Abstract
Trofoblast stamcellen (TSC) ontstaan als gevolg van de eerste Celgedrag in de ontwikkeling van zoogdieren. Ze kunnen in vitro worden gekweekt, het vermogen behouden om te hernieuwen en om te differentiëren in alle subtypen van de trofoblast lijn gelijk aan het in vivo stamcelpopulatie die tot de foetale deel van de placenta. Daarom TSC's bieden een uniek model voor ontwikkeling van de placenta en embryonale versus extra-embryonale Celgedrag in vitro te bestuderen. Vanaf het blastocyst stadium verder, een duidelijke epigenetische barrière die bestaat uit DNA-methylatie en histon modificaties scheidt strak beide geslachten. Hier beschrijven we een protocol om deze lijn barrière volledig overwonnen door transiënte overexpressie van trophoblast belangrijke regulatoren Tfap2c, GATA3, Eomes en ETS2 in muriene embryonale fibroblasten. De geïnduceerde trofoblast stamcellen in staat zijn om zichzelf te vernieuwen en zijn vrijwel identiek aan afgeleide trofoblast stamcellen blastocysten in termen van de morfologie, marker genexpressie en methylatie patroon. Functionele in vitro als in vivo analyses bevestigen dat deze cellen kunnen differentiëren langs de trofoblast lineage genereren polyploïde trofoblast reuzencellen en chimerizing de placenta bij injectie in blastocysten. De inductie van trofoblast stamcellen van somatische weefsels opent nieuwe mogelijkheden voor genetische en epigenetische eigenschappen van deze extra-embryonale afstammingslijn bestuderen en biedt de mogelijkheid om trofoblast stamcellijnen genereren zonder het vernietigen van de respectievelijke embryo.
Introduction
Onlangs heeft een vergelijkende studie van verschillende benaderingen van de muis embryonale stamcellen om stamcellen conversie trofoblast is gebleken dat in alle geanalyseerde systemen, geslacht conversie onvolledig gebleven. In plaats van geïnduceerde trofoblast stamcellen (iTSCs) de zogenaamde trofoblast stamcel-achtige cellen zijn gegenereerd vasthouden van een geheugen van het lot van de cel van oorsprong 1. Hier volgden we een andere benadering van ITSC generatie. Net als bij de directe inductie van pluripotente stamcellen van muizen embryonale fibroblasten (MEF) 2, zijn iTSCs rechtstreeks omgezet van gedifferentieerde somatische weefsel. Ten eerste hebben we geïdentificeerd 12 kandidaat-inducerende factoren TSC lot wanneer overexpressie in MEF. Later zijn de factoren Tfap2c, GATA3, Eomes en ETS2 geïdentificeerd noodzakelijk en voldoende zijn voor de ITSC inductie 3. Tegelijkertijd, een andere groep zelfstandig gevonden Tfap2c, GATA3 en Eomes voldoende om MEF om te zetten in iTSCs te zijn. In datstudie, is de tijd die transgenexpressie aanzienlijk langer in vergelijking met ons onderzoek aangeeft verschillende conversie kinetiek wanneer ETS2 ontbreekt in de transdifferentiatie cocktail 4.
Conventionele foetaal runderserum (FBS) bevattende kweek van geïnduceerde en blastocyst afgeleide trofoblast stamcellen berust op de aanwezigheid van factoren afgescheiden door groei geïnactiveerd MEFs 5,6. Tijdens de ITSC inductie, worden deze elementen door MEF, waarbij de volledige combinatie van transgenen missen en worden transdifferentiatie niet ondergaan. Echter, zodra ITSC individuele kolonies zijn sub-gekweekt, ze vereisen media, die is geconditioneerd door groei geïnactiveerd MEFs. Vanaf dat moment, kan iTSCs gekweekt en behandeld als blastocyst afgeleid TSC's volgens standaard protocollen. Van de nota, in tegenstelling tot Tanaka et al. 5, we regelmatig cultuur TSC's en iTSCs zonder gelatiniseren celkweek gerechten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen experimenten werden uitgevoerd volgens de Duitse wet van de bescherming van dieren en in overeenstemming met de goedkeuring van de lokale institutionele Animal Care commissies (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Noord-Rijnland-Westfalen [goedkeuring ID-nummer: AZ 84-02.04.2013 .A428]).
1. Mediavoorbereiding
- Bereid 293T medium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) FBS, L-glutamine (2 mM), natriumpyruvaat (1 mM), penicilline / streptomycine (1x).
- Bereid MEF medium: DMEM, 10% (v / v) FBS, L-glutamine (2 mM), 1 x niet-essentiële aminozuren, penicilline / streptomycine (1x).
- Bereid TS medium (w / o FGF4 / heparine): Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) 1640, 20% (v / v) FBS (stam celkweekniveau), penicilline / streptomycine (1x), L-glutamine (2 mM ), natriumpyruvaat (1 mM), 2-mercaptoethanol (0,1 mM).
- Bereid TS medium met FGF4 / heparine (TS + F4H): RPMI 1640, 20% (v / v) FBS (stamcelcultuur kwaliteit), penicilline / streptomycine (1x), L-glutamine (2 mM), natriumpyruvaat (1 mM), 2-mercaptoethanol (0,1 mM), 25 ng / ml FGF4, 1 ug / ml heparine.
Noot: FGF4 en heparine toegevoegd direct in het medium onmiddellijk vóór gebruik. - Bereid TS-CM met FGF4 / heparine (TS-CM + F4H): 70%-MEF geconditioneerd TS medium + 30% vers bereide TS medium + 25 ng / ml FGF4, 1 ug / ml heparine.
Noot: FGF4 en heparine toegevoegd direct in het medium onmiddellijk vóór gebruik. - Bereid transfectiemedium: Uitgebreid DMEM, 2% (v / v) FBS (stam celkweekniveau), L-glutamine (2 mM), penicilline / streptomycine (1x).
- Bereid Virus-productiemedium: Uitgebreid DMEM, 5% (v / v) FBS (stam celkweekniveau), L-glutamine (2 mM), penicilline / streptomycine (1x).
2. Muizen Embryonale fibroblast Afleiding
- Set getimede paringen behulp gew 129S2SV vrouwtjes en homozygote mannelijke R26 :: rtTA muizen (stam naam, B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sor TM1 (rtTA* M2) Jae / J 7). Op E13.5 offer muizen door cervicale dislocatie en isoleren primaire muriene embryonale fibroblasten (MEF) volgens standaardprotocollen 8. Daarna plaat cellen uit een embryo op een 150 mm schotel in MEF media.
- Zodra primaire MEF culturen confluentie bereiken op 150 mm schalen, wassen cellen tweemaal met 10 ml PBS en voeg 4 ml 0,05% trypsine / EDTA-oplossing. Incubeer gerechten voor 3-4 min in de incubator bij 37 ° C.
- Na incubatie controleren of cellen losgemaakt van de schaal met behulp van een omgekeerde microscoop (met een 10x lens). Voeg 5 ml van MEF media om trypsine te stoppen en het verzamelen van celsuspensie in een 50 ml conische buis.
- Pool celsuspensie van verschillende gerechten en het verzamelen in een 50 ml conische buis. Centrifugeer celsuspensie gedurende 3 minuten bij 200 xg en 10 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer celpellet in FBS dat 10% (v / v) dimethylsulfoxide. Freeze MEF in porties voor verder gebruik.
Let op: U kunt ook gebruik maken van wilde type primaire MEF; echter een extra lentivirale vector die rtTA moet samen worden getransduceerd met de andere lentivirale vectoren (bijvoorbeeld met de FUdeltaGW-rtTA plasmide beschreven door Maherali et al. 9). - Voorbereiding van de MEF-geconditioneerde TS medium
Opmerking: Voorafgaand aan de conversie experimenten, heeft MEF-geconditioneerd (CM) TS media te worden voorbereid, die nodig is voor de subcultuur van de individuele ITSC lijnen (in hoofdstuk 6 beschreven).- Plaat 1 x 10 7 mitotisch geïnactiveerd MEF per 150 mm schaal in MEF medium van de gewenste aantal gerechten. Inactiveer MEF door γ-straling met een dosis van 9 Gy.
Opmerking: De opbrengst per 150 mm schaal ongeveer 60 ml CM. - De dag na plating, aspireren en gooi MEF medium en voeg 20 ml vers bereide TS medium (zonder FGF4 / heparine) op elke schaal van mitotisch geïnactiveerd MEFs en vaat terug in de incubator bij 37 ° C.
- na incubatieTS medium gedurende drie dagen op mitotisch geïnactiveerd MEFs, laat middelmatige 50 ml conische buizen. Filter medium door een 0,2 um filter en ga verder met 2.6.4. CM vervangen door 20 ml vers medium TS voor de bereiding van een verdere partij CM.
Noot: mitotisch geïnactiveerd MEFs kan voor CM bereiding tot drie keer. - Aliquot 35 ml gefiltreerd CM in 50 ml conische buizen en bewaar bij -20 ° C totdat het nodig is. Na ontdooien, voeg 15 ml vers bereide TS medium om en opslag tot 70% TS-CM verkrijgen bij 4 ° C gedurende maximaal één maand.
- Plaat 1 x 10 7 mitotisch geïnactiveerd MEF per 150 mm schaal in MEF medium van de gewenste aantal gerechten. Inactiveer MEF door γ-straling met een dosis van 9 Gy.
3. Lentivirale Vector Production in 293T-cellen
Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd in het laboratorium de ruimte in licentie gegeven aan Biosafety Level 2 uitgevoerd.
- Voorafgaand aan de conversie experimenten, voor te bereiden lentivirale vectoren voor de doxycycline (DOX) afhankelijke overexpressie van Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2 en mCherry. Voor elk lentivirus, co-transfecteren 293T cellen met behulp van derespectieve lentivirale transfervector samen met een verpakking plasmide en een VSV-G tot expressie enveloppe plasmide (voor plasmide informatie vindt u in de Materials Table).
Opmerking: Voor nuttige informatie met betrekking tot het virus de productie te verwijzen naar Gavrilescu et al. 10. Hoewel het beschrijft retrovirus productie, algemene opmerkingen met betrekking tot de kwaliteit van de 293T-cellen en plasmide-DNA zijn waar voor lentivirus productie ook.
LET OP: Passende veiligheidsmaatregelen moeten worden genomen, bij het werken met lentivirale vectoren en werk moet worden uitgevoerd in een Biosafety Level 2 faciliteit. - Coat vijf 100 mm schalen met poly-L-lysine (100 ug / ml) oplossing voor de schotels met 5 ml oplossing en voorzichtig wiegen coatingoplossing gelijkmatig te verdelen. De schaaltjes terug in de incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Na 30 min aspireren bekledingsoplossing en spoel gerechten eenmaal met PBS.
- Plaat 7 x 10 6 293T-cellen per schaaltje in 10 ml 293T-cel media, swirl gerechten gelijkmatig verdelen cellen en plaats schotels terug in de incubator bij 37 ° C.
- De volgende ochtend, vervang groeimedium met 5 ml transfectie medium. Voeg 6 pi van een voorraad 1000x chloroquine-oplossing (25 mM) en vaat terug in de incubator bij 37 ° C.
- Ondertussen bereiden transfectie mengsel:
- Voor elke lentivirale vector bereiden twee 5 ml reageerbuisjes, aangeduid met A en B.
- Voeg 600 ul van 2x HEPES gebufferde zoutoplossing (HBS) aan de buis A.
- In buis B mix 61,5 gl CaCl2-oplossing (2 M), met 18,5 ug lentivector DNA en 9,25 ug psPAX2 en 9,25 ug pMD2.G. Stel het volume tot 600 ul met steriele cultuur klasse H 2 O.
- Voeg oplossing van buis B druppelsgewijs aan de buis Een tijdje vortexen. Incubeer transfectie mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg transfectie mengsel zeer zorgvuldig druppelsgewijs aan de voorbereide 293T cellen op de 100 mm gerecht. EENN a 5-6 uur verwijderen medium en te vervangen door 10 ml virus-productiemedium. De vaat terug in de incubator bij 37 ° C.
Let op: Wees voorzichtig bij het verwijderen en vervangen van medium sinds 293T-cellen gemakkelijk los te maken van het gerecht. Mediumverversing 5-6 uur na transfectie cruciaal, omdat langdurige blootstelling aan chloroquine is giftig voor de cellen. - De volgende ochtend, verwijder voorzichtig en gooi medium en te vervangen door 7 ml virus-productie medium.
- De volgende morgen de oogst van de eerste partij van virus-bevattend medium. Zuig medium en het verzamelen in een 15 ml conische buis. Nogmaals, 7 ml virus-productiemedium op de cellen. Store virus-bevattend medium in de koelkast tot de tweede partij de volgende dag wordt geoogst.
- De volgende morgen zuigen de tweede partij van virus-bevattend medium toe te voegen aan de 15 ml conische buis met de eerste partij. 293T cellen kunnen nu worden verwijderd. Filter virus-bevattend medium door een 0,45 urn surfactant-free celluloseacetaat -membrane filter. Aliquot gefiltreerd virus-bevattend medium en bewaar bij -80 ° C voor verder gebruik.
Noot: De virusproductie kan ook worden uitgevoerd in 6 putjes. De schaal van volumes en mobiele nummers dienovereenkomstig.
4. fibroblast Transductie met 4 factoren en mCherry Controle Vector
Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd in een Biosafety Level 2 faciliteit uitgevoerd.
- Voor een schematische weergave van de experimentele outline zie figuur 1. Dooi een aliquot van primaire MEFs rtTA-plaat en 3,33 x 10 5 cellen per putje van een 6-putjes in een totaal volume van 2 ml van MEF media. Maak minstens 3 putten en label ze met 4 factoren (4F), mCherry en controle.
Let op: U kunt wild type MEFs worden gebruikt, wanneer een rtTA uitdrukken lentivirale vector op de lentivector cocktail wordt toegevoegd tijdens stap 4.2. - De volgende dag nadat de cellen volledig hersteld van cryopreinstandhouding vervangen MEF media in de drie 6-putjes met 0,6 ml (4F), 0,9 ml (mCherry) en 1 ml (controle) van Transductie media resp. Dooi een hoeveelheid van PLV-tetO-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, ets en -mCherry virus bij kamertemperatuur en voeg 100 ul van elk virus-bevattende supernatant (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) in de 4F ook.
Opmerking: Bij wildtype MEF, afbouwen preplated media door 100 pl en bovendien voeg 100 ul FUdeltaGW-rtTA virus supernatant naar 4F mix. - Voeg 100 ul van mCherry-virus bevattende media aan de goed gelabeld met mCherry. polybreen voegen tot een eindconcentratie van 8 ug / ml in elk putje. Zet de schaal terug in de incubator bij 37 ° C en incubeer MEFs O / N met virus-bevattende supernatans.
Opmerking: In het geval van wild type MEFs, verminderen volume van preplated media met 100 ul en bovendien voeg 100 ul van FUdeltaGW-rtTA-virus bevat supernatant. - De volgende ochtend, verwijder voorzichtigVirus-bevattende media en was drie keer met 2 ml PBS. Tot slot, voeg 2 ml van TS media (zonder FGF4 / heparine).
Opmerking: Getransduceerde MEFs kan direct worden gebruikt voor experimenten ITSC inductie of ingevroren voor verder gebruik.
5. fibroblast om ITSC Conversion
Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd in het laboratorium de ruimte in licentie gegeven aan Biosafety Level 2 uitgevoerd.
- Wassen getransduceerd MEF tweemaal met 2 ml PBS en na toevoeging van 0,5 ml trypsine / EDTA-oplossing te incuberen in de incubator gedurende 3-4 min. Kijk onder een omgekeerde microscoop voor goede losmaking van de cellen.
- Inactiveer trypsine door toevoeging van 1 ml TS medium. Breng de celsuspensie in een 15 ml conische buis en centrifugeer gedurende 3 min bij 200 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 2 ml TS medium. Gebruik de getransduceerde controle monster om de cellen te tellen.
- Plaat 4F-MEF, mCherry-MEF en niet getransduceerde controle MEFs elk bij een dichtheid van 2 x 10 5cellen per 100 mm celkweek schotel in 10 ml TS medium met 2 ug / ml DOX (TS medium + FGF4 / heparine + DOX).
- Als alternatief, het uitvoeren van transdifferentiatie op kleinere gerechten. Plate 3,6 x 10 3 cellen per cm 2 van de gewenste schotel omvang, schaal volume dienovereenkomstig.
- De volgende dag, met een epifluorescentie microscoop (met een 10x lens en een geschikt rode fluorescentie excitatie) bewaken van expressie mCherry eiwit om transductiedoeltreffendheid schatten.
Opmerking: Transductie efficiëntie moeten dicht bij de 100%. Als verhoogde celdood blijkt na transgene inductie betekent dat virustiter te hoog was. Transductie wordt herhaald met verminderde hoeveelheid virus bevattend medium. - Van nu af aan verandering media op alle gerechten om de andere dag tot dag 10 na plating. Daarna voeden cellen met TS medium zonder DOX (TS medium + FGF4 / heparine).
- Onder toepassing van een omgekeerde microscoop monitorverschijning van 'transdifferentiated gebieden' (zie figuur 2B en C) op 4F gerecht voor maximaal 3 weken. Dergelijke kolonies mogen niet zichtbaar op de twee controle gerechten (mCherry-MEF en niet getransduceerde MEF) zijn.
6. Isolatie van individuele ITSC Lines
Opmerking: Voor stap 6.3 een weefselkweek kap is niet vereist. Aanbevolen wordt vegen van de omgekeerde microscoop met 70% ethanol om de kans op bacteriële besmetting te minimaliseren. ITSC individuele kolonies worden geïsoleerd tussen 21 dagen en 28 dagen transdifferentiatie.
- Voeg 40 ul van 0,05% trypsine / EDTA-oplossing in 12 putjes van een 96 U-bodem goed schaal en zet de schaal op het ijs.
- Voordat kolonie isolatie, zuig medium op 4F-MEF transdifferentiatie gerecht. Was de cellen eenmaal met 10 ml PBS. Nogmaals, voeg 10 ml PBS en plaats schotel onder een omgekeerde microscoop.
- Met behulp van een 100-ul pipet ingesteld op 40 ui lift individuele kolonies door circling ze met de pipet tip en het opzuigen van de drijvende kolonie. Overdracht cellen van een kolonie elk in een putje van de bereide 96-putjes. Na het plukken 12 kolonies plaatsen 96-putjes in de incubator bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Dissociëren cellen door en neer te pipetteren meerdere malen en overdracht celsuspensie in een putje van een 24-putjes met voorbereide 500 gl CM TS-medium (30% vers TS medium + 70% + CM FGF4 / heparine).
- De volgende dag vervangen door medium met verse TS-CM medium om dode cellen te verwijderen. Wijzig medium om de andere dag.
- Controleer op verschijnen van kolonies met licht epitheliale grenzen (zie figuur 2). Zodra kolonies verschijnen, cultuur tot 70% confluent of voor maximaal een week en geleidelijk uit te breiden op grotere gerechten. Van nu af aan, kweekcellen als bona fide TSC's, volgens de standaard protocollen in het serum bevattende media of in serumvrij, gedefinieerde media 3,5,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Op de schaal waarin transgenexpressie van het 4F geactiveerd, cellen snel morfologie (vergelijk Figuur 2A en B) veranderen. Rond dag 14-21 transdifferentiated afzonderlijke gebieden ontstaan (twee voorbeelden zijn aangegeven in figuur 2B en C). Deze primaire kolonies missen typische TSC morfologie; maar zodra ze zijn sub-gekweekt, karakteristieke epitheliale morfologie met strakke randen en heldere grenzen sterk doet denken aan bona fide TSC's komt (figuur 2D). 4F-iTSCs vlek positief voor trophoblast transcriptiefactoren Cdx2 en Tfap2c (figuur 2E). Deze ITSC lijnen kunnen nu worden gebruikt voor daaropvolgende in vitro of in vivo analyses, dat wil zeggen in vitro differentiatie assays placenta chimerisatie experimenten.
Figuur 1. Tijdlijn van MEF naar ITSC Conversion. Grafische weergave van transdifferentiatie van MEF in iTSCs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Vertegenwoordiger Veranderingen in morfologie Tijdens MEF te ITSC Conversion.
(A) microfoto van rtTA-MEFs. (B) microfoto van transdifferentiated 4F-MEF. Voorbeeld van een transdifferentiated gebied, rood gemarkeerd. (C) Voorbeeld 2 van een transdifferentiated kolonie op dag 21 van transdifferentiatie na tien dagen dox inductie in 4F-MEFs. Gebied geschikt voor sub-kweken in het rood gemarkeerd. (D) Photomicrograph van 4F-iTSCs na sub-kweken. Alle schaal balken geven 100 urn. Beelden waren taken op een omgekeerde microscoop met een 10x lens en fasecontrast. (E) Immunofluorescentiekleuring tegen de transcriptiefactoren Cdx2 en Tfap2c in 4F-iTSCs. Kernen zijn gekleurd met Hoechst. Schaal balken geven 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De 4-factor (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) op basis transdifferentiatie protocol hier gepresenteerde biedt een betrouwbare methode om trouw te genereren omgezet iTSCs van muis embryonale fibroblasten. Verder is de werkwijze ook toepasbaar voor postnatale staart fibroblasten, maar met een afname van efficiëntie vergeleken met embryonale fibroblasten 3. Over het algemeen kwaliteit van primaire fibroblasten is een kritische factor transdifferentiatie uitkomst en voorzichtigheid is geboden vroege passage cellen (passage 2-3) gebruikt.
De sterkte van dit protocol is het gebruik van doxycycline-induceerbare vectoren, die het mogelijk maken temporele controle van transgenexpressie. Dit maakt het genereren van stabiele ITSC lijnen die de endogene transcriptiefactor activeert netwerk, handhaven TSC lot onafhankelijk van transgenexpressie. Dit in tegenstelling tot eerder gepubliceerde protocollen, waarin de inductie van TSC lot van embryonale stamcellen, een product watt tot op heden slechts levert onvolledig reprogrammed trofoblast stamcel-achtige cellen 1.
Echter, een bekende beperking van de hier beschreven protocol is het variabele aantal opkomende kolonies transdifferentiated, waardoor het moeilijk is de transdifferentiatie efficiëntie voorspellen. Deze beperkingen zijn het gevolg van een aantal zeer variabele factoren die kritisch zijn voor de transdifferentiatie uitkomst zijn: de transductie efficiëntie van de interne lentivirale vectoren, de hoeveelheid van proliferatie van het uitgangsmateriaal celpopulatie en de hoeveelheid celdood bij transdifferentiatie. Onder bepaalde omstandigheden transdifferentiated ITSC kolonies niet te voorschijn te komen. In dit geval en reagentia moeten worden getest op hun vermogen om echte TSC cultuur ondersteunen, voordat zij bij ITSC generatie. Bovendien kan transductie met 4F worden getitreerd, omdat een te hoge hoeveelheden transgenexpressie leiden tot celdood. In het algemeen sub-kweken van individuele ITSC lines vergt enige oefening. Indien moeilijkheden subcultuur iTSCs voorkomen (bijv., Sub-gekweekte cellen niet tot zelfvernieuwing handhaven en plaats spontaan differentiëren), enkele geïsoleerde kolonies kunnen alternatief worden uitgeplaat op schalen met 50% celdichtheid groei geïnactiveerd feeder cellen om de groei en aanhechting van cellen te ondersteunen. De ITSC lijnen kan dan geleidelijk worden gespeend van feeders tijdens de volgende passage. Van de nota, hebben we niet in slagen direct omzetten MEF in iTSCs behulp gedefinieerd TX medium omstandigheden, omdat TX medium alleen ondersteunt gevestigde ITSC / TSC lijnen.
Tot nu toe, is het protocol voor ITSC inductie van fibroblasten alleen vastgesteld voor muizen cellen. Daarom zal het nu van groot belang zijn om deze protocol om andere soorten aan te passen en in te schakelen afleiding van ITSC lijnen uit menselijke of andere modelsystemen. Verder zal analyse van de precieze mechanismen van fibroblast tot omzetting ITSC nieuwe inzichten in de natuur biedenvan de somatische versus extra-embryonale lineage barrière en hulp bij het begrijpen van de beginselen van het lot van de cel bepalen bij normale en pathologische ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
- Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
- Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
- Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
- Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).
