Summary
Örneğin, kemirgen ABC transportörlerin Bcrp1 (Abcg2) ile, in-siliko protokolleri fare dokularda eksprese edilen genlerin alternatif promoter kullanımı tespit etmek için, ve raportör tahlilleri kullanılarak belirlenen alternatif promoterlerin özelliğe değerlendirmek için sunulmaktadır.
Abstract
Genellikle çevrilmemiş - - birinci ekson, farklı dokularda gen ekspresyon genellikle özgü mRNA'nın sentezinde neden alternatif promotörler tarafından kontrol edilir. E1U, E1A, E1B ve E1C: Bcrp1 (Abcg2), ABC taşıyıcı Meme Kanseri direnç proteini (BCRP, ABCG2) murin ortolog üretilen karşılık gelen dört alternatif ilk ekson tarafından belirlenmiş olan en az dört alternatif promotörler vardır. Burada, içi siliko protokolleri Bcrp1 alternatif promoter kullanımı tahmin etmek için sunulmuştur. Ayrıca, haberci deneyi yöntemleri alternatif promotörleri için haberci yapıları üretmek ve yukan tanımlanan alternatif ilk eksondan putatif promoterlerin özelliğe belirlemek için tarif edilmiştir.
Introduction
Daha insan genlerinin yarısı alternatif rehberleri 1 düzenlenir. Her alternatif promotör alternatif rehberleri bu farklı olabilir düzenleyici unsurları içerebilir. bir doku kullanılan hızlandırıcı (lar) başka bir doku kullanılanlardan farklı olabilir. Örneğin, belirli bir sinyal yolunun aktivasyonu bir dokuda kullanılan bir genin alternatif promoter tetikler, ancak hiçbir etkisi yoktur veya başka bir dokuya kullanılan aynı geni için, ayrı bir alternatif promoter bastırmak mümkündür.
Bcrp1 geninin ekspresyonu, alternatif promotörler tarafından yönetilir. Bcrp1 insan göğüs kanseri direnç proteini (BCRP) genin fare ortolog olan. BCRP ATP-bağlayıcı kaset (ABC), taşıyıcı, resmi olarak belirlenen ABCG2 2, 3. bir tepe plazma zar proteini olarak, BCRP / Bcrp1 fonksiyonları doğal ve ksenobiyotik alt tabakalar çeşitli akıttığı
Normal ve neoplastik hücrelerde BCRP ekspresyonunun düzenlenmesi anlamak için ilk çalışmada, cDNA uçlarının (5'-RACE) BCRP mRNA analizi 5 'hızlı amplifikasyonu onun tam transkripsiyon başlangıç bölgesinin 13 belirlemek için yapıldı. Sadece bulundu birden transkripsiyon başlangıç siteleri vardı; Ayrıca BCRP de çevrilmemiş ilk ekson, üç alternatif formları vardı karşılaştı. Bu alternatif, ilk ekson - E1 belirlenen, E1B, E1C - insan dokularının çeşitli farklı ifade edildi. İki ek birinci ekson varyantları BCRP 13 ikinci ekson kullanılarak insan EST veritabanının bir BLAST arama keşfedildi. Dört maç yukarı E1u belirlenmiştir ekson 2 birinci ekson> 70 kb ortaya; diğer dört maç E1- 13 belirlenmiştir tamamen ilk ekson yoksun BCRP mRNA, ortaya çıkardı. Alternatif lider ekzon varlığı alternatif promotör kullanımı 14 bir tezahürü olarak kabul edilir.
Farelerde, Bcrp1 dört alternatif ilk ekson farklı fare dokularda BCRP 1 transkripsiyonu yöneten alternatif rehberleri karşılık gelebilir o tarif edilmektedir; Bu ekzon / promoterler E1U, E1A, E1B ve E1C belirlenir ve yaklaşık olarak konumlanmış 70, Bcrp1 ekson 2 5, 15 ile üst baş 58, 15 ve 5 kb. E1A mRNA izoform murin baskın olduğu bulunmuşturE hematopoietik kök hücreler, kalp, akciğer, dalak ve beyin, E1B izoformu kemik iliği 5, 15 fare bağırsak, cenin karaciğer hücreleri ve eritrosit öncü hücrelerin ifade görülebilecektir. yukan E1B hızlandırıcıdır fosfo-siklik-AMP yanıt elemanı bağlayıcı protein (p-CREB) ve alternatif özgü bir CREB tepki elemanı, en azından kısmen regüle fare bağırsak Bcrp1 transkripsiyonu düzenleyen önemli bir alternatif promoter olduğu gösterilmiştir Bcrp1 destekleyicisi 16. E1C mRNA isoformudur Yetişkin fare karaciğer ve böbrek 5 olarak ifade edilir. E1U izoformu da 5 ifade baskın izoformdur murin testis haricinde test edilen pek çok dokuda tespit edilemez. Bcrp1 (geç evre spermatid 4 koruyabilir seminifer endotel olarak) hem somatik (endotel sıkı kavşaklar, peritübüler Miyoid hücreleri ve Sertoli hücrelerinde) ve germ hücreleri bulunan sıçan testis olarak ifade edilmiştir. regyukan E1U iyon steroidojenik faktörü-1 (SF-1) 5 için işlevsel bir tepki elemanı içerir. Bcrp1 mRNA ve protein belirgin sıçangil Sertoli hücrelerinde Bcrp1 sentezleme SF-1 5 tarafından kontrol edildiğini düşündüren, Sertoli hücreye spesifik SF-1 nakavt fareler testislerde azaltılır.
Detay yöntemleri sunulan protokoller de-silisyum Bcrp1 alternatif ilk ekson tespit etmek ve yukarı tespit alternatif ilk ekzon gelen varsayılan proje sahipleri için lusiferaz tabanlı muhabiri deneyleri kurmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fare EST Veritabanı ŞOK Analizi Bcrp1 Alternatif İlk ekson Silico Tahmin 1.
Not: Bu protokol tespit etmek genomik dizilere uygun EST dizileri hizalamak nasıl sonra fare ifade dizi etiketi (EST) (içeren öteleme başlangıç yeri) Bcrp1 2. ekson dizisi benzerliği ile EST veritabanı arama ve açıklamaktadır onların Bcrp1 ekson 2'nin 5 'ucuna, fare Bcrp1 geninin konumu.
- , Ensemble'da Genom Tarayıcı 17 arama penceresine mRNA referans dizisi kimliği (NM_011920.3) girerek fare Bcrp1 ekson 2 dizisini elde tıklayın "GO". Sonraki ekranda, bir tam boy dizisini (16 ekzon içerir) seçin:
- Bir sonraki ekranda ( "Transkript tabanlı Display") olarak, "16 ekzon" i seçin. Bu Bcrp1 tüm ekson dizisi içeren bir ekran belirir. Bcrp1 ekson 2 5 "okuyacak9; -AAAGGC ... TATCAA-3 ' "referans 18'de gösterilenlere benzer olacaktır elde edilen sonuçlar..
- "İndirme dizisi" seçeneğine tıklayın. Sonraki ekranda, FASTA biçimi seçin ve ardından tıklayın "Önizleme". Sonraki ekranda, panoya ekson 2 Önizleme dizisi kopyalayın.
- Biyoteknoloji Bilgi (NCBI) web sitesi 20 Ulusal Merkezi üzerinde ŞOK ana 19 gidin.
- "Fare" genom seçin. sorgu kutusuna panodan ekson 2 dizisini yapıştırın.
- Veritabanı açılır menüsünden "EST'ler" seçiniz için optimize "son derece benzer dizilerin," ve sonra seçin "BLAST." Çalışma süresi birkaç dakika sürer. ŞOK çalışma tamamlandığında, "Sonuçlar" sayfası görünür.
- "Sonuçlar" sayfasının "Açıklamaları" alt başlığı altında (tam "ALL" sonra "İndir" daha sonra "FASTA seçin"Açılır ve sonra seçin" dizisi) Devam "Bir .txt dosyası belirir;., Açık ve panoya tüm dosyayı kopyalamak .txt dosya fare Bcrp1 exon2 yüksek sekans benzerliği ile tüm EST dizileri içerir. ancak ilgili konumları Bcrp1 geninde 2 ekson.
Not: 15 Nisan 2015 tarihinde yapılan bir analiz Bcrp1 ekson 2 ile aynı hizada Bunlar Tablo 1'de verilmiştir 14 kemirgen EST'ler belirledi.
- Bcrp1 geninde 2 ekson 5 'olan EST dizisinin konumunu belirlemek. fare Bcrp1 gen kromozom 6 contiglere NC_000072.6 (: 372099104 GI) yer almaktadır.
- "İhtisas Blast" alt başlığı altında ŞOK ana sayfasında, seçme "BLAST (bl2seq) kullanılarak iki (veya daha fazla) dizileri aynı hizaya getirin."
- sorgu kutusuna panodan metin dosyasını yapıştırın ve konu dizisi kutusuna 372099104 girin. Program kapsamında "son derece benzer dizilerin" için optimizeseçimi ve koşmak ŞOK.
- Sonuçlar penceresi göründüğünde, grafiksel "Hizalamalar" penceresinde "Graphics" üzerine tıklayarak saflaşma görüntüleyin. Sağ ve sol okları kullanın ve Bcrp1 / Abcg2 ve dizi hizalamaları odaklanmak zoom.
- dizi hizalamalarını kaydet: "Açıklamaları" kutusuna "ALL" seçeneğini, ardından "indir" açılır altında ", tablo (CSV) Hit" seçin ve sonra tıklayın "devam ediyor." Bu dosya Bcrp1 ekson 2'nin dizi sıralaması ve fare kromozom 6 kontigin nükleotidlerin numaralandırılması göre Bcrp1 Exon2 sekans benzerliği Tüm EST sekanslarının dizilimini içerir. Her bir tam EST sekansı Bcrp1 ekson 2 Çakışan diziler de dahil olmak üzere 2 Ekson bölge 5 've 3' kapsayan Çoklu hizalamalar oluşturabilir.
- ekson 2'nin 5 'ucunun pozisyonu kromozom 6 kontig'deki 58,655,638 nükleotit karşılık gibi, bu tayin+ 1, ve daha sonra 58,655,638 her EST 5 'kısmi dizilerin konumunu hesaplar. 14 EST'ler için sonuçlar Tablo 1 'de verilmiştir.
Not: 5 'potansiyel ilk ekzon olarak (yani, var negatif nükleotid değeri) +1 olan EST dizileri analiz için dikkatli olun. Örneğin, Tablo 1 (AI647825 ve AI664571) 'de gösterildiği Bcrp1 ekson 2 ile uyumlu EST'lerin iki kalan sekansı 3 2 Ekson' idi.
2. Değerlendirme Bcrp1 Alternatif promotör fonksiyonu
- Muhabir Tasarım Bcrp1 E1U, E1, E1B ve E1C rehberleri için yapıları
- EST veritabanı arama elde edilen E1U dizisi kullanarak, +1 olarak E1U ilk 5 'nükleotid belirler.
- bakteriyel yapay kromozom (BAC) yukarı Bcrp1 / Abcg2 konusu gen dizisi ve dizi en az 100 kb içeren fare kromozom 6 klonu eldeBcrp1 / Abcg2 geni (Malzeme ve Ekipman Listesi bakınız).
- Bu lusiferaz haberci plazmid pGL3-Basic gibi uygun bir raportör vektör belirlemek.
- raportör vektör içinde çoklu klonlama sitesi belirler. Kpnl, Sacl, Mlu1, Nhel, Smal, Xhol, BglII ve HindIII yönlendirme 'ila 3' 5 pGL3-Basic vektörüne çok sayıda klonlama bölgesi sınırlandırma endonükleaz bölgeleri vardır.
Not: Sindirim sitelerinin dizisi sınırlama enzimleri üreten şirketlerin ürün katalogları edinilebilir. - E1U ekson tüm sindirim siteleri ve E1U gibi DNA5 gibi yazılım programları kullanarak '2 kb bölgesini 5 tanımlayın. E1U veya 2 kb üst bölgesi bulunmayan pGL3-Basic çoklu klonlama bölgesinin en az iki sindirim belgelerin belirlenmesi.
Not: sağlamak için ters primer için seçilen biri yukarı ileriye astar için bir çoklu klonlama sitesi kısıtlama alanı seçtiğinizden emin olun o insert will doğru konumda.
- ileri hazırlayın ve ticari gen / primer sentezi hizmetlerini veya astar seçim yazılımı (Malzeme ve Ekipman Listesi bakınız) kullanılarak seçilir pGL3-bazik çoklu klonlama sitesi restriksiyon endonükleaz siteleri için dizileri ihtiva PCR için primerler ters. E1U sekansı ve E1U dizisi içinde bir ters primer ~ 2 kb yukanya doğru yer alan bir ön primeri seçin. Yazarların kullanılan primerler 'önceki çalışmalarında ileri astar Sacl sitesi ve ters primer bir Nhel sitesi dahil, ve ilk 5 ile +64 yaklaşık -1906 genomik bölgeyi amplifiye' olarak belirtilen E1U ve nükleotid + 1. (yukarıdaki adım 2.1.1) ve referans 16 de verilmiştir.
- PCR 0.01 BAC ug ile 1, bu primerler kullanılarak E1U genomik bölgeyi yükseltmek ve PCR master karışımı da denatüre ile yüksek sadakat Taq polimerazları (Malzeme ve Ekipman Listesi bakınız) içeren30 72 ° C (2 dakika) uzatma sn, PCR daha sonra 35 ila 40 döngü, ve tavlama ve kullanılan primerler erime özelliklerine göre erime sıcaklıkları 95 ° C'dir.
Not: yüksek kalitede Taq polimeraz kullanımı yüksek GC içeriğine sahiptir dizi yükseltici bölgeleri için önemlidir. Bu şablon olarak BAC gibi büyük genomik DNA fragmanlarının kullanıldığında, genomik DNA ikincil yapı zor PCR primerleri bağlamak için yapabilir. Bu sorun ortaya çıkarsa, uzun genomik DNA numunesi, PCR reaksiyonundan önce sonikasyon ile hafifçe kesilmiş ise, daha iyi bir PCR sonuçları elde edilebilir. - % 0.8 TAE agaroz jel elektroforez ile 1 kb DNA merdiveni karşılaştırılarak büyütülmüş PCR ürününün uzunluğunu kontrol edin.
- PCR 0.01 BAC ug ile 1, bu primerler kullanılarak E1U genomik bölgeyi yükseltmek ve PCR master karışımı da denatüre ile yüksek sadakat Taq polimerazları (Malzeme ve Ekipman Listesi bakınız) içeren30 72 ° C (2 dakika) uzatma sn, PCR daha sonra 35 ila 40 döngü, ve tavlama ve kullanılan primerler erime özelliklerine göre erime sıcaklıkları 95 ° C'dir.
- Elde edilen PCR ürünü ve pGL3-Basic vektör Digest, kısıtlama kullanarak ileri sokulan sınırlandırma sindirim siteleri için özel endonükleaz ve ins göre ters primerlerisınırlandırma sindirim enzimleri ile birlikte talimatların.
- Kit protokolü 21 aşağıdaki ticari SV Jel ve PCR Temizlik-Up Sistemleri kiti (Malzeme ve Ekipman Listesi bölümüne bakınız) kullanarak sindirim reaksiyonlarını arındırın.
- Agaroz jel elektroforezi kullanılarak kesilmemiş vektör mukayese edilmesi yolu ile vektörünün sindirilmesi ve lineer doğrulama sonra kesme ve sindirilmiş vektör DNA şeridi saflaştırılması. saflaştırılmış PCR ürününün konsantrasyonu ve UV spektrometre (Malzeme ve Ekipman Listesi bakınız) kullanılarak saflaştırılmış vektör ölçün.
- Kit protokolü 21 aşağıdaki ticari SV Jel ve PCR Temizlik-Up Sistemleri kiti (Malzeme ve Ekipman Listesi bölümüne bakınız) kullanarak sindirim reaksiyonlarını arındırın.
- Arıtılmış bağlanarak E1U raportör yapıyı hazırlamak, sınır enzimi ile sindirilmiş PCR ürünü ve pGL3-Basic ateşböceği lusiferaz raportör vektörü (haberci deneyi kiti içerisinde bulunan; Malzeme Listesi ve Ekipman bakınız) insert at: 11, 21 ve 31 vektör oranları, böylece E1U r üreten, kit talimatlarına 22 uyarınca "T4 DNA ligaz hızlı bağlama kiti" kullanılarakpGL3-E1U adlandırılan eporter yapısı.
- klonal TA klonlama kitinde pGL3-E1U aşağıdaki yönergeleri genişletmek için bakteri dönüştürmek için pGL3-E1U plazmid kullanın (Malzeme ve Ekipman Listesi bakınız).
- dizi analizi ile ekin yönünü ve sadakat onaylayın.
- Hazırlayın muhabir E1U için benzer bir metodoloji kullanılarak E1, E1B ve E1C için oluşturur. Bölüm 2.1.5.2 olarak dizileme ile ekler doğruluğunu teyit edin.
Not: E1, E1B ve E1C için yükseltici ekler olmalıdır yaklaşık -1875 / + 10, -1847 / + 60 ve E1A, E1B ve (+1 olarak adlandırılır) ilk 5 'nükleotid için -1904 / + 83 akraba, sırasıyla, ya E1C.
- Haberci deneyi yöntemleri
Not: raportör testleri genel bir strateji: bir genin varsayımsal promotörü (5 'yukarı akış bölge), bir "önce bildirilmiştir içeren boş bir" raportör "vektörünün çok sayıda klonlama yerine yerleştirildiğindeçoklu klonlama bölgesinin aşağı akış r geni "(örneğin, ateşböceği lusiferaz). vektör daha sonra ilgili geni eksprese ökaryotik hücrelere transfekte edilir. aktif hale getirin, bu hücrelerde ilgi konusu genin ekspresyonu teşvik trans-etkiyen faktörler transfekte raportör vektör içinde promoter, kolayca ışık yayılması deneyi ile belirlenebilir ateşböceği lusiferaz ekspresyonunu neden olur.- muhabir tahlil için kullanılacak uygun hücre satırı seçin.
Not: E1U alternatif promoter raportör yapısının aktivitesinin değerlendirilmesi için, E1U promoterinin kontrolü altında Bcrp1 ifade yapısının hücreler içine transfekte etmek gereklidir. TM4 fare sertoli hücre hattı (Malzeme Listesi ve Ekipman bakınız) Bcrp1 proteini ifade ve Bcrp1 mRNA E1U yanı sıra E1, E1B ve E1C 5 içeren. Bir negatif kontrol olarak, Bcrp1 proteini veya mRNA ifade etmeyen bir hücre çizgisi kullanılarak düşünün. - TM4 ce Kültür200,000 hücrelik bir başlangıç yoğunluğunda / oyuk bir 1, 24 oyuklu plakalarda LLS: Ham F12 ortamı 1.2 g / L sodyum bikarbonat ile Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı 1 karışımı, 15 mM Hepes,% 5 at serumu ile takviye edilmiş,% 2.5 Daha önce tarif edildiği gibi 5, 37 ° C,% 5 CO2 de cenin sığır serumu, penisilin (100 lU / ml) ve streptomisin (100 ug / ml),.
- Altı saat kültürde hücrelerin yerleştirdikten sonra, boş bir pGL3-bazik vektörünün 0.2 ug veya -1906 / + 64 E1U ya -1875 / + 10 E1A ve -1847 / + 60 E1B ihtiva eden pGL3 vektörü 0.2 ug hücreleri transfekte ya da -1904 / + 83 E1C BCRP 1 silme ticari DNA transfeksiyon kiti ve üreticinin protokolü 23 kullanılarak, iç kontrol olarak pRL-TK (a Renilla lusiferaz ifade vektör) 4 ng ile birlikte inşa (Malzeme ve Ekipman Listesi bakınız) .
- 30 saat aşağıdaki transfeksiyon, Kültür gelen büyüme ortamı çıkarınEd hücreleri transfekte edildi. 200 ul PBS ile bir kez hücreler yıkanır, daha sonra yıkama çözeltisi çıkarın.
- Ateşböceği ölçün ve Renilla lusiferaz aktivitesi, üreticinin protokollerine 24'e ait bir ticari kit kullanılarak.
- İç (Renilla lusiferaz) kontrol bölünmesiyle ateşböceği lusiferaz aktivitesi oranı olarak her bir tüp için aktivitesinin; Her raportörünün aktivitesi, 1 değeri verilir boş pGL3 basit vektör ile transfekte edilmiş olan hücrelerin edilene göre inşa Genel olarak sonuçları genellikle ifade edilmiştir.
- muhabir tahlil için kullanılacak uygun hücre satırı seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lider ekson analizi ile fare testisi içinde BCRP 1 alternatif promotör kullanımının tanımlanması
NCBI EST veritabanı Protokol 1 'de açıklanan aşamalara göre (2015 Nisan) problanmıştır zaman, EST Genomik konumlan ile birlikte, 1 mRNA Tablo 1' de gösterilmiştir BCRP ekzon 2 5 'ucunda bitişik olduğu bulundu ekson E1U (Tablo 1) karşılık gelen mRNA ekson 2 70 kb üst kısmında genomik DNA dizisine sahiptir BCRP 1 2 ekson bitişik olan C57BL / 6J fare testis türetilen 2. Tek EST başlangıcına DNA göre. Benzer şekilde, E1A, E1B ve E1C tekabül eden EST tespit edildi. Dikkat çekici bir şekilde E1C tekabül eden iki EST aynı zamanda E1C 5 'ucuna eklenmiş E1B ihtiva olmasıdır. Bu tahmin, ilk ekson konumufare kromozom 6 Bcrp1 ekson 2 ile ilişkili, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
BCRP 1 Alternatif hızlandırıcı fonksiyonunun değerlendirilmesi
E1U, E1A tekabül eden tipik lusiferaz deney sonuçları, TM4 murin sertoli hücreleri (bölüm 2.2) içine transfekte E1B ve E1C promoteri-lusiferaz raportör yapılan ile Şekil 2A'da gösterilmiştir.
Önceki çalışmada, SF-1 yanıt elemanı E1U promoteri 5. olduğu tahmin edilmiştir. Bu farazi SF-1 yanıt elementi fare testis Bcrp1 transkripsiyonunun düzenlenmesi söz konusu ise, E1U yükseltici raportör yapısının bu yanıt elementi (önceki bir kağıt 5'te tarif edildiği gibi), daha sonra mutasyonun, bu yapıda üretilen lusiferaz aktivitesini azaltacak transfekte edildiklerindeTM4 hücreleri. Tipik bir deneyin sonuçları Şekil 2B'de de gösterilmiştir. Mutasyon geçirmiş konstrukt de (bir önceki çalışmada 5'te tarif) SF-1 zorla ifade eden hücrelerde boş pGL3-bazik vektörünün edilene karşılaştırılabilir bir etkinliği olan, un mutasyonlu yapısı daha düşük lusiferaz aktivitesi gösterir. SF-1 zorla ifade mutasyona uğramış biri o un-mutasyona uğramış yapının aktivitesini artırır, ancak.
Şekil 1. Fare kromozomu 6. Bu hizalamaların Nisan ayında gerçekleştirilen dbEST BLAST arama saptanmıştır ile Bcrp1 ekson 2 sekans kimliği ile EST genomik uyum diyagramı, 2015 dört farklı hizalamalar, alternatif ilk ekson E1U, E1 Bcrp1 karşılık, bulundu E1B ve E1C. Bu rakam bir önceki yayın 5'ten yeniden üretilir. 
Şekil 2. BALB / c sertoli hücresinden türetilmiş TM4 hücrelerinde (A) Raportör Bcrp1 promotörler için deney E1U, E1A, E1B ve E1C. Veriler, farklı günlerde yapılan ortalama ve üç farklı deneyin standart sapma, bölümünde gösterilen 2. veri açıklanan yöntemler kullanılarak, Renilla lusiferaz edilene normalize ateşböceği lusiferaz lüminesans olarak ifade edilmiştir. Yıldız işareti t-testi (P <0.01) ile boş bir pGL3 vektörü kontrolünden anlamlı bir farkı belirtir. Bu şekil, bir önceki yayın 5'ten yeniden üretilir. Bcrp1 E1U yeniden SF-1 yanıt elementi olan mutasyon (B) Effectsporter lusiferaz aktivitesi üzerindeki yaparız. Bcrp1 raportör edil (me-mutasyona uğramış mutasyona uğramış ya da) ile TM4 hücrelerine transfekte edilmiştir, farazi SF-1 bağlama bölgesi ile inşa (SF-1 transfekte edilmiş) ve (transfekte edilmiş vektör) gösterilmiştir SF-1.The veri uygulanan ekspresyon olmayan ortalamasıdır 3 farklı deneyler, farklı günlerde yapılan; Hata çubukları standart sapmaları temsil etmektedir. Her deney için, tek tek deneyler iki tekrar halinde yapıldı. T-testi kullanılarak E1U geliştirici yapısıyla karşılaştırıldığında istatistiksel olarak önemli fark (B) anlamına gelir (p <; şekilde, (A), (p <0.05) t-testi kullanılarak, boş vektörü pGL3 kontrolü arasında önemli bir fark gösterir 0.05). Bu rakam bir önceki yayın 5'ten çoğaltılamaz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1. Bcrp1 25 -28 ikinci ekson dizisi karşı fare EST veritabanının Blast arama. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sunulan yöntem ve Örnek sonuçların çoğu, 2013 5 yayımlanan "fare testis B crp1 transkripsiyon yukan steroidojenik faktör-1 ile düzenlenir, yeni bir birinci ekson (E1U) 'in bir promoter tarafından kontrol edilir" başlıklı daha önceki çalışmaları tarif edilmektedir . burada gösterilen Örnek sonuçlarına ek olarak, önceki kağıt 5'-RACE PCR ve RT-PCR yöntemi kullanılarak, alternatif birinci ekson kullanımı tahmin sağladı. Bundan başka, in siliko yukan E1U gelen promotör bir varsayımsal SF-1 yanıt elementi tanımlanması gerçekleştirilir ve kromatin immünopresipitasyon (chip) tahlilleri SF-1 varsayılan SF-1 tepki elemanına bağlı olduğu gösterilmiştir. Fonksiyonel çalışmalar kemirgen sertoli hücreleri, BCRP 1 transkripsiyon E1U promotör SF-1 yanıt elementi ile SF-1 tarafından kontrol edildiğini göstermiştir. Bu fonksiyonel çalışmalar tra tarafından TM4 hücrelerinde SF-1 regülasyonunu dahilnsfection ya BCRP 1 E1U mRNA ekspresyonlanmasında sonuçlanan bir histon deasetilaz inhibitörü (vorinostat), ve bir raportör tahlilinde BCRP 1 E1U promoterinin bir BCRP 1 protein artışının yanı sıra etkinlik kullanımı ile. Son olarak, bu çalışmalar yetişkin Sertoli-hücre spesifik SF-1 knockout farelerde gelen testislerde, BCRP 1 E1U mRNA ifadeleri, toplam BCRP 1 mRNA ve Bcrp1 proteini belirgin 5 azaldığını kanıtlar sağladı. Aynı çalışma aynı zamanda böbrek, karaciğer, testis, beyin, kalp, akciğer, kas, dalak 5 de dahil olmak üzere, murin dokularda çeşitli Bcrp1 mRNA izoformları salgılanma modellerini bildirmiştir.
Bir model olarak BCRP 1 dokuya özel düzenleme ile - - Burada tarif edilen protokoller ayırıcı belirlemek için herhangi bir genin transkripsiyonel karmaşıklığını aydınlatmak için, basit bir deney çerçeve sağlamakçeşitli dokular ya da hücre tiplerinde ifadesi. In-siliko değerlendirmeler için açıklanan protokol aşamalarından elde edilen sonuçlar zamana bağlı yazılım ve değişime tabi olabilir kullanılan veritabanları ev çeşitli web siteleri beri olabileceği vurgulanmalıdır. Burada sunulan in-silico metodolojisi EST veri kümesindeki tüm insan genlerinin yaklaşık% 18'i alternatif destekleyicileri istihdam tahmin daha önce 29 bildirildiği gibi EST veritabanı (dbEST), arama kullanmaktadır. Bir "oligo-kapaklama" yöntemini kullanarak birçok insan dokulardan elde edilen cDNA 1,8 milyon 5'-uç dizileri üretmek için - - diğer araştırmacılar, çünkü dbEST, alternatif ilk ekson hafife olabilir aranıyor insan genlerinin ve tahmin için olası transkripsiyon başlangıç siteleri belirlemek için başardık çalışılan insan RefSeq genlerin% 52 olasılıkla alternatif rehberleri 1 ile düzenlenmiştir. İlginçtir, ikincisi çalışma bulduğuEn edildi testis ve beyin varsayılan alternatif destekleyiciler kullanılan dokular; ayrıca, onlar iletim yollarının sinyal ile ilgili proteinleri kodlayan genler dokuya özgü alternatif promotörleri 1 istihdam daha muhtemel olduğu bulundu. bahsedilen sakıncaların rağmen, dbEST az çaba ile birçok dokuda, belirli bir genin 5 'UTR kullanımına kaba bir bakış sağlar analiz eder.
dbEST analiz alternatif birinci ekson kullanımı bir uyduruk bakış sağlasa da, biz son derece soruşturma altında bir doku ya da hücre hattında ilk ekson kullanımını doğrulamak için cDNA uçlarının (5'-RACE) analizi 5 'hızlı amplifikasyon yapmanızı tavsiye ederiz. Ticari kitleri (Malzeme ve Ekipman Listesi bakınız) üretici tarafından sağlanan ayrıntılı ve anlaşılır prosedürleri ile, 5'-RACE için kullanılabilir. biraz zaman tüketen rağmen, 5'-RACE çalışmaları fiili varlığının tahminleri yanı sıra alternatif birinci ex dizisi sağlamakÇevrede mRNA ons; Ayrıca, birden fazla transkripsiyon başlangıç sitelerinin varlığı, 13 algılanabilir. yeterli temsil sağlamak için, en az 15-25 klon dizi gereklidir. sekanslama önce, 5 'RACE ürünleri kirletici vektör sekanslarını çıkarmak için gereklidir. Bu yapılmadığı takdirde, ŞOK analizi fare genomu ile bir dizi hizalama algılamak için tamamen başarısız olabilir. İlk ekson kullanımı tespit edildiğinde, 5'-RACE bulgular alternatif ilk ekson için müteakip nicel RT-PCR tahlilleri doğrulamak için kullanılabilir. Genel olarak, yazarların daha önceki iş 5'RACE tarafından kurtarıldı ilk ekson mRNA klonların yüzdesi ve aynı doku ya da hücre hattı 5, belirli bir alternatif birinci ekson için kurtarıldı PCR ürününün yüzdesi arasında iyi bir korelasyon olduğu bulunmuştur. Ayrıca, iyi bir korelasyon alternatif Bcrp1 proje sahipleri için lusiferaz promotör yapılarının faaliyetleri arasında bulunan birND özel bir hücre hattına 5 karşılık gelen, alternatif, birinci ekson sentezlenmesi.
Bütün organlar kullanıldığında dokuya özgü alternatif promotör kullanımı için arayışı içinde, biri bulunursa alternatif destekleyiciler / ilk ekson böyle İçin vb glandüler elemanlar, kan damarları, stroma gibi organ doku heterojenitesini yansıtacak farkında olmalıdır Örnek, testis somatik (Leydig, sertoli, Miyoid ve endotelyal) hücreleri ve germinal (haploit) hücreleri, hem de damar bir karışımıdır. dokuya özel birinci ekson ifadesi için prob için, organ belirli dokular izole etmek için gerekli olacaktır.
Diğer yöntemler, alternatif promotör kullanımını ve düzenlenmesini belirlenmesi için rapor edilmiştir; Ancak, bu yeni nesil dizileme gerektiren ve biyoinformatik üretilen veri büyük miktarda analiz edebilen bilgisayar. Bu yöntemler, tüm transcriptosome sekanslama (RNA DİZ) ve yonga seq içerirBu tür promoterler 30 tercihen bağlanmaktadır H3K4me3 olarak histonlar. Bu yöntemler, odaklama bir kaç spesifik genlerin ve dokularda sentezlenmesi açık olduğunda, de novo gerçekleştirmek için pahalı olabilir, ancak mevcut verilerin maden daha pratik bir yaklaşım olabilir.
Burada sunulan hızlandırıcı aktivitesi tahmin etmek için deneyler, ateş böceği lusiferaz geninin yukarı tarafındaki çoklu bir klonlama bölgesini içeren pGL3-bazik vektör, kullanır. Promoter etkinliği ticari luminometresiyle (Malzeme ve Ekipman Listesi bakınız) lüminesans ölçümü ile, kofaktör ilavesi ve ışıldayan substrat sonra, kolayca ölçülür ateşböceği lusiferaz, üretimi ile ölçülür. Ilgili pGL4 vektörü kararlı biçimde transfekte edilmiş hücrelerin üretimini sağlayan seçilebilir belirteçleri (örneğin, neomisin, higromisin, puromisin) içeren yapılabilir. Bu yazıda verilen protokoller geçici transfeksiyon kullanmaktadır. Promot için Tipik haliyle, raportör tahlilleriER aktivitesi, hücre sayısındaki varyasyonları ve transfeksiyon etkinliği için kontrol etmek için kurucu Renilla (deniz menekşesi), lusiferaz (pRL-TK) eksprese eden bir vektör ile birlikte-transfeksiyonu ile yapılmıştır. Belirli bir geni için bir promotörün tahlili kurmakta kritik bir safha, ilgi konusu gen haberci yapısı ile transfekte edilir hücre hattı içinde olduğundan emin olmaktır. Alternatif hızlandırıcı kullanımı mevcut olduğu zaman, ikinci olarak, transfekte edilmiş hücre hattı içinde ilave bir alternatif, birinci ekson gelen yükseltici yapısı kullanmak önemlidir. Örneğin, sadece E1B promoterin kontrolü altında Bcrp1 ifade eden hücreler içine transfekte edilir E1U yükseltici yapısı için lüminesans görmek için beklemek gerekmez. Seçenek olarak ise, bir negatif kontrol olarak, muhabir transfeksiyon gen veya mRNA izoformu ateşböceği lusiferaz NO üretimi ile sonuçlanmalıdır eksprese etmeyen bir hücre hattı oluşturmak.
cAlternatif promotör kullanım onsequences aynı proteinin üretimini farklı proteinler 29 farklı N-uçlarının veya üretim proteinlerin üretimini içerir. Birden Bcrp1 / BCRP durumunda, (doku ya da hücre tipi özel) promoterler, aynı protein üretimini kontrol ederler. Benzer bir örüntü CYP19 (aromataz) geni 29, 31 için var. Burada yer alan protokol, bir doku ya da hücre hattı ilgi konusu bir proteinin transkripsiyonel kontrolü karmaşık mekanizmalar deşifre kullanarak temel adımları sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Douglas D. Ross ve University of Maryland, Baltimore, insan BCRP patent haklarına sahip.
Acknowledgments
Bu çalışma Douglas D. Ross ve Gazi İşleri Bölümü'nden Arif Hussain Merit İnceleme Awards tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 | |
References
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Ensembl Genome Browser. , http://Ensembl.org (2015).
- Transcript-based Display from Ensembl. , http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822 (2015).
- Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome (2015).
- National Center for Biotechnology Information (NCBI). , http://www.ncbi.nlm.nih.gov (2015).
- Promega. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. Quick Ligation Kit Protocol - M2200S. , (2014).
- Roche. XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
