удаления непрореагировавших веществ.
- Отжигать субстраты в течение 2 ч при 110 ° С, чтобы полностью иммобилизации Sтвое лицо.
- Нарезать силанизированы подложек с помощью резака стекла до 25 мм х 24 мм, чтобы соответствовать посуду культуры клеток (размер блюдо: φ35 мм).
3. Получение пленок Ленгмюра и кинопрессы перенесенную поверхности
- Поместите прибор пленки Ленгмюра в шкафу, чтобы предотвратить накопление пыли.
- Промойте желоб Ленгмюра (размер: 580 мм х 145 мм) и барьеры с дистиллированной водой и этанолом для удаления загрязняющих веществ.
- Сушат корыто и барьеры, протерев lintless полотенцем. Затем заполнить корыто с приблизительно 110 мл дистиллированной воды, а также установить барьеры на обеих сторонах желоба. Обратите внимание, что дистиллированная вода должна быть добавлена без просачивания в следующих шагах от 3.5 до 3.13.
- Тепло платины Вильгельми пластины (по периметру: 39,24 мм) для контроля поверхностного натяжения с газовой горелкой, пока пластина не становится красным, а затем промывают дистиллированной водой для удаления загрязнений. Приостановка пластину Вильгельми на проводе, прикрепленной кповерхность-измерения давления прибор.
- Обнулить поверхностного давления-измерительный прибор в соответствии с протоколом производителя. Сжать раздела воздух-вода на желобе с помощью барьеров на обеих сторонах желоба , пока интерфейс не достигнет приблизительно 50 см 2 без каких - либо капель полимера.
- Аспирируйте мелкие примеси, пока давление поверхности почти 0 мН / м.
- Переставьте барьеры с обеих сторон, и добавить дистиллированную воду, чтобы компенсировать уменьшение дистиллированной воды со стадии 3.6.
- Растворяют 5 мг синтезированной молекулы Санкт-IPAAm в 5 мл раствора развития хлороформа.
Примечание: дихлорметан или толуол, также могут быть использованы в качестве растворителя. - Аккуратно уронить 27 мкл St-IPAAm растворенные в хлороформе на желобе с помощью микрошприца или микропипетки.
- После ожидания в течение 5 мин, чтобы обеспечить полное испарение хлороформа, переместить обе барьеры в горизонтальном направлении, чтобы сжать molecu Сент-IPAAmле на границе раздела. Поддерживать степень сжатия барьеров на 0,5 мм / сек , пока целевой области 50 см 2 достигается.
Примечание: Быстрая скорость сжатия вызывает дефекты в пленке Ленгмюра. - Измерьте давление на поверхности (π) -A м изотермы с платиновой Вильгельми пластиной , прикрепленной к поверхности измерения давления инструмента во время сжатия в соответствии с протоколом производителя.
- После достижения размера целевой области, поддержания поверхности в течение 5 мин, чтобы позволить молекулы Сент-IPAAm отдохнуть; молекулы не достигают равновесия сразу после сжатия.
- Перенести пленка Ленгмюра к гидрофобно модифицированного стеклянной подложке с использованием передачи аппарата в течение 5 мин, чтобы робастно адсорбировать пленку. Закрепить гидрофобную стеклянную подложку параллельно на устройстве. Подключите устройство к стадии выравнивания и двигаться перпендикулярно.
- Поднимите подложку горизонтально с устройством передачи и высохнуть в течение 1 дня в desiccatoр.
4. Культивирование клеток и оптимизации клеточной адгезии и отрешенности на Ленгмюра передаваемую поверхности пленки
- Для приготовления суспензии клеток, культуры бычьей сонной артерии эндотелиальных клеток (BAECs) до одной трети впадения при 37 ° С в 5% СО 2 и 95% воздуха на тканевой культуры , полистирола (ТКТ) с Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) , содержащей 10% фетальной бычий сывороточный (ФБС) и 100 ед / мл пенициллина.
- После слияния достигается, лечить BAECs с 3 мл 0,25% трипсин-ЭДТА в течение 3 мин при температуре 37 ° С в 5% СО 2 и 95% воздуха.
- Деактивировать трипсин-ЭДТА, добавив 10 мл DMEM, содержащей 10% FBS, и собирают суспензию клеток в 50 мл коническую пробирку.
- Центрифуга при 120 х г в течение 5 мин, и аспирата супернатант. Повторное приостановить клетки с 10 мл DMEM.
- Поместите поверхности St-IPAAm под ультрафиолетовым светом на чистом столе для стерилизовать в течение 5 мин.
- Семенной восстановленную CELLS на St-IPAAm поверхности при концентрации от 1,0 × 10 4 клеток / см 2 , подсчитанных с помощью одноразового использования гемоцитометра и наблюдать клетки на поверхности с помощью микроскопа , снабженного термостате при температуре 37 ° С с 5% CO 2 и 95% воздух.
Примечание: Стерилизовать поверхности St-IPAAm ультрафиолетовым светом оборудованный для чистой скамейке. - Время записи покадровой образы прилипших BAECs в течение приблизительно 24,5 часов при 37 ° С с помощью фазового контрастного микроскопа с 10-кратным увеличением. После того, как BAEC адгезии, запись отряда BAECs с поверхности Санкт-IPAAm при 20 ° С в течение приблизительно 3,5 ч.
5. Сотовый лист Изготовление на Ленгмюра пленочным переданных поверхностей
- Культура BAECs, используемые в той же способом, описанным в разделе 4.
- Семенной в общей сложности 1,0 × 10 5 клеток / см 2 на Сент-IPAAm поверхностей и инкубировать в течение 3 -х дней при температуре 37 ° С в 5% CO 2. Сливной BAECs спонтанно отдельностоящий при 20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Блок - сополимеры , состоящие из полистирола и поли (N -isopropylacrylamide) (Сент-IPAAms) с конкретными молекулярными массами были синтезированы на плоту радикальной полимеризации. ЕСТ была подготовлена в качестве агента переноса цепи , как описано в Moad и др. 28. Были синтезированы две молекулы Сент-IPAAm различной длины PIPAAm цепи, а полученные блок - сополимеры были охарактеризованы с помощью 1 Н ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и гель - проникающей хроматографии (ГПХ). Молекулярные массы St-IPAAms были 32800 и 67900, с узким молекулярно-массовым распределением (1.31 и 1.50). Было обнаружено, что преобразования мономера полистирола макро RAFT агента и PIPAAm быть 17,4% и более 85,0%. Синтезированный St-IPAAms были названы St-IPAAm170 и St-IPAAm480 соответственно.
Ленгмюровские пленки с различных областях на молекулу (м) были изготовлены наИнтерфейс воздух-вода, понижая молекулы St-IPAAm растворенные в растворе хлороформа (рис 1А). После удаления молекул St-IPAAm, давление поверхности раздела воздух-вода была зафиксирована на уровне 0 мН / м и постоянно увеличивается путем закрытия интерфейса при сжатии с барьерами (рис 1В). Любые дефекты в ленгмюровских пленок , образующихся на границе раздела воздух-вода может быть выведено из π-A м изотермы. Приготовленный Санкт-IPAAm Ленгмюра пленки переносили на гидрофобно модифицированной стеклянной подложке (Санкт-IPAAm поверхности) (рис 1C). Пленка перенесенную поверхность оценивали с помощью атомно - силовой микроскопии (AFM). Рисунок 2 показывает AFM топографические изображения (1 х 1 мкм) поверхности St-IPAAm170 и St-IPAAm480. Наноструктуры наблюдались на поверхности St-IPAAm, в то время как такие структуры были лишь в редких случаях наблюдаются на голой гидрофобной подложке. Размер и форма наноструктур были сильно dependenт на А м и состав St-IPAAm. AFM топографические изображения подтвердили , что пленки Ленгмюра может быть однородно переносили на гидрофобной модифицированной стеклянной подложке и что поверхностные морфологию можно контролировать с помощью молекулярного состава и т.
Устойчивость пленки Санкт-IPAAm Ленгмюра оценивали с помощью нарушенного полного внутреннего отражения ИК-Фурье спектрометре (ATR / FT-IR). Количество PIPAAms на гидрофобной стеклянной подложке может быть оценена с помощью калибровочной кривой , полученной от пикового соотношения интенсивностей 1000 см -1 , полученного из стекла (Si-O) и 1,650 см - 1 , полученные из PIPAAm (C = O). Калибровочная линия была рассчитана из ряда известных количеств PIPAAm наложенные на гидрофобной стекле. Было обнаружено , что количество PIPAAm Санкт-IPAAm170 (10 нм 2 / молекула) и St-IPAAm480 (40 нм 2 / молекулу) на подложке равной 0,87 мкг/ см 2 и 0,63 мкг / см2, соответственно. Количество PIPAAm на поверхности после промывки дистиллированной водой была почти такой же, как и на поверхности без промывки. Эти результаты показали, что Сфабрикованный Санкт-IPAAm поверхности были стабильными в состоянии воды.
Далее мы изучили адгезию и отрыв бычьей сонной артерии эндотелиальных клеток (BAECs) на поверхности St-IPAAm. Время киносъемки адгезивных и отсоединение BAECs на поверхности St-IPAAm480 при 40 нм 2 / молекулы показана в мультфильме рисунке 1. Приверженец BAECs при 37 ° С быстро отсоединяется от обоих Сен-IPAAm170 и St-IPAAm480 уменьшив температура до 20 ° C. Количество прикрепленных клеток на St-IPAAm170 и St-IPAAm480 при температуре 37 ° С составляет 0,6 × 10 4 клеток / см 2 и 0,9 х 10 4 клеток / см 2, соответственно, что указывает , что количество адгезивного клеткиs модулировался составом поверхности St-IPAAm. Клеточные листы также могут быть восстановлены путем выдергивания вырожденные культивируемые BAECs с этих поверхностей Сент-IPAAm. Выделенную ячейку листа визуализировали в виде двумерной структуры клетки (рисунок 3). Клетки достигали сплошности после трех дней в культуре на St-IPAAm170 и St-IPAAm480 поверхности при 37 ° С, а клеточный лист быстро компенсировалась после понижения температуры от 37 ° C до 20 ° C. Влияние молекулярного веса и м Сен-IPAAms на восстановление клеток листа обобщены в таблице 1. Жизнеспособность клеточных листов оценивали путем окрашивания трипановым синим после отсоединения BAECs листа. Клетки обрабатывали трипсином-ЭДТА на стеклянной подложке при температуре 37 ° С, использовали в качестве контроля. были рассчитаны, чтобы быть приблизительно 11,0%, 7,7% и 11,7%, соответственно Мертвые отношения ячейки на St-IPAAm170, Сент-IPAAm480 и гидрофобной стеклянной подложке в качестве контроля. Эти результаты показали, что СЕЖизнеспособность LL была практически не зависит от снижения температуры.
Рисунок 1:. Получение thermoresponsive Ленгмюра пленки перенесенную поверхности (A) polystyrene- блок -poly (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAm) хлороформа раствор осторожно опустился на интерфейс воздух-вода. Поверхностное давление измеряли при сжатии для обнаружения каких-либо дефектов в пленке Ленгмюра. (B) Два барьера были использованы не для сжатия молекулы St-IPAAm на интерфейсе до целевой области 50 см была достигнута 2. (С) После сжатия гидрофобно модифицированную подложку покровное стекло горизонтально расположенные на границе раздела с этапа выравнивания в течение 5 мин. Субстрат был снят в горизонтальном направлении, и сушат в течение 1 дня. Эта цифра была несколько изменена из публикации СакУма и др. 27
Рис . 2: атомно - силовой микроскопии (АСМ) топографические изображения (1 х 1 мкм) Ленгмюра пленки трансформированных поверхностей (поверхности St-IPAAm) Левая панель: наноструктурные поверхности St-IPAAm170 с т о 10 нм 2 / молекулы. Правая панель: наноструктурные поверхности St-IPAAm480 с т о 40 нм 2 / молекулы. АСМ изображения были получены в режиме коснувшись с использованием кремниевым фосфата, легированного с пружинной константой 3 Н / м и резонансной частотой 70-90 кГц.
Таблица 1:. Восстановление бычьей эндотелиальной сонную артерию клеток (BAEC) лист из Ленгмюра пленки переносится поверхности с различной плотностью и длины цепи PIPAAm "Хорошо" представляет собой интактный CELL восстановления листов. "Едва оправившись" означает, что клетки могут быть культивированы confluently и культивируемые клетки показали, мало или вообще не отрыв от поверхности даже после снижения температуры. "Слабая адгезия" означает, что клетки не культивировали до сплошности при 37 ° С в течение 3-х дней. 
Рисунок 3: Макроскопическое изображение восстановленного листа клеток на Ленгмюра пленку переносят поверхности с St-IPAAm480 и A м 40 нм 
Анимированные Рисунок 1: . (Нажмите правой кнопкой мыши , чтобы скачать) ЗАМЕДЛЕННАЯ фотографии BAECs адгезии и отрешенности на Ленгмюра пленку переносят поверхности с St-IPAAm480 и Am 40 нм 2 / молекулы. Изображения были собраны с интервалами в 2 мин, а собранные фотографии были представлены в виде фильма на 960x скорости.Шкалы в фильме составляет 50 мкм. St-IPAAm170 St-IPAAm480 3 [нм 2 / молекула] 10 [нм 2 / молекула] 40 [нм 2 / молекула] 3 [нм 2 / молекула] 10 [нм 2 / молекула] 40 [нм 2 / молекула] Слабая адгезия Хорошо Едва оправившись Слабая адгезия Слабая адгезия Хорошо
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Температура реагирующих поверхность была изготовлена методом Ленгмюра-Шеффера, и свойства поверхности для адгезии клеток / отсоединени и клеток листа восстановления были оптимизированы. При использовании этого метода для изготовления поверхностей, несколько шагов, которые имеют решающее значение. Молекулярный состав молекул St-IPAAm оказывает большое влияние на структуру поверхности и стабильность поверхности, а также путем расширения, на клеточной адгезии и отрешенности. В частности, молекулы Сент-IPAAm должен иметь узкое молекулярно-массовое распределение. В нашем методе две молекулы Сент-IPAAm с различной длиной цепи PIPAAm синтезируют полимеризацией с плота, позволяющий контроль молекулярной массы и молекулярно-массового распределения.
Следует принять меры для предотвращения загрязнения раздела воздух-вода в процессе подготовки поверхности St-IPAAm, чтобы избежать дефектов в наноструктурах. Перед отбрасыванием полимерных молекул на границе раздела, contaminanTS должна быть отсасывают, пока давление не достигнет поверхности примерно 0 мН / м. Заражение имеет тенденцию накапливаться вокруг краев желоба и Пластинка Вильгельми. Поскольку пластины Вильгельми имел некоторое загрязнение на ее поверхности, она отжигают. Когда бумага Вильгельми пластина используется, шаг аспирации на границе следует повторить, по крайней мере в два раза. Кривая м изотерма π-А также зависит от наличия загрязнений на границе раздела воздух-вода. Мы рекомендуем, чтобы кривая изотермы быть получено более одного раза до изготовления пленки. Из-за загрязнения гидрофобного модифицированного стеклянной подложкой также может произойти, субстрат должен быть взорван со свежим воздухом или газообразным азотом для удаления загрязнений.
Для того, чтобы последовательно изготовить Ленгмюра пленки перенесенную поверхности (St-IPAAm поверхности), гидрофобный сегмент полимера имеет важное значение, так как гидрофобное взаимодействие между пленкой Ленгмюра и гидрофобного модифицированного стекла I S движущей силой реакции. В этом исследовании, так как блок-сополимер, состоящий из полистирола, который является сильно гидрофобным и гидрофильным PIPAAm при комнатной температуре, перенесенную пленку стабильно приклеивают к подложке, даже под водой или клеточной культуры условиях. Это указывает на то, что гидрофобные сегменты, играют важную роль в изготовлении надежной Санкт-IPAAm поверхность.
Для того, чтобы контролировать клеточную адгезию и отрыв от температуры реагирующих поверхности, как молекулярный состав и точный контроль плотности имеют важное значение. В этом методе Ленгмюра-Шеффера, площадь на молекулу (м) полимера , синтезировали заданного количества выпавших молекул и целевой области интерфейса воздух-вода может управляться посредством сжатия. Ам уронить молекулы St-IPAAm может теоретически быть рассчитана по следующей формуле:
d / 53465 / 53465eq1.jpg "/>
где А площадь интерфейса, M ш является молекулярная масса St-IPAAms, с - концентрация раствора хлороформа, Н А число Авогадро, а V представляет собой объем раствора полимера отброшен. Наномасштабные море островные структуры наблюдаются на St-IPAAm поверхностей после изготовления , так как амфифильные полимеры образуют самоорганизующиеся структуры на границе раздела воздух-вода, как описано в предыдущих исследованиях 13-17. Размер и количество наноразмерных структур контролировалось м и молекулярной массой St-IPAAms.
Адгезия клеток и отслойка оценивали на поверхности PIPAAm покрытием , изготовленных различными способами, в том числе Облучение электронным пучком, полимеризация RAFT поверхности инициируемого и нанесение покрытия центрифугированием 19-27. Так как плотность, молекулярная масса, и структура PIPAAm влияют на челл адгезию и отрыв, точные методы для изготовления поверхности PIPAAm с покрытием имеют важное значение. В этом методе Ленгмюра-Шеффера, плотность, молекулярная масса и поверхностные наноструктуры можно контролировать, как описано выше. Адгезия клеток и отрыв от поверхности St-IPAAm были сильно затронуты различные A м и St-IPAAm молекулярного состава, а также некоторые условия St-IPAAm поверхностей для клеточной адгезии и отслойки могут быть дополнительно оптимизированы. Эти результаты указывают на то, что этот метод может контролировать взаимодействие между поверхностью Сент-IPAAm и клеток.
Для воспроизводимо восстановления интактных клеток листа, конструкция амфифильного полимера является наиболее важным. Когда только гидрофильные полимеры изготавливают на поверхности методом Ленгмюра-Шеффера, полимеры с покрытием легко вымывается дистиллированной водой или культуральной среды. Этот результат показал, что слабый гидрофобный полимер не должен быть использован для воспроизводимо восстановления клеток листа в этом метамфетаминО.Д. поскольку полимер модифицированного поверхность была неустойчивой в состоянии воды. В нашем методе, гидрофильный сегмент амфифильного полимера обеспечивает надежную систему на изготовление поверхности без вымыванием с помощью водного раствора. Кроме того, так как пленка Ленгмюра параллельно переносили на стеклянную подложку в данном исследовании, наблюдались нанофазе морских островковых структур на поверхности. Хотя структура Ленгмюра пленки на базальной стороне хорошо известно, отличается от той, на апикальной стороне, структура была установлена с помощью параллельного переноса.
Клеточная терапия и регенеративная медицина были сосредоточены на возможности исцеления пациентов, которые не реагируют на другие виды лечения. Наша лаборатория разработала оригинальную, уникальную эшафот свободной ткани инженерный подход с использованием клеток листовой инженерии, изготовленную на температурной отзывчивым поверхности культуры с возможными приложениями в тканевой инженерии. Несколько клинических испытаний с сотовыми листами являются alreaау ведутся и продемонстрировали успешные результаты для нескольких типов тканей 29-31. Хотя BAECs были использованы в качестве источника клеток для изготовления клеточных листов и другие источники клеток, включая стволовые клетки, могут быть использованы для изготовления листов на поверхности St-IPAAm путем оптимизации комбинациям м и молекулярный состав молекул Санкт-IPAAm. Этот нетрадиционный технология будет способствовать не только легкой получения наноструктурных поверхностей, но и для основных стратегий для культивирования клеток для использования в регенеративной медицине.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide | Kohjin | No catalog number | |
| Azobis(4-cyanovaleric acid) | Wako Pure Chemicals | 016-19332 | |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | |
| 1,3,5-trioxane | Sigma-Aldrich | T81108 | |
| 1,4-Dioxane | Wako Pure Chemicals | 045-24491 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| PBS | Nakarai | 11482-15 | |
| Streptomycin | GIBCO BRL | 15140-163 | |
| Penicillin | GIBCO BRL | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| FBS | Japan Bioserum | JBS-11501 | |
| BAECs | Health Science Reserch Resources Bank | JCRB0099 | |
| Cover Glasses | Matsunami Glass Industry | C024501 | |
| AFM NanoScope V | Veeco | ||
| 1H NMR INOVA 400 | Varian, Palo Alto | ||
| ATR/FT-IR NICOLET 6700 | Thermo Scientific | ||
| GPC HLC-8320GPC | Tosoh | ||
| TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 | Tosoh | ||
| Langmuir-Blodgett Deposition Troughs | KSV Instruments | KN 2002 | KSV NIWA Midium trough |
| Nikon ECLIPSE TE2000-U | Nikon |
References
- Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).
- Fu, Q., et al. Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).
- Nykanen, A., et al. Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene. Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).
- Sun, T., et al. Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).
- Shuler, R. L., Zisman, W. A. A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods. J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).
- Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering. Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).
- Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface. Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).
- Jheng, K. T., Hsu, W. P. Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface. J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).
- Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer. Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).
- Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block. Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).
- Wang, S. Q., Zhu, Y. X. Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density. Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).
- Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP. Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).
- Seo, Y. S., et al. Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface. Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).
- Lu, Q., Bazuin, C. G. Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface. Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).
- Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly. Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).
- Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock. J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).
- Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface. Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).
- Yamato, M., Okano, T.
- Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer. Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).
- Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer. Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).
- Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes. Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).
- Kikuchi, A., Okano, T. Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs. J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).
- Fukumori, K., et al. Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties. Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest. Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).
- Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication. Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).
- Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 25 (5), 431-443 (2014).
- Sakuma, M., et al. Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication. Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).
- Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups. Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).
- Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. N. Engl. J. Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohki, T., et al. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).
- Sawa, Y., et al. Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case. Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).
