Introduction
Un objectif fondamental de la médecine régénérative est la génération de nouvelles cellules, fonctionnels qui peuvent être utilisés pour réparer ou remplacer endommagé, dégénéré tissus. Refaire cellules adultes facilement disponibles dans de nouveaux, en les convertissant d'un type de cellule à une autre, est une approche particulièrement attrayante, surtout lorsque la population de cellules requises ne sont pas abondants ou difficiles d'accès. Cependant, les cellules adultes sont remarquablement stables. Ils acquièrent leur état différencié à travers une restriction progressive de leurs options et, une fois qu'ils atteignent la spécialisation terminale mature, ils conservent de manière stable , il 1.
Dans les dernières années , un certain nombre de protocoles ont été développés, qui permettent la reprogrammation de la pluripotence d'une cellule somatique (iPS) obtenue par l'expression forcée d'un ensemble de facteurs de transcription 2,3. Alternativement, la conversion de cellules peut être obtenue par transdifférenciation lignée directe, l' introduction d' un seul 4 5-7. Cette stratégie ne concerne pas le passage par un état de différenciée mais nécessite une forte expression de facteurs de transcription spécifiques 8.
Nous avons récemment développé un protocole de conversion basé sur la brève exposition des cellules adultes aux propriétés de déméthylation de la cytidine analogique 5-azacytidine (5-aza-CR), un inhibiteur de l'ADN méthyltransférase bien caractérisé. L'étape de déméthylation est immédiatement suivie par un protocole de différenciation spécifique 11/09 qui permet d'obtenir le phénotype de terminal requis. Ce procédé est capable de transformer des cellules matures différenciées en cellules d'une lignée différente et présente l'avantage considérable d'éviter à la fois l'utilisation de vecteurs viraux et la transfection de facteurs de transcription exogènes. L'acquisition d'un état pluripotent stable, et une sensibilité accrue liée à la cellule d'instabilité est également évitée.
9-13, ainsi que chez le chien (manuscrit soumis) , suggérant une grande efficacité et la robustesse de l'approche.
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Protocol
Remarque: Toutes les procédures décrites ci-après doivent être effectuées sous hotte à flux laminaire dans des conditions stériles. Assurez-vous que toutes les procédures de culture sont effectués sur les stades thermostatiques et les cellules sont maintenues à 37 ° C tout au long de leur traitement.
1. Peau Fibroblast Isolation
- Préparer Culture Solution Dish Coating
- Dissoudre 0,1 g de gélatine de porc dans 100 ml d'eau (concentration finale 0,1%). Stériliser solution avec autoclave.
- Ajouter 1,5 ml de stérile à 0,1% de gélatine porcine à 35 mm des boîtes de Pétri. Attendre 2 heures pour enrober, de les maintenir à la température ambiante.
Nota: Les biopsies de peau humaines sont recueillies par excision sous anesthésie locale d'une zone avasculaire de la face antérieure de l'avant-bras et stockés dans un tampon phosphate salin de Dulbecco (PBS) additionné de 2% d'une solution antimycosique antibiotique à 4 ° C avant utilisation.
- biopsies Laver avec de nouvelles PBS additionné de 2% Antibisolution antimycosique otique.
- La place des biopsies dans un plat de 100 mm de Pétri et coupées en environ 2 mm 3 fragments avec scalpels stériles.
- Retirer la solution revêtement en excès immédiatement avant le placage des fragments.
- Placez 5-6 fragments de peau dans le plat pré-enduit de 35 mm de Pétri.
- Préparer un milieu de culture de fibroblaste: 77% de milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) riche en glucose, 20% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de solution de L-glutamine et 2% d'une solution antibiotique antimycotique.
- Ajouter une goutte de milieu sur chaque fragment fibroblaste (habituellement 100 ul par fragment) et les cultiver à 37 ° C dans 5% de CO2.
- Après 24 h, ajouter 500 pi de milieu de culture de fibroblastes sur les fragments pour les garder humide à 37 ° C dans 5% de CO 2.
- Changer le support avec une pipette au moins une fois toutes les 48 heures.
- Après 6 jours d'incubation, éliminer les fragments de tissus soigneusement et jetez-les.
Remarque: Après 6 jours, fibroblastes commencent à se développer à partir de fragments de tissus et commencent à former une monocouche cellulaire. - Actualiser la moyenne, ajouter 2 ml de milieu de culture de fibroblastes et de continuer la culture monocouche de cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur.
2. Fibroblast Culture
- Des fibroblastes de culture à 37 ° C dans 5% de CO 2 jusqu'à 80% de confluence
- Pour les passages, Aspirer le milieu de culture de fibroblastes à partir des boîtes de culture tissulaire. Laver les cellules trois fois avec 4 ml de PBS supplémenté avec 1% de solution antibiotique antimycotique.
- Ajouter une couche mince (10% du volume du milieu de culture) de solution de trypsine-EDTA (0,5 g / l de trypsine porcine et 0,2 g / L d'EDTA) et on incube à 37 ° C jusqu'à la monocouche cellulaire commence à se détacher de la partie inférieure du tissu boîte de culture et les cellules se dissocient.
- Diluer la suspension cellulaire avec 9 parties de milieu de culture de fibroblaste pour neutraliser l'action de la trypsine. La centrifugation est pas nécessaire.
- cellules en plaques dans de nouvelles boîtes de culture (avecen gélatine) et la culture à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. Gardez le rapport de passage entre 1: 2 et 1: 4, en fonction du taux de croissance.
- Lorsque les cellules atteignent environ 80% de confluence, le passage entre eux (habituellement deux fois par semaine).
3. Fibroblast Placage pour la conversion épigénétique
- Ajouter 0,26 ml / cm 2 de 0,1% de gélatine porcine (comme décrit dans la préparation 1.1) dans des boîtes de culture cellulaire. Attendre 2 heures pour enrober.
- On élimine la solution de revêtement en excès de 10 à 30 minutes avant le placage des fibroblastes.
- Éliminer le milieu de culture des fibroblastes à partir de boîtes de culture. Laver les cellules trois fois avec du PBS additionné de 1% solution antifongique antibiotique.
- Ajouter une couche mince (10% du volume du milieu de culture) de solution de trypsine-EDTA (0,5 g / l de trypsine porcine et 0,2 g / L d'EDTA) et on incube à 37 ° C jusqu'à la monocouche cellulaire commence à se détacher de la partie inférieure du tissu boîte de culture et les cellules se dissocient.
- Diluer la suspension cellulaire avec 9 parties de fibroblMilieu de culture ast pour neutraliser l'action de la trypsine.
- Nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage au microscope à température ambiante. Calculer le volume requis de milieu de culture de fibroblaste pour remettre en suspension les cellules, pour obtenir une concentration cellulaire de 7,8 x 10 4 fibroblastes / cm2. Cela dépendra du type particulier de chambre utilisée.
Cellules / pl = Nombre moyen de cellules par petite grille x 90 (facteur de multiplication) x dilution - Centrifuger la suspension de cellules à 150 g pendant 5 min à température ambiante. Éliminer les cellules surnageant et remettre le volume précédemment calculé de milieu de culture de fibroblastes.
- Cellules de plaques sur 0,1% de gélatine plats et la culture les pendant 24 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur pré-revêtues.
4. Augmenter la plasticité cellulaire Utilisation du De-méthylation Agent 5-aza-CR
- jour 0
- Préparer 5-aza-CR solution mère en dissolvant 2,44 mg de 5-aza-CR dans 10 ml de DMEM haute medi de glucoseum. Stériliser par filtration. Préparer 5-aza-CR actions immédiatement avant l'utilisation.
- Diluer 1 pl de 5-aza-CR solution mère dans 1 ml de milieu de culture de fibroblastes (concentration finale de 1 uM).
- Pour augmenter la plasticité des cellules, 24 heures après l' étalement des cellules (sous - position 3.8), éliminer le milieu de culture à partir de fibroblastes ensemencés et ajouter 1 uM 5-aza-CR solution mère et de la culture pendant 18 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur.
- jour 1
- Préparer pluripotentes humaines (HP) du milieu frais comme décrit dans le tableau 1.
- Après incubation avec 1 pM de 5-aza-CR, éliminer le milieu et laver les cellules trois fois avec du PBS pour veiller à ce que 5-aza-CR est rincé.
- Incuber 5-aza-CR fibroblastes traités avec du milieu HP pendant 3 h (période de récupération) à 37 ° C dans 5% de CO 2.
- Après la période de récupération, éliminer le milieu, laver trois fois avec PBS.
- Pour surveiller l'efficacité du traitement-CR 5-aza, vérifier dans cette étape fou la présence de changements morphologiques (détaillée dans la section des résultats). Les cellules perdent la morphologie allongée typique de fibroblastes et d'acquérir une forme ronde ou ovale, devenant de plus petite taille, avec des noyaux agrandis.
- Procéder à la différenciation pancréatique.
5. Pancreatic Protocole Différenciation
- Jours 1-6
- Préparer Pancreatic Basal Medium , comme décrit dans le tableau 2.
- Préparer activine Une solution mère: dissoudre 5 pg d'activine Une protéine humaine recombinante dans 166,6 pi d'eau stérile.
- Culture 5-aza-CR fibroblastes traités dans 0,26 ml / cm 2 de Pancreatic Basal Medium, additionné de 1 pl / ml activine Une solution mère (voir 5.1.2) pendant 6 jours à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. Changer le milieu tous les jours.
- Jours 7-8
- Préparer rétinoïque solution mère d'acide en ajoutant 16,6 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 50 mg de aci rétinoïqueré.
- Cellules de culture dans 0,26 ml / cm 2 de Pancreatic Basal Medium supplémenté avec 1 pl / ml activine Une solution mère (voir 5.1.2) et / ml de solution mère d' acide rétinoïque 1 pl (voir 5.2.1) pendant 2 jours à 37 ° C à 5% de CO 2. Changer le milieu tous les jours.
- Jours 9-36
- Cellules de culture dans 0,26 ml / cm 2 de Pancreatic Basal Medium supplémenté avec 1% (v / v) Insulin-transferrine-Sélénium (ITS), 2% (v / v) B27 et 0,1% (v / v) recombinant FGF humain de base (bFGF) solution mère (voir le tableau 1) à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. Changer le support quotidien pour les 15 premiers jours.
- A partir du jour 16 avant, rafraîchir milieu tous les deux jours, sous un microscope, étant donné que les cellules formant des agrégats peut se détacher de la partie inférieure de la boîte de culture.
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Representative Results
Mise en place de la culture primaire à partir de biopsies de peau
Des biopsies cutanées ont été découpées en petits morceaux et placés dans des boîtes pré-revêtues de gélatine. Au bout de 6 jours, les fibroblastes commencent à croître à partir de fragments de tissus et ont formé une monocouche de cellules (figure 1A). Les cellules ont montré une forme typique allongée et, comme prévu, affichent une immuno-positivité uniforme pour le fibroblaste spécifique marqueur vimentine (Vim, figure 1B).
Les modifications morphologiques et de méthylation de fibroblastes de la peau après une exposition de 18 h à 5-aza-CR
Pour obtenir une conversion réussie épigénétique des fibroblastes en cellules sécrétrices d'insuline, nous avons augmenté leur plasticité en utilisant l'agent de-méthylation, 5-aza-CR. Des fibroblastes humains ont été étalées sur des boîtes pré-revêtues de gélatine à 0,1% à une concentration de 7,8 x 10 4 fibroblastes / cm2. Vingt-quatre heures après l'ensemencement, les cellules wavant incubée avec 1 pM de 5-aza-CR pendant 18 heures.
A l'issue de ce traitement, un changement très étendue de phénotype cellulaire était visible (5 post-aza-CR, figure 2A). La morphologie allongée typique de fibroblastes non traités (T0, figure 2A), a été remplacé par une forme ronde ou ovale et la taille des cellules est devenue considérablement plus petite. Cytoplasme granulaire est aplati, et les cellules sont adhérentes à la surface de culture. Nuclei est apparu plus grand et vacuolées, en raison de la structure de la chromatine détendue. Dans notre expérience, la présence de ces changements morphologiques est essentielle et doit être soigneusement surveillé en tant que marqueur pour l'efficacité du traitement 5-aza-CR.
Après 18 heures d'exposition à 5-aza-CR, une forte diminution de la méthylation globale de l'ADN a également été évidente et a été clairement démontré par l'intensité diminuée de 5-methylcytidine immunocoloration ( Les changements morphologiques et fonctionnels lors de la conversion épigénétique de la peau des fibroblastes en cellules sécrétrices d'insuline Au cours de la première étape, les cellules ont été cultivées pendant 7 jours dans Pancreatic Basal Medium supplémenté avec de l'activine A à promouvoir l'engagement de l'endoderme. Dans cet intervalle, les cellules plus aplaties et peu à peu commencé à organiser en grappes (Jour 7, figure 3A). Par la suite, la différenciation de la lignée pancréatique a été favorisée par l'addition d'acide rétinoïque pendant 2 jours. En réponse à ce traitement, les cellules réarrangées dans un motif réticulaire et a grandi dans les agrégats clairement distinguables cellulaires (Jour 10, figure 3A). La formation de clustering process a augmenté avec le temps et a en outre été stimulée par la troisième et dernière étape, qui consistait en une exposition de cellules à B27, bFGF et ITS. Cela a conduit au recrutement d'un nombre croissant de cellules qui agrégées dans les grandes colonies 3D (jour 20, la figure 3A). Autour de 36 jours, ces colonies sont apparues comme des structures rondes distinctes rappelant îlots typiques pancréatiques in vitro (de jour 36, la figure 3A). L'acquisition du nouveau phénotype EPICC a été accompagnée d'une augmentation progressive des niveaux globaux de méthylation d' ADN qui sont retournés à ceux observés dans les fibroblastes non traités (5 mC Jour 36 Figure 3B). Après 36 jours d'induction du pancréas, le rendement de conversion épigénétique a également été mise en évidence par l'expression de marqueurs typiques pancréatiques matures, qui étaient à l'origine indétectable dans les fibroblastes non traités (T0, Tableau 1: solutions matérielles. Tableau 2: solutions matérielles.
Pour induire la différenciation pancréatique, 5-aza-CR fibroblastes traités ont été exposés à un protocole en trois étapes pour l'induction du pancréas, immédiatement après la période de récupération de 3 heures. 
Figure 1: Isolement et caractérisation des fibroblastes de peau humaine (A) l' image représentant des fibroblastes en croissance sur les fragments de tissus.. (B) Fibroblastes affichent une immuno-positivité uniforme pour leur svimentine marqueur pécifique (Vim). Nuclei sont colorées avec du DAPI. (Barres d'échelle, 100 um). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 2: Les changements morphologiques et de méthylation de fibroblastes de peau humaine après 5-aza-CR traitement (A) Des images représentatives de fibroblastes non traités présentant une forme allongée (T0), et 5-aza-CR fibroblastes traités présentant une forme ronde ou morphologie ovale, granulés. cytoplasme, et élargis et vacuolées noyaux (Ajouter 5-aza-CR). (barres d'échelle, 100 um). (B) une diminution de la méthylation globale de l' ADN est détectée après que la 5-aza-CR traitement (post-5 aza-CR). (Barres d'échelle, 50 pm). S'il vous plaît clbeurk ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 3:. Les changements morphologiques et fonctionnels lors de la conversion épigénétique (A) images représentatifs des changements morphologiques qui ont lieu lors de la différenciation du pancréas endocrine. Au bout de 7 jours d'induction, les cellules humaines organisent progressivement en grappes (jour 7). En réponse à l'addition de l'acide rétinoïque, ils réarrangent dans un modèle réticulaire et cluster dans les agrégats distinguables (Jour 10). Ces formations progressent avec le temps, le recrutement de cellules et l'agrégation dans les grandes colonies 3D (Jour 20). Enfin, les colonies deviennent des structures sphériques qui ont tendance à se détacher et flotter librement dans le milieu de culture, qui rappelle les îlots pancréatiques typiques in vitro (Jour 36). (barres d'échelle, 100 um). (B) Après 36 jours de pancréas enla production, les niveaux globaux de méthylation d'ADN de retour EPICC humaine à ceux observés dans les fibroblastes non traités (5 jours mC 36). (Barre d'échelle, 50 pm). Co-localisation de PDX1 avec le C-PEP est détectable à la fin de la période de conversion (jour 36), alors que ces marqueurs du pancréas endocrine sont complètement absentes dans les fibroblastes non traités (T0). (barres d'échelle, 100 um). (C) EPICC la sécrétion d' insuline en réponse à 20 mM de D-glucose et 20 mM d'exposition de L-glucose. Les barres représentent la moyenne ± écart - type de trois répétitions indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Nom du matériel / équipement Quantité (v / v) Commentaires / Description F-10 Nutrient Mix de Ham 40% DMEM faible taux de glucose 40% KnockOut Serum Replacement dix% FBS 5% solution antifongique antibiotique 1% solution de L-glutamine 1% Solution d'acides aminés MEM non essentiels 1% 2-Mercaptoethanol stocks 1% 2-Mercaptoethanol stocks préparation: diluite 3,5 pi de 2-mercaptoéthanol dans 5 ml de PBS stérile. Magasin dans l'obscurité à +4 ° C. Remarque: Utiliser dans les 2 semaines Nucléosidiques mix stocks 1% nucléosidiques mélanger la préparation du stock: dissoudre 0,042 g guanosine, 0,040 g adénosine, 0,036 g cytidine, 0,036 g uridine et 0,012 g Timidine dans 50 ml d'eau stérile. Faire fondre à 50 ° C pour dissoudre. Stériliser par Filtration et conserver à +4 ° C ESGRO (FRV) 0,1% FGF humain recombinant de base (bFGF) Stock 0,1% bFGF stocks préparation: ajouter 5 ml de 0,1% de sérum albumine bovine (BSA) dans du PBS à 25 pg de bFGF Nom du matériel / équipement Quantité (v / v) Commentaires / Description DMEM / F-12 93% B-27 supplément de vitamine A Minus 2% N-2 Supplément 1% Solution d'acides aminés MEM non essentiels 1% Antibiotiquesolution antimycosique 1% 2-Mercaptoethanol stocks 1% 2-Mercaptoethanol stocks préparation: diluite 3,5 pi de 2-mercaptoéthanol dans 5 ml de PBS stérile. Magasin dans l'obscurité à +4 ° C. Remarque: Utiliser dans les 2 semaines solution de L-glutamine 1% BSA disponible 1% Préparation de BSA stock: dissoudre 250 mg dans 50 ml d'eau. Stériliser par filtration et conserver à +4 ° C.
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Discussion
La présente manuscrit décrit un procédé qui permet la conversion des fibroblastes de peau humaine dans des cellules productrices d'insuline, par une exposition transitoire et de courte durée à 5-aza-CR, suivi d'un protocole d'induction spécifique d'un tissu. Cette approche permet un passage du mésoderme aux cellules de l' endoderme liées, sans l'expression forcée de facteurs de transcription ou de microARN , ni l'acquisition d'un état pluripotent stable, qui rend les cellules plus instables et sujettes à des erreurs 14.
Dans la première étape, la plasticité cellulaire est augmentée grâce à un modificateur épigénétique synthétique qui induit un état permissif réversible transitoire dans des cellules différenciées. En particulier, la 5-aza-CR a été utilisé pour provoquer une diminution de la méthylation globale des cellules de fibroblastes de la peau. 5-aza-CR est connu pour inhiber directement l' activité méthyl-transférase et d'empêcher novo méthylation dans l' ADN nouvellement synthétisé. En raison de son effet, cette moléculea été précédemment utilisé pour réactiver les gènes silencieux, ainsi que de modifier les états de différenciation des cellules eucaryotes 15,16. Fibroblastes Conformément à cela, envoyer 5-aza-CR peau ont montré une déméthylation d'ADN global (figure 2A), ce qui indique 5-aza-CR capacité à augmenter la plasticité des cellules utilisées pour les présentes expériences. Ceci est également en accord avec l'observation que le 5-aza-CR facilite l' expression du marqueur lié à la plasticité haute Oct-4 dans les cellules de neurosphères (NNC) 17. Cependant, il est intéressant de noter que le poste 5-aza-CR fibroblastes cutanés reviennent à leur phénotype initial après le retrait du 5-aza-CR. En effet, nous l' avons déjà démontré que les fibroblastes sont retournés dans leur milieu de culture d' origine, en baisse de l' expression régulée des facteurs liés à la pluripotence-9,10, indiquant que l'état de plus grande plasticité acquise, en réponse à la modification épigénétique, est transitoire, réversible et ne comporte pas des modifications permanentes de til cellules.
Des changements notables dans la morphologie des cellules ont accompagné l'induction d'un état supérieur de plasticité (figure 2A). Les corps types de cellules allongées des cellules de fibroblastes non traités ont été remplacées par des cellules rondes ou ovales en forme qui présente des dimensions plus petites et un volume accru de noyaux, ce qui est apparu plus grande que celle des cellules différenciées. Niwa corrélé cet élargissement nucléaire à une structure de la chromatine détendue décrite comme une caractéristique liée pluripotence-18. La présence de noyaux et le cytoplasme granulaire vacuoles, ainsi qu'une augmentation de la morphologie des Platten, étaient évidents. Tous les changements morphologiques décrits peuvent être utilisés en pratique comme marqueur pour la réussite de la première partie du protocole de conversion; dans notre expérience, lorsque les changements sont présents, 5-aza-CR a en effet des cellules d'acquérir un état plus permissif aidé.
Il est possible de profiter de cette transitoires "permis élevéstemps de fenêtre sivity "pour conduire les cellules vers un phénotype complètement différent. Le présent protocole démontre que les fibroblastes après 5-aza-CR peuvent être re-traitées à des cellules analogues à des cellules bêta du pancréas, en réponse à un milieu de différenciation spécifique. Le protocole utilisé permettent aux cellules de passer d'un type de cellule mésodermique dérivée d'une population de cellules appartenant à la lignée de l'endoderme.
L' insuline, qui était à l' origine non détectable dans les fibroblastes de la peau non traitée, a été positif , à la fin du protocole de différenciation (figure 3B). Ceci a été accompagné par l'expression simultanée d'autres facteurs, tels que PDX1, impliqués dans la différenciation de l'ensemble du pancréas - son exocrine, endocrinien, et les populations de cellules canalaires, à côté de la lignée spécifique des cellules bêta. Ceci est cohérent avec les travaux antérieurs sur les cellules souches embryonnaires de souris (ESC) indiquant qu'une différenciation appropriée dans des cellules bêta a été réalisée que lorsque les cellules immatures ont été posés avec othecellules r endocrines 19, ce qui suggère que le micro-environnement local fourni par l'îlot pancréatique de l' architecture de Langerhans a un rôle fonctionnel fort.
En effet, EPICC a réalisé un phénotype différencié mature et a montré la capacité de répondre à 20 mM exposition glucose (figure 3). L' insuline a été activement sécrété dans le milieu de culture après 1 h de stimulation D-glucose, ce qui confirme la bonne foi de EPICC comme celles produisant de l' insuline (figure 3C).
Une exigence pour une procédure distincte de succès est le maintien rigoureux des cellules à 37 ° C, à toutes les étapes, y compris leur traitement sous flux laminaire stérile et le microscope. Dans notre expérience, il est également fortement recommandé de préparer des réactifs fraîchement, avant leur utilisation dans la culture et de rafraîchir moyen strictement selon le protocole. Cette opération doit être réalisée sous microscope puisque les cellules agrégées formantpeut se détacher du fond du récipient de culture et a perdu au cours de changements de milieu.
Le protocole de conversion épigénétique a également été appliquée avec succès à l'espèce porcine, ainsi que pour le chien (manuscrit soumis), en utilisant la cellule même nombre / cm 2 et la concentration de l' agent de-méthylation décrit pour l' homme.
En conclusion, un protocole qui permet la conversion des fibroblastes de la peau dans un autre type de cellule est présentée ici. La stratégie décrite présente les avantages d'une conversion de cellules à base épigénétique-: à savoir la possibilité d'éviter un état pluripotent qui pourrait laisser des cellules capables de provoquer le cancer; l'élimination des facteurs génétiques exogènes qui pourraient causer des changements persistants dans les cellules. Ces avantages font de la présente approche très prometteuse pour les applications de médecine translationnelle et permet pour la thérapie du patient cellulaire spécifique.
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Disclosures
Les auteurs déclarent avoir aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la Fondation Carraresi et la Fondation européenne pour l'étude du diabète (EFSD). GP est soutenu par une bourse post-doc de l'Université de Milan. Les auteurs sont membres de l'Action COST FA1201 Epiconcept: Epigénétique et périconceptionnelle environnement et l'action COST partage BM1308 avance sur les grands modèles animaux (SALAAM). TALB est membre du COST Action CM1406 épigénétique Chemical Biology (EPICHEM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1 µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
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