Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Toedienen en het detecteren van eiwit Marks op Insecten voor Verspreiding Onderzoek

Published: January 28, 2016 doi: 10.3791/53693
Automatic Translation
1, 1
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

Abstract

Monitoring geleedpotige beweging is vaak nodig om geassocieerd populatiedynamiek, dispersie patronen, voorkeuren waardplant, en andere ecologische interacties beter te begrijpen. Geleedpotigen worden meestal bijgehouden in de natuur door tagging ze met een uniek merk en vervolgens opnieuw verzamelen ze in de tijd en ruimte om hun verspreiding vermogen te bepalen. Naast de fysieke markeringen, bijvoorbeeld gekleurde stof of verf, verschillende soorten eiwitten hebben bewezen zeer effectief voor het markeren van geleedpotigen ecologische onderzoek. Eiwitten kunnen inwendig en / of uitwendig worden toegediend. De eiwitten kunnen vervolgens worden gedetecteerd ingehaald geleedpotigen met een proteïne-specifieke enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA). Hier beschrijven we protocollen voor extern als intern tagging geleedpotigen met eiwit. Twee eenvoudige experimentele voorbeelden worden gedemonstreerd: (1) een intern eiwit merk geïntroduceerd om een ​​insect door een eiwit verrijkte dieet en (2) een externe eiwit topisch een merktekenpplied een insect met een medische verstuiver. Vervolgens hebben we betrekking hebben een stap-voor-stap handleiding van de sandwich en indirecte ELISA methoden die worden gebruikt om eiwitten te merken detecteren op de insecten. In deze demonstratie worden verschillende aspecten van de overname en de detectie van eiwit markers op geleedpotigen merk afgifte-hervangst, mark-capture en soorten self-mark-capture van het onderzoek besproken, samen met de verschillende manieren waarop de immunomarking procedure is geweest aangepast om een ​​groot aantal onderzoeksdoelen passen.

Introduction

Het volgen van de beweging van atropodenplagen, natuurlijke vijanden (parasieten en predatoren) en bestuivers in de natuur is van essentieel belang voor een beter begrip hoe de ecosysteemdiensten te verbeteren. De belangrijkste component voor de meeste dispersie onderzoek is een betrouwbare methode om de geleedpotigen (s) van belang coderen. Een verscheidenheid van materialen (bijvoorbeeld verven, kleurstoffen, gekleurde stof, markeringen, zeldzame elementen, eiwitten) zijn gebruikt om geleedpotigen markeren hun populatiedynamiek, dispersie capaciteiten beoordelen voeden gedrag en andere ecologische interacties 1,2.

De geschiktheid van een merker voor een bepaalde spreiding onderzoek afhankelijk van het type studie uitgevoerd zijn. Er zijn drie grote indelingen voor het markeren van geleedpotigen: (1) mark-afgifte herovering (MRR), (2) mark-capture, en (3) self-mark-capture. Voor mark-afgifte herovering onderzoek, de onderzoeker markeert meestal de geleedpotigen collectief in het laboratory en vrijgeeft op een centraal punt in het veld. De geleedpotigen worden vervolgens heroverd op verschillende ruimtelijke en temporele intervallen met behulp van verschillende inrichtingen (bijv sweep net, vacuüm, vangplaat) 3,4,5. De heroverd monsters worden vervolgens onderzocht op het specifieke merk te onderscheiden vrijgelaten uit inheemse individuen. Voor mark-capture onderzoek, de onderzoeker geldt meestal het merk direct in het veld met behulp van spuitapparatuur (bv rugzak sproeier, giek en nozzle spuit). De beste markers voor mark-capture onderzoek zijn goedkoop en gemakkelijk aan te brengen op de habitat van de geleedpotigen's. Voor self-mark-capture onderzoek, de onderzoeker geldt meestal merken een geleedpotigen aas 6,7 of nestingang 8. Op zijn beurt, de geleedpotigen markeert zelf intern door het verslinden van de gemarkeerde aas of extern door "borstelen" tegen de mark zodra ze uit het nest.

Zoals hierboven vermeld, zijn vele soorten markers ons geweested van verschillende geleedpotigen taggen. Echter, weinig bruikbaar voor alle drie de verspreiding onderzoekscategorieën. De ontwikkeling van het eiwit immunomarking procedure een grote doorbraak voor het markeren van insecten. Immunomarking zet een eiwit label geleedpotigen intern of extern die op zijn beurt wordt gedetecteerd met een anti-eiwit-specifieke enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA). De eerste dergelijke proteïne markers gebruikt waren konijn immunoglobuline (IgG) en kip IgG / IgY 9,10. Ze bleek te zijn zeer effectief punten voor MRR en zelf-mark-capture onderzoek (zie bespreking). Helaas, IgG / IgY eiwitten zijn duur en daarom niet praktisch voor mark-capture onderzoek en de meeste vormen van self-mark-capture onderzoek. Vervolgens werden de tweede generatie eiwitdetectie ELISA's ontwikkeld voor de eiwitten die in kip eiwit (albumine), koemelk (caseïne) en sojamelk (trypsineremmer eiwit). Elke test is zeer gevoelig, specifiek en,Belangrijker gebruikt eiwitten die veel goedkoper zijn dan de IgG / IgY eiwitten 11 zijn. Deze eiwitten zijn effectief voor MRR, mark-capture, en zelf-mark-capture onderzoek (zie bespreking) bewezen.

In dit artikel beschrijven we en demonstreren hoe eiwitten merk retentie laboratorium studies uit te voeren. Dergelijke onderzoeken zijn de eerste fase van het onderzoek voor elk type veld dispersie studie. Specifiek, is het essentieel dat de onderzoekers weten hoe lang de markering op de beoogde geleedpotigen worden gehandhaafd dan het opstarten van veld dispersie studies. Hier beschrijven we en laten zien hoe je intern en extern te markeren insecten voor MRR, mark-capture, en zelf-mark-capture veld type studies. Vervolgens hebben we laten zien hoe de aanwezigheid van de merken op te sporen met indirecte en sandwich ELISA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Interne Mark Retention en Detection Procedure

  1. Interne markeringsprocedure
    1. Verzamel insecten van belang (n ≈ 100 personen) van een laboratorium kolonie gekweekt op een kunstmatig dieet of uit het veld en te verdelen in twee schone opfok containers.
    2. Plaats een regelmatige 20 ml voeding packet (alleen negatieve controlebehandeling) in een van de containers. Aanvulling op een tweede 20 ml kunstmatige voeding pakket met 1,0 ml van een 1,0 mg / ml kip IgG / IgY oplossing, meng goed, en plaats deze in de andere container.
      Opmerking: Als het insect van belang niet over een kunstmatige voeding, kan het merk op of in welke voeding ze normaal opgelopen op (bijvoorbeeld, groene bonen, mot eieren, water, suiker, honing) worden geplaatst.
    3. Laat de insecten om hun voedselopname te hervatten voor 24 uur.
  2. Interne mark retentie procedure
    1. Verwijder de voeding pakketten van elke container en leveren de insecten wi andere voedselbron om erachter staan ​​over de duur van het experiment (bijvoorbeeld groene bonen).
    2. Verzamel een cohort (n = 20) insecten per dag (of op elk gewenst tijdsinterval) van elke behandeling en onmiddellijk bij -20 ° C te bevriezen.
  3. Sandwich ELISA-procedure
    1. Voeg 50 ul van konijn anti-kippen IgY primair antilichaam verdund 1: 500 in Tris gebufferde zoutoplossing (TBS) aan elk putje van een schone ELISA microplaat en incuberen gedurende ten minste 1 uur bij RT (noot: de microplaten kan ook worden geïncubeerd O / N bij 4 ° C).
    2. Gooi het antilichaam van de plaat en blok elk putje met 300 ul van een 1,0% vetvrije droge melk oplossing gedurende 30 min.
    3. Tijdens het wachten op de vorige incubatie stappen, plaatst bevroren insecten individueel in 1,6 ml microcentrifuge buizen met 1,0 ml TBS.
    4. Grind elk insect met een schone stamper totdat grondig gehomogeniseerd en voeg 100 ul van elk monster aan een individu en van de ELISAbord. Laat de monsters geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    5. Voeg 100 ul negatieve (alleen TBS) en positieve (eiwit in TBS) controles aan putjes in de eerste kolom van elke ELISA-plaat. Ook, voeg 100 pl negatieve controles insect (alleen insecten) naar de 8 putjes in de laatste kolom van elke plaat (Figuur 1). Laat de controlemonsters te incuberen bij kamertemperatuur 1 uur. Merk op dat de sjabloon in figuur 1 is de template wij want ons standaard assays. De plaatsing van de monsters in de putjes is aan het oordeel van de onderzoeker.
    6. Was elk putje drie maal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) -tween en voeg 50 ul van konijn anti-kip IgG / IgY geconjugeerd met mierikswortelperoxidase verdund 1: 10.000 in 1% melk-oplossing en incubeer gedurende 1 uur bij KT.
    7. Was elk putje drie keer met PBS-Tween en voeg 50 pl tetramethylbenzidine (TMB) substraat aan elke well.
    8. Na 10 min, lees de putjesmet een microplaat spectrofotometer ingesteld op een golflengte van 650 nm.

Figuur 1
Figuur 1 een schematisch diagram toont de genormaliseerde goed benaming voor een typische 96 gats ELISA microtiterplaat. Elke plaat bevat 7 putjes gewijd aan Tris-gebufferde zoutoplossing negatieve controles (TBS), een goed gewijd aan een positieve controle proteïne (Pos Ctrl), 80 individuele putten gewijd aan heroverde insecten (Monster 1 ... 80), en 8 putten gewijd aan ongemarkeerde (negatieve) insect controles (Neg Ctrl 1 ... 8). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Externe Mark, retentie en Detection Procedure

  1. Externe kentekens procedure
    1. Verzamel insecten van belang (n ≈ 100individuen) uit een laboratorium kolonie of van het veld en plaats in twee 1,0 L plastic containers met een 2,5 cm diameter geperforeerd uit de zijkant van elke container.
    2. Spuit de insecten in de eerste houder met 1,0 ml dH 2 O (negatieve controlebehandeling) met een medische verstuiver. Spuit de insecten in de tweede houder met 1,0 ml van een 5,0% oplossing van kippen eiwit met een medische verstuiver.
    3. Bevestig de slang van de vernevelaar op een standaard laboratorium luchtuitlaat en vervolgens de monding van de vernevelaar in de 2,5 cm opening van de houder. Schakel vervolgens de luchtuitlaat langzaam tot de vernevelaar produceert een damp.
    4. Blijven spuiten (markering) tot het eiwit oplossing is afgegeven (ong. 2-5 min).
    5. Verwijder de vernevelaar en plaats een kurk in het gat van de plastic container. Laat de insecten bij kamertemperatuur staan ​​totdat de oplossing volledig droog.
  2. Externe merk retentie procedure
    1. Plaats elke behandeling van droge insecten in een andere schone fokken container latere blootstelling aan de markering te voorkomen.
    2. Voedsel en water toe te voegen aan de schone containers om de insecten te houden over de duur van de studie.
    3. Verzamel een cohort (n = 20) van insecten van elke behandeling dagelijks en onmiddellijk bij -20 ° C te bevriezen.
  3. Indirecte ELISA-procedure
    1. Plaats de bevroren insecten afzonderlijk in 1,6 ml microcentrifugebuisjes en voeg 1,0 ml TBS.
    2. Week de monsters gedurende 1 uur op een rondschudapparaat ingesteld op 120 rpm.
    3. Voeg negatieve en positieve controles, zoals beschreven in stap 1.3.5.
    4. Na het weken, Pipetteer 100 ul aliquot van elk monster in een van de 80 aangeduide monster putjes op een nieuwe 96 gats ELISA platen zoals getoond in figuur 1 Laat de monsters te incuberen gedurende 1 uur bij RT (noot:. De microplaten kan ook geïncubeerd O / N bij 4 ° C).
    5. Was de putjes drie maal metPBS-Tween en voeg 300 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing met 1% runderserumalbumine (PBS-BSA) aan elk putje.
    6. Na 30 minuten bij kamertemperatuur twee keer wassen met PBS-Tween.
    7. Voeg 50 ul van konijn-anti-ovalbumine primair antilichaam verdund 1: 8000 in PBS-BSA-Silwet (0,05%) aan elk putje en incubeer gedurende 1 uur bij KT.
    8. Was elk putje drie keer met PBS-Tween en voeg 50 pl geit anti-konijn IgG geconjugeerd met mierikswortel peroxidase verdund 1: 2000 in PBS-BSA-Silwet (0,05%) gedurende 1 uur bij KT.
    9. Was elk putje drie keer met PBS-Tween en voeg 50 ul van TMB substraat aan elke well.
    10. Na 10 min, lees de putjes van een microplaat spectrofotometer ingesteld op een golflengte van 650 nm.

3. Data Analysis

  1. Bereken de gemiddelde absorptie waarde van de 8 negatieve controle insecten op elke ELISA-plaat en berekent vervolgens de standaarddeviatie op basis van de gepoolde negatieve controles weerm alle ELISA-platen van een bepaalde studie 12.
  2. Voeg zesmaal de gepoolde standaarddeviatie van het gemiddelde resultaat voor elke ELISA-plaat met een ELISA positieve drempelwaarde te verkrijgen. Elke insect monster waarbij een absorptie die gelijk is aan of groter is dan deze waarde wordt als positief voor de aanwezigheid van het eiwit merk is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Interne markering:

De resultaten van de interne retentie markering proef zijn weergegeven in Figuur 2A. De berekende ELISA kritische drempelwaarde was 0,054. Algemeen (alle vier de sample data gecombineerd), de insecten behandeld zonder eiwit leverde constant laag ELISA waarden (X = 0,038 ± 0,002, n = 80). Omgekeerd alle insecten gevoed het eiwit verrijkte voeding leverde consequent sterke ELISA-waarden (X = 0,475 ± 0,221, n = 80).

Externe kentekens:

De resultaten van de externe retentie markering proef zijn weergegeven in Figuur 2B. De berekende ELISA kritische drempelwaarde was 0,082. Overall, de insecten lokaal gemarkeerd met alleen water leverden constant laag ELISA waarden (X = 0,048 ± 0,007, n = 80). Omgekeerd alle insecten topisch gemerkt met de eiwitten oplossing leverde consequent sterke ELISA-waarden (X = 0,746 ± 0,232, n = 80).

Figuur 2
Figuur 2. Gemiddelde (± SD) ELISA optische dichtheidswaarden van (A) insecten inwendig gemarkeerd met kippen IgY en (B) insecten uitwendig voorzien van kippen eiwit (albumine). Zwarte balken het gemiddelde ± SD ELISA optische dichtheidswaarden opgeleverd door ongemarkeerde insecten. Insect steekproefomvang voor elke dagelijkse eiwit behandeling was 20 personen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De geleedpotigen eiwit immunomarking procedure werd voor het eerst beschreven bijna een kwart eeuw geleden 9. Sindsdien is de procedure aangepast aan de verspreiding patronen van een breed scala van geleedpotigen met behulp van zowel intern als extern beheerd IgG / IgYs bestuderen. Deze eiwitten zijn standvastig markers gebleken voor uiteenlopende insectensoorten tot nu toe getest. Zoals hierboven genoemd, de belangrijkste beperking voor het gebruik van IgG / IgYs is dat ze erg duur. Bijgevolg IgG / IgYs zijn alleen bruikbaar voor MRR en zelf-markering soort studies waarbij grote hoeveelheden insecten in een kleine ruimte kan worden gemerkt of tekens kunnen in een dieet of aas worden opgenomen. Hier hebben we voorzien een eenvoudige demonstratie van hoe een intern merk door het voeden van de doelgroep insect een kunstmatige voeding verrijkt met kip IgG / IgY kan worden toegediend. Op zijn beurt werd het IgG / IgY gedetecteerd met een sandwich ELISA. Dit systeem zou vooral voordelig voor onderzoekers die al gebruik maken van een te zijndieet dat kippeneieren geproduceerd sinds de assay zal natuurlijk detecteren IgG / IgY in eieren. Daarnaast kunnen kleine hoeveelheden IgG / IgY eiwit topisch worden toegediend om insecten met de medische vernevelaar hierboven (Figuur 3A) beschreven. Een vernevelaar werd voor het eerst gebruikt om de massa merk zeer delicaat en kleine parasieten met konijn IgG type MRR onderzoek 3. Sindsdien zijn andere werkwijzen toegepast om IgG / IgY merktekens dienen voor geleedpotigen voor verspreiding onderzoek. Zo heeft parfumverstuiver toegepast om IgG / IgY markeringen passen op andere parasitaire species 13,14. Anderen hebben intern gemarkeerd verschillende insecten door ze te voeden (dwz self-markering) konijnen IgG gelabeld honing 14,15 of suiker water 16 (Figuur 3B). Tenslotte Baker et al. 7 toegevoerd karton termieten die is geïmpregneerd met konijnen IgG (Figuur 3C). Deze termieten gemakkelijk self-gemarkeerd als ze ingeslikt de aas etenvoeders.

Figuur 3
Figuur 3. Verschillende methoden om proteïne markering dienen: (A) fijne parasitoïden aangekruist chicken IgY met een medische verstuiver, (B) een parasitoid voeden met konijnen-IgG verrijkte honing oplossing, (C) termieten voeden met een konijn-IgG verrijkte karton aas, (D) honingbijen self-markering met droge melk als ze gaan door middel van een afstoffen apparaat geplaatst bij de ingang van een bijenkorf, (E) inheemse insecten worden gemarkeerd met melk in een katoenen veld met behulp van een conventionele spuitbus tractor tuig, (F ) inheemse insecten worden gemarkeerd met kip eiwitten met een giek en sproeistraal apparaat gemonteerd op een ATV, (G) inheemse insecten in een strook van alfalfa wordt gemarkeerd met kip eiwitten met een back-pak sproei-inrichting, en (H, I) inheemse insecten in alfalfa worden gemarkeerd met kip eiwitten met behulp van luchtfoto applicators. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

IgG / IgY eiwitten niet alleen gebruikt voor het bestuderen van insecten dispersie. Zij zijn ook gebruikt voor het bijhouden van trofische schakels van de geleedpotige voedselketen. Hagler en Durand 17 eerst voorgesteld het begrip merkteken prooi met IgG / IgY en, op zijn beurt, het uitvoeren van een IgG / IgY-specifieke sandwich ELISA darminhoud aan roofdieren die het gemarkeerde prooi geconsumeerd. Deze techniek heeft recent populair geworden onder gut Onderzoekers omdat het minder vervelend en kostbaar dan uitvoeren prooi-specifieke ELISA of polymerase chain reaction (PCR) type moleculaire darminhoud analyses (zie Hagler 18 en Fournier et al. 19 voor beoordelingen van de voor- en nadelen van de verschillende darm testtechnieken). In de afgelopen tien jaar heeft de prooi immunomarking techniek is gebruikt om de voedselopname van katoen roofdieren te identificeren op konijnen-IgG gemerkt plagen 18,20,21, trophallaxis en voeding relaties termietenkolonies behulp van een konijn IgG-behandeld papier voedselbron 22, granivory van een geleedpotige assemblage invasieve paardenbloem onkruidzaden gemarkeerd met konijn IgG 23, stink bug predatie tarieven op IgG-gemarkeerde tomaat hornworms op percelen onderworpen aan verschillende behandelingen semiochemische 24 verzameld en roofdier scavenging activiteit op IgG / IgY gemarkeerde aas 25.

Een tweede generatie van eiwitdetectie indirecte ELISA's werden bijna een decennium geleden ontwikkeld. Deze ELISA's zijn specifiek ontworpen om eiwitten in "off-the-shelf" voedingsmiddelen, zoals ei-albumine-eiwit in kippenei-eiwit, soja-trypsine-remmer eiwit in sojamelk en caseïne-eiwit detecterenin rundermelk. De tweede generatie eiwit immunomarkers zijn nuttig voor MRR, mark-capture en zelf-mark soort onderzoek bewezen. Bijvoorbeeld, Irvin et al. 26 aangetoond dat het mogelijk is om topisch markeren delicate parasitoïden met deze off-the-shelf eiwitten. Bovendien Hagler et al. 8,27 toonde aan dat de bijen kan self-merk met ei wit en rundermelk droge poeders zoals ze verlaten door een eiwit dispenser geplaatst bij de ingang van een bijenkorf (Figuur 3D). Misschien wel de meest creatieve gebruik van het eiwit betrokken markering richten koe pats met eiwitten met behulp van een jet sproeier 28. Op zijn beurt, het gezicht vlieg volwassenen verwierf een self-merk als ze kwamen uit hun popstadium en verlieten de koe pat.

Het belangrijkste kenmerk van de tweede generatie eiwit immunomarkers is dat zij gemakkelijk in massa hoeveelheden en tegen een fractie van de kosten van IgG / IgY eiwitten 11. Deze functie heeft revolutionized de weg gebied brede soort mark-capture onderzoek wordt uitgevoerd. Specifiek onderzoekers hebben nu een betrouwbare methode om snel en uniform tag geleedpotigen over uitgestrekte gebieden in het veld met behulp van diverse conventionele spray rig materiaal (figuur 3E). Zo zijn plaaginsecten rechtstreeks gemarkeerd boomgaarden en velden met behulp van draagbare kant gun Type sproeiers 29,30, door een trekker aangedreven Airblast sproeiers 31,32 en skid sproeiers 33. Horton et al. 34 gebruikte een elektrische sproei-apparaat gemonteerd op een all-terrain voertuig toepassingen van eiwitten om insecten bezetten dekking gewassen ingebed in een peer boomgaard (figuur 3F) lokaliseren. Ook Swezey et al. 5,35 gebruikt een rugzak sproeier om precieze toepassingen van kip eiwit gelden voor rijen van een alfalfa val gewas (een waardplant voorkeur) ingebed in een biologisch geteelde aardbeien veld om een plaag en zijn natuurlijke vijanden te markeren ( et al. 36 toegepast een uitzending toepassing koemelk en eiwit tot 29 en 16 ha bloeiende alfalfa, respectievelijk (figuur 3 H, I). Het doel van deze studie was om de bewoner geleedpotigen in de alfalfa te markeren, en vervolgens, na de alfalfa werd geoogst door maaien (vonken een verspreiding event), om de verspreiding patronen van de geleedpotigen in aangrenzende katoenvelden te volgen (een gewas gevoelig voor de schadelijke soorten).

Sommige gebruikers van de tweede generatie mark-capture procedure hebben de oorspronkelijke procedure enigszins aangepast aan hun specifieke behoeften aan onderzoek te voldoen. Het type en de grootte van t lichaamHij gerichte insect, samen met zijn gedragskenmerken, zal het volume en de concentratie van het merk nodig is en hoe het merk wordt toegediend 37 dicteren. Bovendien zal de methode om insecten in het gebied heroveren afhankelijk van deze factoren. Tot op heden gebruikte vrijwel elke werkwijze (bijv vangplaten, sweep netten, stofzuigers) om insecten te verzamelen is met succes gebruikt om gemarkeerde insecten 3,5,8,11,29,31,32,35,38 verzamelen. Vanwege de extreme gevoeligheid van het eiwit detectie ELISA, benadrukken wij dat grote zorg moet worden gezorgd dat alleen specimens niet verontreinigd tijdens het verzamelen of sorteren werkwijzen 38.

De oorspronkelijke studie 11 dat de tweede generatie van eiwitten markeersystemen (dwz, ei-albumine, caseïne en soja trypsine remmer) beschreven gemeld factoren die testgevoeligheid kan variëren tussen de typen marker. Specifiek toonden ze aan dat diflende waterbronnen, additieven (surfactanten), en zelfs het type ELISA plaat gebruikt aangetast (positieve of negatieve) de assay. Bovendien, dat studie en latere studies 37,39,40 bleek dat de drie eiwitten merk detectie assays variëren in effectiviteit. Het eiwit marker is langer dan de melk marker, die langer werd behouden dan sojamelk marker behouden. Deze resultaten benadrukken het belang van het testen eiwit retentie stempel op een bepaald insect voorafgaand aan het aanbreken van veldonderzoek. Ook deze tweede generatie indirecte ELISA's tonen soms een lage niveau van achtergrondgeluid met bepaalde soorten insecten (bijv herbivoren) (pers. Obs). Deze achtergrondruis kan worden verminderd door toevoeging van 100 pl waterstofperoxide aan elk putje van de ELISA-plaat gedurende 30 min tussen Step 2.3.4 en 2.3.5 stap in het bovenstaande protocol (unpubl. Gegevens).

Opgemerkt wordt dat de indirecte ELISA's gebruikt om de tweede generatie proteïne merken heeftzijn zeer effectief in het detecteren van het eiwit insecten gedrenkt in de monsterbuffer. De indirecte ELISA's zijn niet zo effectief als de sandwich ELISA op het ontdekken interne eiwit vlekken of prooi eiwitten op insecten. Studies hebben aangetoond dat de indirecte ELISA's zijn niet zo efficiënt als sandwich ELISA's bij het ​​detecteren van eiwit in gehomogeniseerde insecten monsters 34,41.

Een belangrijke factor om te overwegen bij elke ELISA is dat de procedure toont vaak plate-to-plate (hoofdzakelijk toegeschreven aan dag tot dag effecten waarop een assay) variabiliteit 42,43. Daarom is het essentieel dat elke ELISA-plaat omvat: (1) één of meer TBS alleen negatieve controles, (2) één of meer TBS + zuivere eiwit positieve controles, en (3) ten minste acht negatieve controles insectencellen (bijv personen bekend niet aan een eiwit merk bevatten). Alleen de TBS, TBS + eiwit, en insecten negatieve controles verzekeren dat de buffer is niet een bron van fouten, worden de reagentia goed werken, eennd dat er geen eiwitten in de insecten die steken respectievelijk reageren met de ELISA reagentia. Bovendien is het insect negatieve controles zijn essentieel voor het berekenen van ELISA drempelwaarden (zie hieronder). Het plaatontwerp getoond in deze demonstratie opgenomen 7 TBS blanks, 1 eiwit + TBS positieve controle (eerste kolom) en acht negatieve controles (in de laatste kolom) op elke ELISA-plaat (Figuur 1).

Een andere belangrijke factor om te overwegen bij het hanteren ELISA gegevens een drempelwaarde bepalen van een insect van de aanwezigheid of afwezigheid van een eiwit merk te scoren. De werkwijze die oorspronkelijk door Stimmann 44 voorgesteld voor het maken van rubidium gemarkeerde insecten werd gedefinieerd als het gemiddelde niveau van de marker in een pool van ongemarkeerde insecten plus driemaal de standaardafwijking van de vrijstaande individuen. Deze werkwijze is ook gebruikt als de gebruikelijke methode voor het maken van insecten op de aanwezigheid van eiwitten merken 9,17. In sommige cases, onderzoekers intuïtief gekozen conservatieve drempelwaarden om de kans op het verkrijgen van vals positieven te verminderen. De eenvoudigste methode is om voeg 4-6 standaardafwijkingen van het gemiddelde van de negatieve controles plaats van drie 18,34. Een meer verfijnde methode om de kans op het verkrijgen false positives verder te verlagen is voorgesteld door Sivakoff et al. 12. Deze methode berekening van de gemiddelde absorptiewaarde van de acht negatieve controle insecten op elke ELISA-plaat en de standaardafwijking berekend op basis van de gepoolde negatieve controles van alle ELISA-platen van een bepaald onderzoek.

Kortom, een betrouwbare werkwijze voor geleedpotigen label is cruciaal voor het succes van de meeste studies dispersie. Verschillende werkwijzen zijn gebruikt voor geleedpotigen eiwitten markeert de laatste twee decennia. Eiwit immunomarking en de detectie van de merktekens zijn relatief eenvoudig en goedkoop en zeer aanpasbaar aan een groot aantal studies. Toekomstige gebruikers van de immunomarking techniek moet ervoor zorgen dat hun methode is geschikt om de specifieke kenmerken van hun onderzoek. De concentratie en het volume van het merk nodig is en hoe het merk wordt toegepast zal afhangen van factoren zoals gedrag, lichaam het type en de grootte van de doelsoort 40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie is uitsluitend voor het verstrekken van specifieke informatie en impliceert geen aanbeveling of goedkeuring van het Amerikaanse ministerie van Landbouw. USDA is een gelijke kans provider en werkgever.

Acknowledgments

De financiering werd verstrekt door USDA CRIS 5347-22620-021-00D en, gedeeltelijk, door de Landbouw en Voedselvoorziening Research Initiative Competitive Grant niet. 2011-67009-30141 van de USDA Nationaal Instituut voor Voedsel en Landbouw. We zijn dankbaar voor de technische ondersteuning van Johanna Nassif. We danken ook Paul Baker, David Horton, Diego Nieto en Frances Sivakoff voor het verstrekken van een aantal van de foto's die in figuur 3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Food storage container (for insect rearing) Rubbermaid/Tupperware Various sizes Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window
Small volume nebulizer (Micro Mist) Teleflex-Hudson RCI 1881 Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.
Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap Continental Lab Products 4445.X Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.
Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) RPI Corp. 145746 This design is nice because it doesn't crowd the tubes.
Dispenser, repeater Eppendorf 4982000322 Anything similar will help speed up the dispensing.
Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml Kimble Chase 749521-1500 Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.
BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) BD 351172
Ovation pipette, manual (20-200 µl) VistaLab 1057-0200 or 1070-0200 Any similar type will work. This model is ergonomic.
Reservoirs, sterile reagent VistaLab 4054-1000 Anything similar will work.
Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730391 If you had to pick one electronic model, this size is most useful.
Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730361 Anything similar will work.
Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) Sigma-Aldrich Z369802  Anything similar will work for manual plate washing.
Microplate reader with absorbance detection Molecular Devices SpectraMax 250 Anything similar will work.
Chicken IgG/IgY United States Biological I1903-15R Also available from other sources
Egg whites Grocery store “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution
Tris (Trizma Base) Sigma-Aldrich T1503 2.42 g/L to make TBS
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g⁠/⁠L for PBS
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S0876 1.14 g/L for PBS
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 0.2 g/L for PBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 0.2 g/L for PBS
Tween 20, EIA grade Sigma-Aldrich P1379 Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.
PBS with 1% BSA Sigma-Aldrich P3688 Mix 1 packet in 1 L dH2O
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) Sigma-Aldrich C6409 Mix 100 µl in 50 ml TBS
Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) Grocery store Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) Sigma-Aldrich A9046 Mix 100 µl in 1 L of 1% milk
Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) Sigma-Aldrich C6534 Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) Sigma-Aldrich A6154 Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer Lehle Seeds VIS-01 Add as last ingredient
TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate SurModics TMBW-1000-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  2. Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151 (2004).
  3. Hagler, J. R., Jackson, C. G., Henneberry, T. J., Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675 (2002).
  4. Blackmer, J. L., Hagler, J. R., Simmons, G. S., Henneberry, T. J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625 (2006).
  5. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Hagler, J. R., Pickett, C. H., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778 (2013).
  6. Hagler, J. R., Baker, P. B., Marchosky, R., Machtley, S. A., Bellamy, D. E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220 (2009).
  7. Baker, P. B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Synder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155 (2010).
  8. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Machtley, S. A., Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12 (2011).
  9. Hagler, J. R., Cohen, A. C., Bradley-Dunlop, D., Enriquez, F. J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25 (1992).
  10. Hagler, J. R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086 (1997).
  11. Jones, V. P., Hagler, J. R., Brunner, J., Baker, C., Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836 (2006).
  12. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85 (2011).
  13. Hagler, J. R., Jackson, C. G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016 (1998).
  14. Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53 (2009).
  15. DeGrandi-Hoffman, G., Hagler, J. R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306 (2000).
  16. Peck, S. L., McQuate, G. T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731 (2004).
  17. Hagler, J. R., Durand, C. M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265 (1994).
  18. Hagler, J. R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345 (2011).
  19. Fournier, V., Hagler, J. R., Daane, K., de Leòn, J., Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640 (2008).
  20. Hagler, J. R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator--prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165 (2006).
  21. Mansfield, S., Hagler, J. R., Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206 (2008).
  22. Buczkowski, G., Wang, C., Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182 (2007).
  23. Lundgren, J. G., Saska, P., Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6), 1642-1652 (2013).
  24. Kelly, J. L., Hagler, J. R., Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77 (2014).
  25. Zilnik, G., Hagler, J. R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814 (2013).
  26. Irvin, N. A., Hagler, J. R., Hoddle, M. S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12 (2011).
  27. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Van Deynze, A., Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14 (2011).
  28. Peck, G. W., Ferguson, H. J., Jones, V. P., O'Neal, S. D., Walsh, D. B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122 (2014).
  29. Boina, D. R., Meyer, W. L., Onagbola, E. O., Stelinski, L. L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258 (2009).
  30. Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X. M. S., Stelinski, L. L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10 (2015).
  31. Krugner, R., Hagler, J. R., Groves, R. L., Sisterson, M. S., Morse, J. G., Johnson, M. W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289 (2012).
  32. Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. Entomol. Exp. App. , (2015).
  33. Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A. L., Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408 (2010).
  34. Horton, D. R., Jones, V. P., Unruh, T. R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56 (2009).
  35. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Pickett, C. H., Hagler, J. R., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369 (2014).
  36. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303 (2012).
  37. Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171 (2012).
  38. Hagler, J. R., Machtley, S. A., Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34 (2015).
  39. Hagler, J. R., Jones, V. P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192 (2010).
  40. Hagler, J. R., Naranjo, S. E., Machtley, S. A., Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782 (2014).
  41. Hagler, J. R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32 (1998).
  42. Clark, M. F., Adams, A. N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483 (1977).
  43. Crowther, J. R. The ELISA guidebook. , Humana Press. Totowa, NJ. (2001).
  44. Stimmann, M. W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328 (1974).

Tags

Environmental Sciences Immunomarking insect ELISA mark-capture mark-afgifte heroveren self-mark
Toedienen en het detecteren van eiwit Marks op Insecten voor Verspreiding Onderzoek
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagler, J. R., Machtley, S. A.… More

Hagler, J. R., Machtley, S. A. Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research. J. Vis. Exp. (107), e53693, doi:10.3791/53693 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter