Qui, viene presentato un nuovo metodo che consente la conversione di fibroblasti cutanei adulti in cellule secernenti insulina. Questa tecnica si basa sulla conversione epigenetica, non prevede l'utilizzo di vettori retrovirali né l'acquisizione di uno stato pluripotente stabile. È quindi molto promettente per le applicazioni della medicina traslazionale.
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Articolo metodologico
La conversione epigenetico come un metodo semplice e sicuro per ottenere cellule che secernono insulina da adulti fibroblasti cutanei
In questo articolo
Sommario
Abstract
La medicina rigenerativa richiede nuove cellule completamente funzionali che vengono consegnate ai pazienti per riparare tessuti degenerati o danneggiati. Quando tali cellule non sono prontamente disponibili, possono essere ottenute utilizzando diversi approcci che includono, tra i tanti, la riprogrammazione e la trans-differenziazione, con vantaggi e limiti specifici delle diverse tecniche. Qui viene descritta una nuova strategia per la conversione di un fibroblasto adulto maturo in una cellula secernente insulina, arbitrariamente designata come cellule convertite epigenetiche (EpiCC). Il metodo è stato sviluppato sulla base della crescente comprensione dei meccanismi che controllano la regolazione epigenetica del destino cellulare e del differenziamento. In particolare, la prima fase utilizza un modificatore epigenetico, vale a dire la 5-aza-citidina, per portare le cellule adulte in uno stato "altamente permissivo". Sfrutta quindi questa breve e reversibile finestra di plasticità epigenetica, per reindirizzare le cellule verso un lignaggio diverso. L'approccio è denominato "conversione cellulare epigenetica". È un modo semplice e robusto per ottenere un interruttore di interlinea cellulare efficiente, controllato e stabile. Poiché il protocollo non prevede l'uso di alcuna trasfezione genica, è privo di vettori virali e non comporta uno stato pluripotente stabile, è molto promettente per le applicazioni di medicina traslazionale.
Introduzione
Un obiettivo fondamentale della medicina rigenerativa è la generazione di nuove cellule funzionali che possono essere utilizzati per riparare o sostituire danneggiato, degenerata tessuti. Rifare cellule adulte facilmente disponibili in nuovi, convertendoli da un tipo di cellula all'altra, è un approccio particolarmente interessante, soprattutto quando la popolazione di cellule richiesta non è abbondante o di difficile accesso. Tuttavia, le cellule adulte sono molto stabili. Acquisiscono il loro stato differenziato attraverso una restrizione graduale nelle loro opzioni e, una volta raggiunta la specializzazione terminale maturo, hanno stabilmente conservarlo ....
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Protocollo
Nota: Tutte le procedure descritte di seguito devono essere eseguite sotto cappa a flusso laminare in condizioni sterili. Assicurarsi che tutte le procedure di coltura vengono effettuate sui palchi termostatiche e le cellule vengono mantenute a 37 ° C in tutta la movimentazione.
Isolamento dei fibroblasti della pelle 1.
- Preparare cultura piatto Coating Soluzione
- Sciogliere 0.1 g di gelatina porcina in 100 ml di acqua (concentrazione finale 0,1%). Sterilizzare soluzione con autoclave.
- Aggiungere 1,5 ml di sterile 0,1% di gelatina suina a 35 mm piastre di Petri. Attendere 2 ore a cappotto, mantenendoli a temperatura ambiente.
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Risultati
Istituzione di colture primarie da biopsie cutanee
biopsie cutanee sono stati tagliati in piccoli frammenti e messi in gelatina piatti pre-rivestiti. Dopo 6 giorni, fibroblasti cominciato a crescere fuori dei frammenti di tessuto e ha formato un monostrato di cellule (Figura 1A). Le cellule hanno mostrato una tipica forma allungata e, come previsto, visualizzati un'uniforme immuno-positività per fibroblasto specifico vimentina marcatore (Vim, Figura 1B.......
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Discussione
La presente manoscritto descrive un metodo che permette la conversione dei fibroblasti della pelle umana in cellule che producono insulina, attraverso una esposizione transitoria e breve a 5-aza-CR, seguito da uno specifico protocollo di induzione tessuto. Questo approccio consente il passaggio da mesoderma alle cellule legate endoderma, senza l'espressione forzata di fattori di trascrizione o microRNAs né l'acquisizione di uno stato stabile pluripotenti, che rende le cellule più instabile e soggetto a errori
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Carraresi e Fondazione Europea per lo Studio del Diabete (EFSD). GP è supportato da una borsa di studio post-dottorato dell'Università degli Studi di Milano. Gli autori sono membri del COST FA1201 Epiconcept: ambiente epigenetica e Periconception e l'azione COST BM1308 condivisione avanza su grandi modelli animali (SALAAM). TALB è membro del COST CM1406 epigenetica Chemical Biology (EPICHEM).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Sigma | D5652 | PBS; per il lavaggio cellulare e la preparazione di soluzioni |
| Soluzione antibiotica antimicotica | Sigma | A5955 | Componente di fibroblasti, HP e terreni pancreatici |
| Piastra di Petri da 100 mm | Sarstedt | 83.3902 | Per l'isolamento dei fibroblasti |
| Gelatina suina | Sigma | G1890 | Per il rivestimento delle stoviglie |
| Acqua | Sigma | W3500 | Per la preparazione di soluzioni |
| Piastre di Petri da 35 mm | Sarstedt | 83.39 | Per l'isolamento di fibroblasti |
| DMEM, alto glucosio, piruvato | Life Technologies | 41966052 | Per terreno di coltura di fibroblasti |
| Siero fetale bovino | Life Technologies | 10500064 | FBS; Componente di fibroblasti e mezzi HP |
| Soluzione di L-glutammina | Sigma | G7513 | Componente di fibroblasti, HP e terreni pancreatici |
| Soluzione di tripsina-EDTA | Sigma | T3924 | Per la dissociazione dei fibroblasti |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 CON GRIGLIE | Hycor Biomedical | 87144 | Conteggio delle cellule |
| 5-Azacitidina | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, per cellule increrasi plasticità nei fibroblasti |
| Miscela di nutrienti F-10 di Ham's | Life Technologies | 31550031 | Per HP |
| medio DMEM, basso glucosio, piruvato | Life Technologies | 31885023 | Per HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Componente di HP medium |
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali | Life Technologies | 11140035 | Componente di HP e terreno basale pancreatico |
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma | M7522 | Componente di HP e terreno basale pancreatico |
| Guanosina | Sigma | G6264 | Componente stock della miscela nucleosidica del medio HP |
| Adenosina | Sigma | A4036 | Componente stock della miscela nucleosidica del medio |
| HP Citidina | Sigma | C4654 | Componente stock della miscela nucleosidica del medio HP |
| Uridina | Sigma | U3003 | Componente madre della miscela nucleosidica di HP medio |
| Timidina | Sigma | T1895 | Componente madre della miscela nucleosidica di HP medio |
| Millex-GS 0,22 &; m | Millipore | SLGS033SB | Per la sterilizzazione della soluzione |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Componente dell'HP e del medio basale pancreatico |
| Albumina bovina | Sigma | A3311 | BSA; Componente del terreno basale pancreatico |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | Per il mezzo basale pancreatico |
| Integratore B-27 Meno vitamina A | Life Technologies | 12587010 | Componente del mezzo pancreatico |
| Integratore N-2 Life | Technologies | 17502048 | Componente del mezzo basale pancreatico |
| Activina A Proteina umana ricombinante | Life Technologies | PHG9014 | per il terreno pancreatico |
| Acido retinoico | Sigma | R2625 | Per il mezzo pancreatico |
| Dimetil solfossido | Sigma | D2650 | DMSO; per la preparazione di pasta per acido retinoico |
| Insulin-Transferrina-Selenio | Life Technologies | 41400045 | ITS; per il terreno finale pancreatico |
| Anticorpo anti-Vimentina | Abcam | ab8069 | Per analisi immunocitochimiche. Diluizione di lavoro 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato | Sigma | 32670 | DAPI. Per analisi immunocitochimiche. Diluizione di lavoro 1 µ g/ml |
| 5-metilcitidina | Eurogentec | MMS-900P-B | Per analisi immunocitochimiche. Diluizione di lavoro 1:500 |
| Anti-C Peptide anticorpo | Abcam | ab14181 | Per analisi immunocitochimiche. Diluizione di lavoro 1:100 |
| Anticorpo Anti-PDX1 | Abcam | ab47267 | Per analisi immunocitochimiche. Diluizione di lavoro 1:500 |
| Mercodia Insulina ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | Per il rilevamento del rilascio di insulina |
Riferimenti
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic ....
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Ristampe e permessi
