Introduction
혈관 성형술은 동맥 경화증과 같은 병리학 적 조건에서 결과 좁아진 또는 방해 동맥을 확대하는 데 사용되는 혈관 절차입니다. 혈관 성형술 중 하나 흔한 합병증은 수술 부상과 이후의 염증에 의한 혈관 리모델링으로 인해 발생 후 운영 신생 내막의 증식, 또는 재 협착이다. 이러한 조건은 혈관 부드러운 세포 및 여러 병태 생리 학적 결과 1-3의 확산으로 이어질. 신생 내막의 증식 용기를 재 - 두껍게하고, 제 1 년 이내에 60 % 후 혈관 성형술 환자까지에서 발생합니다. 따라서, 재 협착은 널리 사용되는 혈관 성형 절차 (4)의 큰 방해가된다. 약물 용출 스텐트의 주입이 재 협착을 방지하는 데 도움이 될 수 있지만, 선택된 후보는이 비용이 많이 드는 절차 (5)를받을 수 있습니다.
동물과 임상 연구 모두 만성 염증이 vascu에 의해 생성 된 것을 설립LAR 부상 및 / 또는 수술 상처 후 혈관 신생 내막의 성장 2,4-의 주요 자극 역할을합니다. 따라서, 쥐 풍선 경동맥 손상 모델을 모방 임상 적 상황과 혈관 재 형성 및 혈관 증식 6-9에 관련된 세포 계수를 식별하기위한 유용한 모델 시스템으로서 기능한다. 이 모델 시스템은 전임상 연구 병진 10-14에서 신생 내막 성장을 억제 약물 및 치료 시약 매우 유용한 평가 도구 및 / 또는 스크린이다.
뮤린 경동맥 와이어 손상 모델 (15) 및 쥐의 대퇴 동맥 와이어 손상 모델 (16), 쥐 경동맥 풍선 손상 모델이 입은 부상의 재현을 용이하게 시술의 용이성을 위해 크기가 충분히 큰 있다는 장점을 가진다 비교. 그것은 되어온 대 일차 전지의 더 큰 개수 (예, 혈관 평활근 세포, 내피 세포)를 제공 할 수있다하는 ional는 시험 관내 연구 혈관 재 형성을 지배하는 분자 메커니즘을 묘사하기. 중요한 것은, 마우스에 비해 래트는 생리 학적 연구 (17)을위한 더 나은 모델이 알려져있다. 래트 모델의 단점 또는 제한 유전자 변형 유전자 녹아웃 모델의 부족이지만, 이러한 단점은 래트 게놈 시퀀스의 가용성 및 렌더링 CRISPR-CAS 기술 강력한 게놈 편집 도구의 최근 발전에 의해 극복 될 수있다 다른 모델 시스템 (18, 19)의 게놈 서열의 광대 한 범위의 수 조작.
쥐 풍선 손상 모델이 여러 연구소 및 다양한 포괄적 인 프로토콜에 의해 사용되었지만 (20, 21)을 발표 한,이 프로토콜은 사전 수술 준비에 대한 자세한 내용을 제공하는 것을 목적으로이 수술 연습을 설정하려면이 절차에 새로운 연구를 안내 할 수 있습니다. 우리는 또한 t의 수술 후 관리를 강조살아있는 동물 13,22에서뿐만 아니라 동맥 리모델링에 대한 치료 효과의 사후 병리 및 histomorphological 분석뿐만 아니라, 초음파 초음파 연구 허용 그는 동물.
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Protocol
참고 : 쥐 풍선 손상 모델과 재조합 sRAGE 초음파 초음파 연구의 주입을 포함하여 관련 절차의 사용은 노화에 국립 연구소의 동물 관리 및 사용위원회 (ACUC), NIH에 의해 승인되었습니다.
1. 사전 수술 준비
- 악기, 외과 플랫폼 및 개인 보호 장비.
- 이 절차에 사용 된 모든 수술기구 및 시약에 대한 재료 및 장비의 표를 참조하십시오. 수술하기 전에 모든 수술 도구를 압력솥.
참고 : 같은 날에 실시 여러 수술의 경우, 수술 사이에 악기를 소독하기 위해 미리 가열 된 유리 구슬 살균기를 사용합니다. - 70 % 알코올로 운영 플랫폼의 표면을 소독. 수술 가운, 헤어 커버, 수술 용 마스크, 보호 안경, 장갑 착용. 추가 우리를 위해 수술 플랫폼 근처에 멸균 장갑의 상자를 남겨이자형.
- 이 절차에 사용 된 모든 수술기구 및 시약에 대한 재료 및 장비의 표를 참조하십시오. 수술하기 전에 모든 수술 도구를 압력솥.
- 풍선 카테터의 준비.
- 멸균 물 1 ML의 주사기를 입력하고 멸균 물이 채워진 두 방향 스톱 콕에 주사기를 연결합니다. 부드럽게 풍선 카테터의 루어 잠금 부를 작성하고, 카테터의 개구부로부터 공기 방울을 제거하기 위해 꼭지를 통해 물을 밀어.
- 풍선을 보장하기 위해 테스트 풍선 인플레이션 물 0.02 ml로 팽창 할 수 있습니다. 탈수 및 오염을 방지하기 위하여 수술 전 멸균 용기에 풍선의 끝 부분을 저장한다.
- 마취 및 동물 준비.
- 남성의 Wistar 쥐 무게 (4백-4백50그램)과 ID를 확인하기 위해 귀 태그를 확인합니다. 예를 들면 발가락이나 꼬리를 곤란으로 페달 철수 반사를 확인하여 진정 작용의 깊이를 확인 후, 유도 챔버에서 쥐를 놓습니다 기화기를 켜고 3.5-4.0 %로 이소 플루 란 레벨 1.5-2.0 L.에 산소 레벨을 조정 동물의.
- (마취에 도달 한 후
- 마취의 수술 수준에 도달 한 후, 바로 동물 머리를 가위로 흉골 위 아래 턱에서 복부 목 부위를 면도하고 포비돈 - 요오드 및 70 % 에탄올 3 회 1:10 희석을 교대로 면도 피부를 닦아.
- 건조되는 것을 방지하기 위해 면봉으로 동물의 개방 눈 안과 솔루션을 놓습니다. 동작 중에 건조를 방지하기 위해 물을 마시는 동물의 혀와 입 적셔.
- 멸균 된 수술 용 시트 래트 커버와 목 부위를 노출 낱장. 앙와위 오의 동물을 배치NA는 의사를 향해 머리 수술 플랫폼에 패드를 가열. 테이프를 사용하여 수술 플랫폼 동물의 사지를 고정.
2. 외과 적 치료
- 해부과 왼쪽 경동맥의 분리
- 모든 방법을 바로 흉곽 위의 흉골의 상단에 꼬리를 향해 한 방향으로 턱 아래 직선 절개를 만들기 위해 메스를 사용합니다. 퉁명스럽게 근육 층을 노출 피부 아래 침 샘 조직을 해부하는 7S 집게를 사용합니다. 별도 근육 조직 경동맥 혈관 목 영역에있는 미주 신경에 액세스한다.
- 퉁명스럽게 경동맥을 주변 조직을 해부, 조심스럽게 미주 신경 및 혈관 근막이 손상을 방지하기 위해 분리. 계속 흉골 아래로 내부 및 외부 가지와 경동맥을 노출 경동맥 분기점까지 해부.
- Arteriot의 준비OMY
- 수축과 지혈를 들어, 왼쪽 경동맥에서 가장 근위 사이트에서 합자 및 분기점에 위치 즉시 말단에서 또 다른 합자를 배치합니다.
- 헤드쪽으로 동맥 후퇴 최대한 분기점으로부터 외부 경동맥에서 4.0 실크 봉합사를 배치했다. 영구 상행 인두, 후두 및 혈관 누출을 방지하기 위해 우수한 갑상선 포함한 외부 경동맥 따라 4.0 실크 봉합사를 이용하여 작은 동맥 결찰.
- 중요한 역행 혈액 손실을 방지하기 위해 내부 경동맥 주위에 4.0 실크 봉합사를 놓습니다. 일반적으로, 내부 지점의 가용 길이는 최소화된다. 내부 경동맥을 시각화하기 위해 부드럽게 오른쪽 위에 놓인 경동맥의 동맥을 수축하여 가능한 한 많은 내부 경동맥을 노출.
- 풍선 카테터의 소개
- 일반적인 경동맥 A의 근위 봉합을 후퇴rtery와 일시적으로 혈액의 흐름을 중지 선박에 동맥 클램프를 놓습니다. 가능한 봉합 원위부 같은 위치에서 외부 경동맥에 절개 작은 (동맥의 원주의 1/4 1/3)을 만든다.
- 조심스럽게 절개로 미 - 팽창 풍선 카테터를 삽입 한 후 경동맥에 동맥 클램프에 가까운 루멘에 카테터를 진행합니다. 클램프를 제거하고 추가 절개에서 약 35~40mm, 대동맥 궁에 풍선 카테터를 진행합니다.
- 풍선 부상
- 수동 연결된 주사기를 통해 0.02 ㎖의 부피로 팽창 카테터 후 주사기 카테터의 콕을 잠글. 천천히 회전에 카테터를 철회. 카테터가 arteriotomic 절개에 가까운 경우, 풍선을 수축. 다시 원래 위치로 카테터를 진행합니다.
- 총 3 회 2.4.1를 반복합니다. 조심스럽게 동맥 내강에서 카테터를 제거합니다.
- 외과 상처를 닫습니다
- 봉합으로 arteriotomy를 닫습니다. 혈액의 흐름을 복원하기 위해 내부 경동맥을 놓습니다. 동맥 출혈이나 누출이 있는지 확인합니다. 출혈이 발생하는 경우, 지혈을 위해 약간 압력 거즈를 적용한다.
- 절차에 사용되는 봉합 및 클램프의 나머지 부분을 제거합니다. 6.0 봉합과 선의 조직을 닫습니다. 피부 봉합이나 상처 클립으로 피부를 닫습니다. 이소 플루 란을 끄고 몇 분 동안 순수 산소와 동물을 둡니다.
치료 3. 관리, 진통제, 수술 후 관리 및 안락사
- 치료 및 진통제의 투여.
- 수술 후, (0.03 ㎎ / ㎏) 근육 부 프레 노르 핀을 주입. 수술 중 혈액 손실을 보상하기 위해 5 ml의 사전 예열 멸균 식염수 피하 주사. 복막에 sRAGE (0.5 NG의 /의 g) (치료제)를 주입한다.
- OPH 다시 눈을 적셔thalmic 연고. 열 패드에 쥐를 배치하고 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 완전한 의식을 회복 할 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
- 깨끗한 침구와 케이지에 쥐를 돌려 다시 동식물 사육장에 케이지를 가져온다. 담당 수의사와 관리인을 경고하기 위해 새장에 특별한 관찰 카드를 놓습니다.
- 수술 후 정리
- 휴지통 또는 특별 처분 용기에 두 바늘 등 패드, 면봉을 포함하여 사용되는 수술 재료를 넣습니다. 수술 플랫폼을 소독하고 수술 도구를 청소하십시오.
- 수술 후 케어
- 48 시간 수술 후 기간 동안 프레 노르 핀 (0.03 ㎎ / ㎏) 하루에 두 번 (입찰)을 관리 할 수 있습니다. 이러한 부동, 공급 불능, hutched 자세, 주름 장식 모피와 얼굴을 찡 그리기와 같은 고통의 일반적인 징후에 대한 48 시간 수술 후 기간 동안 밀접하게 동물을 모니터링합니다. 상처 빨갛게 조건, 부종, 열개, 감염을 모니터링합니다.
노트:추가 치료는 의사의 권고에 참석에 따라 규정 될 수있다. - 수의사의 권고에 참석에 따른 봉합이나 상처 클립을 제거합니다.
- 48 시간 수술 후 기간 동안 프레 노르 핀 (0.03 ㎎ / ㎏) 하루에 두 번 (입찰)을 관리 할 수 있습니다. 이러한 부동, 공급 불능, hutched 자세, 주름 장식 모피와 얼굴을 찡 그리기와 같은 고통의 일반적인 징후에 대한 48 시간 수술 후 기간 동안 밀접하게 동물을 모니터링합니다. 상처 빨갛게 조건, 부종, 열개, 감염을 모니터링합니다.
- 안락사
- 2 주 수술 후, (22)를 분석하여 사후 히스-형태에 대한 경동맥 동맥을 분리하기 위해 쥐를 안락사. 5-20%의 이소 플루 란은 호흡의 완전한 중단까지 최소 2 분 동안 공기를 포화 포함하는 챔버에서 쥐를 놓습니다. 이전 기관 및 조직의 해부에 죽음을 확인합니다.
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Representative Results
2 주 풍선 손상 후, 래트를 안락사되고 경동맥은 히스 - 형태 학적 분석을 위해 분리된다. 모두 왼쪽 경동맥 및 취소 운영 오른쪽 동맥 처리, 단면 크로스, 파라핀 내장되어 운영했다. 파라핀 샘플은 더 얇은 단면 및 헤 마톡 실린 - 에오신 (H & E) 염색을합니다. 히스 - 형태소 분석은 디지털 이미지 분석 시스템을 이용하여 수행된다. 동맥 수확 히스 - 형태소 분석의 상세 (13, 23)를 설명 하였다. 도 1b에 도시 된 바와 같이 풍선 방치 (또는 위약 식염수 처리) 경우 내막 성장 또는 용기 벽의 비후를 부상 - 유도 동일한 래트에서 작동되지 않은 용기 부 (도에 비해 분명 1A). 블록 내막 성장 signif 보여 주었다 (이 경우 sRAGE) 래트에서 수신 치료 시약 용기 부icantly 혈관 벽 (그림 1C)의 비후를 감소시켰다. 벌룬 손상의 효과뿐만 아니라, 치료 적 처치는 히스 - 형태소 해석의 결과와 잘 협력 초음파 초음파 (22) (도 2)를 이용하여 생체 내에서 평가할 수있다. 유효성 평가 및 래트 벌룬 손상 모델에서 치료 sRAGE의 관리 화면에 대한 정보는 이전 13,22 공보에 기재되어있다. 줄이거 나 부상 유도 혈관벽 리모델링 블록 치료 시약 쥐 그룹을 평가하기 위해 (N = 8-15) 통계적으로 의미있는 결론을 얻기 위해 동작 할 수있다.
그림 1 :. caroti의 쥐의 경동맥 풍선 손상 모델에서 대표 결과 H & E 염색D 동맥 단면적 (A) 비 작동 오른쪽 경동맥 부; (B) 풍선 부상과 위약 치료 왼쪽 경동맥 부 (화살표는 neotimal 영역을 표시) (C) 풍선 부상과 왼쪽 경동맥 섹션을 sRAGE 처리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 이주 후 부상 (에 직경 (B) 혈관 벽 두께 루멘 (A)에서 데이터의 산점도에 도시 초음파 초음파 검사 및 조직 검사의 상관 관계 sRAGE (0.5 NG / g) 처리 경동맥 혈관 더 - 비 운영 , sRAGE로 부상하고 위약 처리, n은 각 그룹의 12). (C) 대표 sonographiC 및 조직 학적 (100X) 이미지. (발행인의 허가 기준 22도). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
경동맥 동맥 내강의 벽화 내피 세포를 제거하는 부상을 생성하기 위해 풍선을 팽창하는 데 사용되는 두 가지 방법이 있었다. 하나는 액체 (20)에 부착 된 주사기를 채우기 위하여, 그리고 다른 하나는 공기 압력 (21)을 사용하는 것이다. 우리는 정확한 액량 (0.02 mL)을 각각의 방법에 사용되기 때문에, 액체로 채워진 주사기를 사용하는 것을 선호한다. 이 절차를 진행 각 동물의 부상 비슷한 수준에 이르는, 풍선의 정확하고 재현성 인플레이션을 렌더링합니다. 주사기에 액체를 사용하는 것은 실제로 액체 내의 기포의 제거를 필요로한다. 이는 카테터의 개구로부터 기포 압출에 의해 달성 될 수있다. 기포의 대부분을 제거한 후, 잔류, 작은 기포 1-2 시간에 방출된다. 우리는 연구자들이 1-2 시간 이전 절차에 미리 수술 재료를 준비 할 것을 제안하고, 아프로을 보장하기 위해 각각의 수술 전에 풍선 팽창의 정도를 확인절한 인플레이션.
수술의 경우, 외과 의사와 그 / 그녀의 조수 (들) 감염에서 모두 동물과 연구자를 보호하기 위해 얼굴 마스크, 멸균 장갑, 수술 가운을 포함한 모든 필요한 보호 기어를 착용해야합니다. (예를 들어 380-450 사이)이 절차에 사용되는 표준 층 포가티 풍선 색전 제거술 카테터의 도입을위한 경동맥의 적절한 크기를 확인하기 위해 유사한 bodyweights와 완전히 성장, 남성 쥐를 사용하는 것이 중요합니다. 수술하기 전에, 수술 전 마취 커버의 충분한 양을 확보하는 기화기에 이소 플루 란의 레벨을 확인하고, 필요한 경우 각각의 수술이 시작되기 전에 증발기 리필. 수술하기에 충분한 산소를 확보하기 위해 산소 탱크의 압력 게이지를 확인한다. 마취의 적절한 깊이에 도달 보장하기 위해, 하나는 또한 쥐의 호흡 속도를 모니터링 할 수 있습니다. 정상 쥐 ~ 85 호흡 / 분의 호흡 속도를 가지고; 호흡의 깊이와 다시 증가무조건 분기 리듬, 호흡 속도의 감소는 수술 마취을 의미한다.
수술 중에 마취는 지속적으로 모니터링해야하며, 호흡 페달 반사 및 수술 자극에 대한 동물의 반응을 확인하여 유지 하였다. 그 / 그녀의 손은 잠재적 인 오염 및 감염을 방지하기 위해 페달 반사 검사로 수술하는 동안 동물의 비 멸균 부분을 만지면 참고로, 의사는 장갑을 변경해야합니다. 또한, 외과 의사와 조수는 신중하게 마취제 과다 복용을 방지하고는 이소 플루 란을 해제하여 발생하면 상황을 피하기 위해 빠른 조치를 취할와 100 % 산소 수준을 높이기 위해 작업 중에 동물의 생체 신호를 모니터링해야합니다. 마취제 과다 복용의 증상은 느리고 얕은 호흡, 약한 불규칙 펄스를 포함한다. 우리는 또한 경동맥 (a)의 완전한 분리를 포함하여 풍선 부상 전에 arteriotomy의 좋은 준비를 제안자신의 인접 조직에서 rtery 섹션. 이 작업 중에 예기치 않은 출혈을 방지하는 데 도움이 될 것입니다.
포스트 수술 복구 단계를 포함하여 마취하에 동물은, 방치해서는 안됩니다. 48 시간 후 수술 기간 동안 정기적으로 부 프레 노르 핀 (0.03 ㎎ / ㎏ 입찰가)에 대한 대안으로, 서방 부 프레 노르 핀 (프레 노르 핀 SR)도 사용될 수있다. 즉시 수술 후 부 프레 노르 핀의 SR (1.0-1.2 ㎎ / ㎏)의 주입은 72 시간까지 수술 후 기간을 다룰 것입니다. 일반적으로 수술 후 합병증은 예상되지 않는다; 하지만주의 권고의 연습은 동물의 복지를 보장하고 기관 ACUC에 의해 정책입니다.
이 동물 (8-15), 적절한 수술 기술과 절차에 익숙 연구 그룹의 풍선 부상의 동일한 수준을 재현하는 것이 가장 중요하기 때문에 매우 좋습니다. 이 절차에 대한 새로운 연구를 위해, 우리는 제안arteriotomy의 제조, 벌룬 손상 및 기관 동물 시설에서 사용할 수있다 쥐 사체의 상처 봉합을 포함하는 전체 과정을 실시 할 제. 절차에 대해 잘 알고 수의사 또는 연구원으로 수술 연습도 재현하고 일관된 풍선 부상 결과를 얻을 보장합니다.
우리의 관점, 약물 및 / 또는 내막 성장을 부정 치료제 최고급 초기 염증을 상쇄하기 위해 벌룬 손상 직후에 투여된다. 일부 시약의 효과를 달성하기 위해 회수의 연속 일 동안 지속적으로 투여 될 필요가있다. 초기 개입을 차단하거나 계속되는 혈관 리모델링 13,22,24를 줄일 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 F Fogarty balloon embolectomy catheter | Edwards Lifesciences | ||
| Standard scalpel | Fine Science Tools | ||
| Small curved forceps (Large radius Dumont#7shanks curved) | Fine Science Tools | ||
| Large, medium and small micro-scissors | Roboz | ||
| Needles (20 G) | TycoHealthcare | ||
| Micro-surgery forceps with micro-blunted atraumatic tips | Fine Science Tools | ||
| Atraumatic straight small arterial clamps | Fine Science Tools | ||
| Retractor with maximum spread 5.5 cm long blunt teeth | Fine Science Tools | ||
| Silk suture (4.0 and 6.0 ) | Fine Science Tools | ||
| Syringe (1.0 ml) | BD | ||
| Curity gauze sponges | AllegroMedical | ||
| Cotton tip applicators sterile and non-sterile | Puritan Medical Products | ||
| Compact hot bead sterilizer | Fine Science Tools | ||
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | ||
| ADS200 anesthesia system/ventilator | Paragon Medical | ||
| Isoflurane (forane), liquid form | Baxter | ||
| Sodium chloride 0.9% (Saline) | Hospira | ||
| Buprenex (buprenorphine) | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd. | ||
| 70% alcohol | Fisher | ||
| 1:10 Betadine | Fisher |
References
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