Introduction
재생 의료의 기본적인 목적은 수리되거나 손상된 대체 할 수있는 새로운 기능성 세포의 세대, 조직 변성. 다른 하나의 세포 유형에서 그들을 변환하여, 새로운에 쉽게 사용할 성인 세포 개조하기 필요한 세포 집단 액세스가 풍부하거나 어렵지 않다 특히, 특히 매력적인 방법이다. 그러나, 성인 세포는 매우 안정하다. 그들은 성숙한 터미널 전문화에 도달하면, 그들은 안정적는 1을 유지, 자신의 선택에 점진적으로 제한을 통해 차별화 된 상태를 취득합니다.
체세포 (IPS)의 다 능성을 재 프로그래밍을 가능하게하는 프로토콜 번호가 개발되었으며 최근 년에 전사 세트 2,3- 요인의 강제 발현을 통해 달성. 또한, 셀 변환 (4) 하나를 소개, 직접 혈통의 분화에 의해 얻을 수있다 5-7 요인. 이 전략은 역 분화 상태를 통해 전환을 포함하지만, 특정 전사가 8 요인의 고 발현을 필요로하지 않습니다.
우리는 최근 시티 딘 유사체 5- 아자 시티 딘 (5 아자 - CR), 잘 특징 DNA의 메틸화 억제제의 탈 메틸화 특성 성체 세포의 짧은 노출에 기초하여 변환 프로토콜을 개발했다. 탈 메틸화 단계는 즉시 필요한 단말 표현형을 얻을 수있는 특정 분화 프로토콜 9-11 따른다. 이 방법은 다른 혈통의 세포로 성숙, 분화 세포로 변환 할 수 있으며, 바이러스 벡터의 사용 및 외인성 전사 인자의 형질을 모두 회피하는 상당한 이점을 갖는다. 안정적인 만능 상태의 취득 및 불안정성을 셀에 관련 증가 감수성도 피할 수있다.
9-13 종뿐만 아니라 개에서 사용 된 방법의 다양한 효능과 안정성을 제안 (원고 제출).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
주의 : 아래에 기재된 모든 절차를 무균 상태에서 층류 후드에서 수행되어야한다. 그들의 처리에 걸쳐 37 ° C에서 모든 문화 절차가 온도 조절 단계에서 수행하는 세포가 유지되어 있는지 확인합니다.
1. 피부 섬유 아세포의 분리
- 문화 접시 코팅액을 제조
- 물 (최종 농도 0.1 %) 100 ㎖에 돼지 젤라틴 0.1 g을 녹인다. 오토 클레이브와 솔루션을 소독.
- 35mm 배양 접시에 무균 0.1 % 돼지 젤라틴의 1.5 ML을 추가합니다. 실온에서 그들을 유지, 코트에 2 시간을 기다립니다.
주 : 인간의 피부 생검 전완의 앞쪽 양태의 무 혈관 영역에서 국소 마취 절제하여 수거하고, 사용하기 전에 4 ℃에서 2 % 항생제 항진균제 용액이 보충 된 둘 베코 인산염 완충 식염수 (PBS)에 저장된다.
- 새로운 PBS로 세척 생검은 2 % antibi 보충귀 안티 곰팡이 솔루션입니다.
- 장소 a를 100mm 페트리 접시에 조직 검사와 멸균 메스와 약 2mm 3 조각으로 잘라.
- 단편 도금 직전에 도포 액의 과도한 제거.
- 사전 코팅 35mm 페트리 접시에 5-6 피부 조각을 놓습니다.
- 섬유 아세포 배양 배지를 준비 : 77 % 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 고 글루코스, 20 % 우 태아 혈청 (FBS), 1 % L- 글루타민 용액 및 2 % 항생제 항진균제 용액.
- 5 % CO 2 37 ° C에서 각각의 조각 (조각 당 보통 100 μL), 문화 그들을 섬유 아세포 매체의 방울을 추가합니다.
- 24 시간 후, 5 % CO 2에서 37 ℃에서 습윤을 유지하기 위해 조각 위에 섬유 아세포 배양 배지 500 μl를 추가한다.
- 적어도 한 번 피펫마다 48 시간과 매체를 변경합니다.
- 배양 6 일 후, 조심스럽게 조직 조각을 제거하고 폐기합니다.
참고 : 6 일 후, 섬유 아세포S는 조직 절편에서 성장하고 세포 단층을 형성하기 시작한다. - 매체 고침 섬유 아세포 배양액 2 ㎖를 추가 한 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포 단층 배양을 계속한다.
2. 섬유 아세포 문화
- 37 ° C에서 배양 섬유 아세포 5 % CO 2에서 80 %의 합류까지
- 조직 배양 접시에서 계대, 흡인 섬유 아세포 배양 배지하십시오. PBS의 4 ㎖로 세포를 세 번 씻으 1 % 항생제 항진균제 용액으로 보충.
- 트립신 EDTA 수용액 (0.5 g / 리터 돼지 트립신 및 0.2 g / L EDTA)의 얇은 층 (배양 배지 용적의 10 %)를 첨가하고, 세포 단층을 조직의 바닥으로부터 분리되기 시작할 때까지 37 ° C 부화 배양 접시에 세포를 떼어 놓다.
- 트립신 작용을 중화 섬유 아세포 배지 9 부를 세포 현탁액을 희석. 원심 분리는 필요하지 않습니다.
- 새로운 배양 접시에서 플레이트 세포 (와젤라틴 아웃)과 문화 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서. 성장 속도에 따라, 4 : 2, 1 : 1 사이의 통로 비율을 유지한다.
- 세포 (주당 보통 회) 약 80 %의 합류 통로를 도달하면.
성적인 변환 3. 섬유 아세포 도금
- 세포 배양 접시에 0.26 ㎖ / 0.1 % 돼지 젤라틴 cm 2 (1.1에 설명 된대로 준비) 추가합니다. 코트에 2 시간을 기다립니다.
- 섬유 아 세포를 도금하기 전에 도포 액을 초과하는 10 ~ 30 분을 제거합니다.
- 배양 접시에서 섬유 아세포 배양 배지를 제거합니다. PBS로 세포를 세 번 씻으 1 % 항생제 항진균제 용액으로 보충.
- 트립신 EDTA 수용액 (0.5 g / 리터 돼지 트립신 및 0.2 g / L EDTA)의 얇은 층 (배양 배지 용적의 10 %)를 첨가하고, 세포 단층을 조직의 바닥으로부터 분리되기 시작할 때까지 37 ° C 부화 배양 접시에 세포를 떼어 놓다.
- fibrobl 9 부분으로 세포 현탁액을 희석AST 배지는 트립신 중화 작용.
- 실온에서 현미경 카운팅 챔버를 이용하여 세포 수를 계산. / ㎠ 7.8 × 104 섬유 아세포의 세포 농도를 얻기 위해, 세포를 재현 탁하는 섬유 아세포 배양액의 필요한 부피를 계산한다. 이것은 사용 챔버의 특정 유형에 의존 할 것이다.
셀 / μL = 작은 그리드 X 90 (곱셈) × 희석 당 세포의 평균 수 - 실온에서 5 분 동안 150g로 원심 분리 세포 현탁액. 섬유 아세포 배지 이전에 계산 된 양으로 재현 탁하고 세포 상등액을 제거한다.
- 0.1 % 젤라틴 미리 코팅 요리와 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 문화를 접시에 세포.
탈 메틸화 에이전트 5 아자 - CR을 사용하여 4. 증가 셀 소성
- 날 0
- DMEM 고 글루코스 메디칼 10ml에 5- 아자 CR 2.44 mg을 용해시켜 5- 아자 - CR 원액을 준비음. 여과 소독. 바로 사용하기 전에 5 아자 - CR 주식을 준비합니다.
- 섬유 아세포 배양 배지 (최종 농도 1 μM) 1 ㎖에 5 아자 CR 원액 1 μl를 희석.
- 세포의 가소성, 세포 도금 (소호 3.8) 후 24 시간을 늘리려면 시드 섬유 아 세포에서 배지를 제거하고 CO 2 배양기 5 %에서 37 ° C에서 18 시간 동안 1 μM 5 아자 - CR 원액과 문화를 추가 할 수 있습니다.
- 1 일
- 표 1에 기재된 바와 같이 신선한 인간 다 능성 (HP) 배지를 준비한다.
- 1 μM 5 아자 CR 함께 배양 한 결과, 5- 아자 - CR 멀리 세정되도록 PBS로 3 회 배지를 제거하고 세포를 세척한다.
- 부화 -5- 아자 - CR 5 % CO 2에서 37 ℃에서 3 시간 (회복 기간)에 대한 HP 매체 처리 아세포.
- 회복 기간 후, 중간 제거 PBS로 3 회 세척한다.
- 5- 아자 - CR 처리의 효율을 모니터링하기 위해,이 단계 f 체크인또는 형태 학적 변화의 존재는 (결과 섹션에 설명). 세포는 섬유 아세포의 전형적인 긴 형태를 잃고 확대 핵으로, 크기가 작아지고, 원형 또는 타원형 모양을 취득.
- 췌장 분화를 진행합니다.
5. 췌장 분화 프로토콜
- 일 1-6
- 표 2에 기술 된 바와 같이 췌장 기초 배지를 준비합니다.
- 원액을 티빈 준비 : 멸균의 166.6 μL에서 재조합 인간 단백질을 티빈의 5 μg의 용해.
- 배양 5 아자 CR 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 6일 위해 (5.1.2 참조) 1 μL / ㎖ 액 티빈 원액 보충 0.26 ㎖ / cm 췌장 기초 배지 2에서 섬유 아세포를 처리 하였다. 매체 매일을 변경합니다.
- 일 7-8
- 레티노 ACI 50 mg의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 16.6 ml에 첨가하여 레티노 산 원액을 준비디.
- 췌장 기초 배지 0.26 ㎖ / cm 2 배양 세포는 1 μL / ㎖ 37 ℃에서 원액 (5.1.2 참조) 2 일간 1 μL / ㎖ 레티노 산 원액을 (5.2.1 참조) 티빈 C 보충 5 %의 CO 2. 매체 매일을 변경합니다.
- 일 9-36
- 췌장 기초 배지 0.26 ㎖ / cm 2 배양 세포 (v / v)의 인슐린 트랜스페린 - 셀레늄 (ITS), 2 % (v / v)의 B27 0.1 % (v / v)의 재조합 인간 FGF 기본 1 %로 보충 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 (bFGF의) 원액 (표 1 참조). 처음 15 일 동안 매일 매체를 변경합니다.
- 이후 하루에 16에서, 배양 접시의 바닥에서 분리 할 수 있습니다 집계 세포를 형성하기 때문에, 현미경, 매일 매체를 새로 고칩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
피부 생검에서 차 문화의 설립
피부 생검은 작은 조각으로 잘라 젤라틴 미리 코팅 요리에 넣었다. 육일 후, 섬유 아세포는 조직 조각에서 성장하기 시작하고 세포 단층 (그림 1A)을 형성했다. 세포는 전형적인 긴 형태를 보여, 예상대로 섬유 아세포 특정 마커 멘틴 (빔, 그림 1B)의 균일 한 면역 양성을 표시.
5 아자 - CR에 18 시간 노출 후 피부 섬유 아 세포의 형태 학적 변화와 메틸화 패턴
인슐린 분비 세포로 섬유 아세포의 성공적인 후생 유전 학적 변환을 얻으려면, 우리는 탈 메틸 화제, 5 아자 - CR을 사용하여 가소성을 증가했다. 인간 섬유 아세포를 7.8 × 104 아세포 / ㎠의 농도로 0.1 % 젤라틴 프레 코트 접시에 플레이 팅 하였다. 파종 후 스물 네 시간, 세포 w조립식 18 시간 동안 1 μm의 5 아자 - CR 배양.
이러한 처리의 마지막에, 세포의 표현형의 광범위한 변화는 POST (5- 아자 CR,도 2a) 볼 수 있었다. 미처리 섬유 아세포 (T0,도 2a)의 전형적인 가늘고 긴 형태는 원형 또는 타원형으로 대체하고 셀 크기가 훨씬 작다되었다. 세포질 과립이었다 평평하고 세포 배양 표면에 부착 하였다. 핵 크게 나타나 완화 염색질 구조의 결과로서, 액포. 우리의 경험에서, 이러한 형태 학적 변화의 존재는 필수적이고 신중 -5- 아자 - CR 처리의 효율을위한 마커로서 모니터링되어야한다.
18 시간 노출 오 아자 - CR, 글로벌 DNA 메틸화의 급격한 감소 (또한 분명했다 명확하게 5 메틸 시티 딘의 면역 염색의 감소 강도에 의해 입증 된 후 피부의 후생 유전 학적 변환하는 동안 형태 학적 및 기능적 변화는 인슐린 분비 세포로 섬유 아세포 첫 번째 단계에서, 세포는 내배엽의 투입을 촉진 티빈 보충 췌장 기초 배지에서 7 일간 배양 하였다. 이 간격에서 서서히 평평하고 세포 클러스터 (7 일,도 3a)에 정리하기 시작했다. 그 후, 췌장 혈통 차별화 2 일 레티노 산의 추가로 승진했다. 이러한 처리에 응답하여, 셀은 망상 패턴으로 재 배열하고 명확하게 구별 세포 집합체 (주 10,도 3A)에서 자랐다. 클러스터링 형성 페이지로웠 시간 증가 또한 B27, 및 bFGF에 ITS에 세포의 노출로 이루어진 세 번째와 마지막 단계에 의해 자극 하였다. 이 큰 3D 식민지에서 집계 세포의 증가 (주 20,도 3a)의 채용되었다. 하루 36 주위에,이 식민지는 체외에서 전형적인 췌장 섬 (주 36,도 3a)를 연상시키는 독특한 원형 구조를 보였다. 새로운 EpiCC 표현형의 인수는 처리되지 않은 섬유 아세포 (5 MC 일 36도 3b)에서 관찰에게 반환 글로벌 DNA 메틸화 수준의 점진적 증가를 동반했다. 췌장 유도 36 일 후, 후생 유전 학적 변환의 효율도 처리되지 않은 섬유 아 세포에서 원래 검출되지 있었다 전형적인 성숙 췌장 마커의 발현 (T0에 의해 입증되었다, 표 1 : 소재 솔루션을 제공합니다. 표 2 : 소재 솔루션을 제공합니다.
췌장 분화를 유도하기 위해, 5- 아자 - CR 처리 된 섬유 아세포는 바로 3 시간 회복 기간 후에, 췌장 유도 세 단계 프로토콜에 노출시켰다. 
그림 1 : 분리 및 인간의 피부 섬유 아세포의 특성 조직 조각의 성장하는 섬유 아 세포의 (A) 대표 이미지.. (B) 섬유 아 세포는 초 동안 균일 한 면역 양성을 표시pecific 마커 멘틴 (빔). 핵은 DAPI로 염색된다. (스케일 바, 100 μm의). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 2 : 인간의 피부 섬유 아 세포의 형태 학적 및 메틸화 변화 5 아자 - CR 처리 후 (A) 과립 가늘고 긴 모양 (T0)를 보여주는 치료 섬유 아 세포의 대표 이미지 및 원형 또는 타원형 형태를 표시하는 5 아자 - CR 처리 된 섬유 아세포. 세포질 및 확대 및 액포 핵 (후 5 아자 - CR). (스케일 바, 100 μm의). (B)는 전체 DNA 메틸화가 감소 5- 아자 - CR 처리 후 (포스트 -5- 아자 - CR) 검출이다. (스케일 바, 50 μm의). 카스티하세요이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 ICK. 
그림 3 :. 후생 유전 학적 변환하는 동안 형태 학적 및 기능적 변화 (A) 내분비 췌장 분화하는 동안 일어나는 형태 학적 변화의 대표적인 사진. 유도의 7 일 후, 인간의 세포는 점차 클러스터 (7 일)에 개최합니다. 레티노 산의 첨가에 응답하여, 그들이 구별 집합체 (10 일째)에서 그물 무늬 클러스터에서 재 배열. 이 구조물은 (주 20) 세포를 모집 대형 3D 식민지에서 집계, 시간 진행. 마지막으로, 콜로니를 분리하고 체외에서 전형적인 췌장 섬 (주 36)를 연상시키는 배지, 자유롭게 부유하는 경향이 구형 구조가된다. (스케일 바, 100 μm의). 췌장 36 일 후 (B)duction, 처리되지 않은 섬유 아세포 (5 MC의 날 36)에서 관찰 된 것과 인간의 EpiCC 반환의 글로벌 DNA 메틸화 수준. (스케일 바, 50 μm의). 이러한 내분비 췌장 마커가 처리되지 않은 섬유 아세포 (T0)에서 완전히 결석하는 동안 C-PEP와 PDX1의 공동 현지화, 전환 기간 (주 36)의 끝에서 검출합니다. (스케일 바, 100 μm의). 20 mM의 D-포도당과 20 mM의 L 포도당 노출에 응답 (C) EpiCC의 인슐린 분비. 바는 3 개의 독립적 인 복제의 SD ± 평균을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 소재 / 장비의 이름 수량 (v / v)의 댓글 / 설명 햄의 F-10 영양소 믹스 40 % DMEM 낮은 포도당 40 % 마네 세럼 교체 10 % FBS 5 % 항생제 항진균제 솔루션 1% L 글루타민 솔루션 1% MEM 비 필수 아미노산 솔루션 1% 2- 머 캅토 에탄올의 재고 1% 2- 머 캅토 에탄올 스톡 제조 : 멸균 PBS 5ml에 2- 머 캅토 에탄올 diluite 3.5 μL. 4 ° C에서 어둠 속에서 보관하십시오. 참고 : 2 주 이내에 사용 뉴 클레오 시드 믹스 재고 1% 재고 준비를 혼합 뉴 클레오 시드 : 0.042 g의 구아노 신, 0.040 g의 아데노신, 0.036 g의 시티 딘, 0.036 g의 우리 딘 및 멸균 물 50 ㎖에서 0.012 g의 Timidine을 녹인다. 용해 50 ℃에서 용융. filtrat에 의해 소독4 ° C에서 이온 및 저장 ESGRO (LIF) 0.1 % 재조합 인간 FGF 기본 (bFGF를) 재고 0.1 % bFGF를 재고 준비 : 5 ㎖를 추가 0.1 %의 bFGF의 25 μg의에서 PBS에 소 혈청 알부민 (BSA) 소재 / 장비의 이름 수량 (v / v)의 댓글 / 설명 DMEM / F-12 93 % B-27 보충 마이너스 비타민 A 2 % N-2 (부록) 1% MEM 비 필수 아미노산 솔루션 1% 항생 물질안티 곰팡이 솔루션 1% 2- 머 캅토 에탄올의 재고 1% 2- 머 캅토 에탄올 스톡 제조 : 멸균 PBS 5ml에 2- 머 캅토 에탄올 diluite 3.5 μL. 4 ° C에서 어둠 속에서 보관하십시오. 참고 : 2 주 이내에 사용 L 글루타민 솔루션 1% BSA의 재고 1% BSA 스톡의 제조 : 물 50 ㎖에 250 mg을 용해. 4 ° C에서 여과하고 저장하여 소독.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
본 논문은 조직 특이 적, 유도 프로토콜이어서 5- 아자 CR에 과도 짧은 노광, 인슐린 생산 세포에 인간의 피부 섬유 아세포의 변환을 허용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 전사 인자 또는 마이크로 RNA의 강제 표현이나 세포가 더 불안정하고 실수 (14)하는 경향이 있습니다 안정적인 만능 상태의 취득없이, 중배엽에서 내배엽과 관련된 세포로 전환 할 수 있습니다.
첫 번째 단계에서, 세포 가소성 말단 분화 세포에 일시적, 가역적 허용 상태를 유도하는 합성 후생 유전 학적 개질제로 확실히 증가한다. 특히, 5- 아자 - CR은 피부 섬유 아세포의 전체 메틸화의 감소를 야기하기 위해 사용되었다. 5- 아자 CR 직접 메틸 전이 효소의 활성을 억제하고, 새로 합성 된 DNA 메틸화에 새로이를 방지하는 것으로 알려져있다. 때문에 그 효과,이 분자이전 자동 유전자를 활성화 할뿐만 아니라 15,16 진핵 세포의 분화 상태를 변경하는데 사용되어왔다. 이와 일관되게, 전기 -5- 아자 - CR 피부 섬유 아세포를 본 실험에 사용 된 세포 가소성 증가 -5- 아자 - CR 능력을 나타내는 글로벌 DNA 탈 메틸화 (도 2A)를 보였다. 이 5 아자 - CR은 neurosphere 세포 (NSCs의) 17의 높은 소성 관련 마커 10 월 4의 발현을 용이하게 관찰과 일치에 있습니다. 그러나, 그 후 5 아자 - CR 피부 섬유 아세포가 5 아자 - CR의 제거 후 원래의 표현형으로 되돌아주의하는 것이 재미있다. 실제로, 우리는 이전에 섬유 아세포는 높은 소성 상태는 후생 수정에 응답하여, 취득 된 것을 나타내는 원래 배지에 능성 관련 요인 9,10의 다운 조절 발현을 반환했음을 증명, 과도 가역적이고 포함하지 않는다 t의 영구 변형그는 세포.
세포 형태의 표시 변경은 더 높은 소성 상태 (그림 2A)의 유도를 동반. 비 처리 된 섬유 아세포의 전형적인 신장 세포 기관이 분화 된 세포보다 더 작게 나타나 기준 및 증가 된 핵 볼륨을 제시 원형 또는 타원형 세포로 대체 하였다. 니와는 만능 관련 기능 18 설명 편안한 크로 마틴 구조에이 핵 확대를 상관 관계. 액포 핵과 세포질 과립뿐만 아니라 증가 된 패턴 화 된 형태의 존재는 알 수 있었다. 실제적으로 변환 프로토콜의 첫번째 부분을 성공적으로 완료하기위한 마커로 사용할 수있는 기재의 모든 형태 변화; 변경 사항이 존재하는 우리의 경험에서, 5 아자 - CR은 참으로 더 허용 상태를 취득하는 세포를 도왔다.
이 과도 "하이 그 허가를 활용할 수있다완전히 다른 표현형을 향해 셀을 구동하기 sivity 타임 윈도우 ". 의정서 포스트 -5- 아자 - CR 섬유 아세포가 특정 분화 배지에 응답하여, 췌장의 베타 세포와 같은 세포로 다시 어드레싱 될 수 있음을 보여준다.이 프로토콜은 사용 세포가 내배엽 계통에 속하는 세포 집단에 중배엽 유래 세포 유형으로 전환 할 수 있습니다.
미처리 피부 섬유 아세포에서 처음 탐지했다 인슐린, 분화 프로토콜 (도 3B)의 끝에서 양성이었다. 특정 베타 세포 계보 옆의 외분비, 내분비 및 도관 세포 집단 - 이는 췌장 전체의 분화에 관여하는 등 PDX1 같은 다른 요인의 동시 발현을 수반 하였다. 이 베타 세포에 적절한 분화가 미성숙 세포가 인접 해 계층화 된 경우에만 달성되었음을 나타내는 마우스 배아 줄기 세포에 대한 이전의 연구 (ESC)와 일치랑게르한스 아키텍처의 췌장에 의해 제공되는 로컬 마이크로 환경 강한 기능적 역할을한다는 제안 R 내분비 세포 19.
실제로 EpiCC 성숙한 분화 표현형을 달성하고 20 mM의 포도당 노출 (도 3)에 대응하는 능력을 보여 주었다. 인슐린 적극적 인슐린 생산들 (도 3C) 등 EpiCC의 선의 특성을 확인하는 D 글루코오스 자극 1 시간 후에 배양 배지에 분비 하였다.
성공적인 프로 시저에 대한 별개의 요구 조건은 멸균 층류 및 현미경 이들 처리를 포함하여 모든 단계에서 37 ° C에서 세포의 엄격한 유지된다. 우리의 경험에 의하면, 또한 매우 이전에 문화에서의 사용, 갓 시약을 준비하고 프로토콜에 따라 매체 엄격하게 새로 고침하는 것이 좋습니다. 이 동작은 이후 형성 총 세포 현미경으로 수행해야배양 접시의 바닥에서 분리하고 중간을 변경하는 동안 손실 할 수 있습니다.
후성 변환 프로토콜이 성공적으로 인간에 대해 기술 한 동일한 세포 수 / cm (2) 및 탈 메틸 화제의 농도를 이용하여 돼지 종뿐만 아니라 개 (원고 제출)에인가되었다.
결론적으로, 다른 셀 타입으로 피부 섬유 아세포의 전환을 가능하게하는 프로토콜이 여기에 제시된다. 기재된 전략은 성적으로 기반 셀 전환의 이점이있다 : 암을 일으킬 수있는 셀을 남길 수있는 다 능성 상태를 피하기 위해, 즉 가능성; 세포의 느린 변화를 일으킬 수있는 외생 유전 적 요인의 제거. 이러한 장점은 병진 의학 응용 프로그램에 대한 현재의 접근 방식은 매우 유망하고 환자의 특정 세포 치료 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 Carraresi 재단과 당뇨병 연구를위한 유럽 재단 (EFSD)에 의해 투자되었다. GP는 밀라노 대학의 후 문서의 교제에 의해 지원됩니다. 후성 유전학과 Periconception 환경과 BM1308 공유 큰 동물 모델에서 진행 비용 조치 (살람) : 저자는 비용 작업 FA1201 Epiconcept의 구성원입니다. TALB은 비용 조치 CM1406 성적인 화학 생물학 (EPICHEM)의 회원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1 µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
- Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
- Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
- Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
- Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained? Development. 134 (4), 635-646 (2007).
- Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).
