Articolo metodologico
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La calcificazione vascolare è un importante predittore e contribuisce alle malattie cardiovascolari umane. Questo protocollo descrive i metodi per indurre la calcificazione delle cellule muscolari lisce vascolari primarie in coltura e per quantificare la calcificazione e il carico di macrofagi nelle aorte animali utilizzando l'imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso.
Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità nel mondo. Le placche aterosclerotiche, costituite da macrofagi carichi di lipidi e calcificazioni, si sviluppano nelle arterie coronarie, nella valvola aortica, nell'aorta e nelle arterie dei condotti periferici e sono il segno distintivo delle malattie cardiovascolari. Nell'uomo, l'imaging con tomografia computerizzata consente la quantificazione della calcificazione vascolare; La presenza di calcificazioni vascolari è un forte predittore di futuri eventi cardiovascolari. Lo sviluppo di nuove terapie per le malattie cardiovascolari si basa in modo decisivo sul miglioramento della nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base dell'aterosclerosi. L'avanzamento delle nostre conoscenze sui meccanismi aterosclerotici si basa su modelli murini e cellulari. Qui, viene descritto in dettaglio un metodo per l'imaging della calcificazione aortica e dell'infiltrazione di macrofagi utilizzando due sonde di imaging fluorescenti nel vicino infrarosso spettralmente distinte. L'imaging fluorescente nel vicino infrarosso consente la quantificazione ex vivo della calcificazione e dell'accumulo di macrofagi nell'intera aorta e può essere utilizzato per approfondire la nostra comprensione della relazione meccanicistica tra infiammazione e calcificazione nell'aterosclerosi. Inoltre, viene descritto un metodo per isolare e coltivare cellule muscolari lisce vascolari aortiche animali e un protocollo per indurre la calcificazione in cellule muscolari lisce in coltura da aorte murine o da arterie coronarie umane. Questo metodo in vitro di modellazione della calcificazione vascolare può essere utilizzato per identificare e caratterizzare le vie di segnalazione probabilmente importanti per lo sviluppo della malattia vascolare, nella speranza di scoprire nuovi bersagli per la terapia.
Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morbilità e mortalità nel mondo, compresi gli Stati Uniti dove rappresenta oltre 780.000 morti ogni anno. 1 coronarica calcificazione delle arterie e calcificazione aortica sono le caratteristiche della malattia aterosclerotica e fungono da forti predittori di eventi cardiovascolari. 2- 4 Due tipi principali di calcificazione vascolare sono stati riportati in adulti: calcificazione intimale, associata con l'aterosclerosi, e mediale (noto anche come Mönckeberg) calcificazione, associata a malattia renale cronica e diabete 5 intimale la calcificazione si verifica nel contesto d....
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Tutti gli studi con i topi sono stati eseguiti in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Corpo e tutte le procedure che coinvolgono i topi descritti in questo studio sono stati approvati dalla cura degli animali e Istituzionale Uso comitati del Massachusetts General Hospital (sottocomitato per Animal Care Research). Tutte le procedure sono state eseguite con cura per ridurre al minimo le sofferenze.
1. Preparazione dei reagenti
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Calcificazione aortica in MGP - / - e wild-type topi è stata misurata utilizzando l'imaging di NIR calcio fluorescenza. Nessun segnale NIR calcio è stato rilevato nelle aorte di topi wild-type, che indica l'assenza di calcificazione (figura 2). Un segnale NIR calcio forte è stata rilevata nelle aorte da MGP-carente topo, che è coerente con la calcificazione vascolare avanzata. Le sezioni di tessuto di aorte da wild-type e MGP - / - mice eran.......
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Calcificazione arteriosa è un importante fattore di rischio per le malattie cardiovascolari negli esseri umani e può contribuire direttamente alla patogenesi di eventi cardiovascolari. 1,5,52 deposizione di calcio intimale nei sottili tappi fibrose di malattia aterosclerotica è stato proposto di aumentare lo stress biomeccanico locale e contribuire alla rottura della placca. 53,54 calcificazione impatti mediale risultati clinici, aumentando la rigidità arteriosa, che può indurre l'ipertrofia ca.......
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Il Massachusetts General Hospital ha richiesto brevetti relativi a inibitori di piccole molecole dei recettori BMP di tipo I e all'applicazione di ALK3-Fc per il trattamento dell'aterosclerosi e della calcificazione vascolare, e MD, PBY, KDB e RM possono avere diritto a royalties.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Sarnoff per la Ricerca Cardiovascolare (MFB e TET), dall'Howard Hughes Medical Institute (TM), dal Ladue Memorial Fellowship Award della Harvard Medical School (DKR), dal Programma START della Facoltà di Medicina della RWTH Aachen (MD), dalla Fondazione Tedesca per la Ricerca (DE 1685/1-1, MD), dall'Istituto Nazionale per la Scienza della Scienza (R01EY022746, ESB), dalla Fondazione Leducq (Programma Multidisciplinare per Chiarire il Ruolo della Segnalazione Proteica Morfogenetica Ossea nella patogenesi delle malattie vascolari polmonari e sistemiche, PBY, KDB e DBB), l'Istituto nazionale di artrite e malattie muscolosc....
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubo conico da 15 ml | Falcon | 352096 | |
| ago da 30 G | BD | 305106 | |
| Anticorpo alfa actina muscolare liscia | Sigma | SAB2500963 | |
| Vetrino da camera | Nunc Lab-Tek | 154461 | |
| Collagenasi, Tipo 2 | Worthington | LS004176 | |
| Desametasone | Sigma | D4902 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-084 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium | Gibco | 14190-144 | |
| Elastase | Sigma | E1250 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 16000-044 | |
| Pinze, punta fine | Roboz | RS-4972 | |
| Pincipe, curva completa seghettata | Roboz | RS-5138 | |
| Formalina (10%) | Scienze della microscopia elettronica | 15740 | |
| Soluzione salina bilanciata di Hank | Gibco | 14025-092 | |
| Cellule muscolari lisce dell'arteria coronarica umana | PromoCell | C-12511 | |
| Siringa da insulina con ago | Terumo | SS30M2913 | |
| acido L-ascorbico | Sigma | A-7506 | |
| Forbici a molla per microdissezione (13 mm) | Roboz | RS-5676 | |
| Forbici a molla per microdissezione (3 mm) | Roboz | RS-5610 | |
| NIR, catepsina (ProSense-750EX) | Perkin Elmer | NEV10001EX | |
| NIR, osteogenico (OsteoSense-680EX) | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| soluzione salina normale | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Nucleare veloce rosso | Sigma-Aldrich | N3020 | |
| Odyssey Imaging System | Li-Cor | Odyssey 3.0 | |
| Penicillina/Streptomicina | Corning | 30-001-CI | |
| Nitrato d'argento (5%) | Ricca Chemical Company | 6828-16 | |
| Sodio fosfato bibasico eptaidrato | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| Sodio tiosolfato | Sigma | S-1648 | |
| ß-glicerofosfato sale disodico idrato | Sigma | G9422 | |
| Pallone per coltura tissutale, 25 cm2 | Falcon | 353108 | |
| Coltura tissutale piastra (35 mm x 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| Piastra per coltura tissutale, a sei pozzetti | Falcon | 353046 | |
| Tripsina | Corning | 25-053-CI | |
| Porta roditore per provette | Kent Scientific | RSTR551 | |
| Sistema di filtrazione a vuoto | Millipore | SCGP00525 |
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