Summary
כתב יד זה מתאר טכניקה רכה המבוסס ליתוגרפיה להנדס מערכים אחידים של תלת ממדי (3D) רקמות אפיתל של גיאומטריה מוגדרת מוקפות תאי מטריקס. שיטה זו ניתנת למגוון רחב של סוגי תאים והקשרים ניסיוניים מאפשרת הקרנת תפוקה גבוהה של משכפל זהה.
Introduction
ההתפתחות של רקמות אפיתל מסועפות, המכונות הסתעפות morphogenesis, מוסדרת על ידי נגזר תאים, פיסיים, וגורמים סביבתיים. בלוטת החלב, הסתעפות morphogenesis הוא תהליך חוזר ונשנה שדרכו מודרך נדידת תאים קולקטיבית יוצרת אדריכלות עץ דמוי. השלב הראשון הוא היווצרות ניצן ראשית ממנהל צינוריות החלב, ואחריו ייזום סניף ואת התארכות 1,2. פלישה של סניפים לתוך stroma שמסביב היא מושרה על ידי השחרור המערכתי של הורמוני סטרואידים בגיל ההתבגרות. ניצנים ראשוניים חדשים ולאחר מכן ליזום מקצות סניפים קיימים, ותהליך זה ממשיך ליצור עץ אפיתל 3. למרות אותות ביוכימיים רבים חשוב זוהו, הבנה מקיפה של מנגנונים ביולוגיים תא המנחים תהליך התפתחותי מורכב זה כרגע חסר. יתר על כן, מחקרים מכניסטית על ההשפעות של רמזים ספציפיים שקשה לפרק מן ההתנסותמפעלי in vivo, פרעות spatiotemporal מדויקות כפי ומדידות הם בדרך כלל לא אפשריים.
תלת ממדי (3D) טכניקות תרבות, כגון תרבות איבר שלמה, organoids העיקרי, ומודלי תרבית תאים, הם כולים שימושיים באופן שיטתי חוקר את מנגנוני רקמת המורפוגנזה 4-6. אלה יכולים להיות שימושיים במיוחד לקביעת ההשפעות של גורמים ספציפיים בנפרד, כגון כוחות מכאניים אותות ביוכימיים, על מגוון רחב של התנהגויות תא, כולל הגירה, שגשוג, והבחנה. 6 דגמי תרבית תאים מהונדסים, בפרט, בקלות לאפשר ההפרעות של תאים בודדים microenvironment שלהם.
מודל תרבות אחת כזו משתמש בגישה מבוססת microfabrication להנדס רקמות אפיתל חלב מודל עם מבנה 3D מבוקר בעקביות reproducibly יוצרות סניפים נודדים קולקטיבי כאשר מושרה עם אגורמי גדילה ppropriate. היתרון העיקרי של המודל הוא היכולת לתפעל בדיוק ולמדוד את ההשפעות של גורמים פיסיים ביוכימיים, כגון דפוסי לחץ מכאני, עם ביטחון סטטיסטי גבוה. טכניקה זו, יחד עם מודלים חישוביים, כבר נעשה שימוש כדי לקבוע את התרומה היחסית של אותות פיזיים ביוכימיים הדרכתו של התפתחות תקינה של רקמות אפיתל החלב epithelia קנים אחרים 7-11. אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לבניית רקמות מודל אלה, אשר יכול להתארך בקלות לסוגים אחרים של תאים תאי מטריקס (ECM) ג'לים, ואשר משמש ככלי פוטנציאל בדיקה של הרפוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת פתרונות
- כדי להכין פתרון 5 מ"ג / מ"ל של אינסולין, לדלל את המניות אינסולין אבקת עם חומצה הידרוכלורית 5 מ"מ (HCl) ב DH 2 O (500 אינסולין מ"ג ב 100 מ"ל ממס). הכן 100 מ"ל ממס על ידי הוספת 50 μl של מרוכז HCl ל -100 מ"ל מים מזוקקים (DH 2 O).
- כדי להפוך את פתרון 1x של PBS, לדלל 10x המלוח שנאגר-פוספט (PBS) פתרון מניות 1X עם DH 2 O בתנאים סטריליים.
- הכן את polydimethylsiloxane (PDMS) אלסטומר פתרון כדלקמן: מערבבים את prepolymer PDMS יחד עם הסוכן ריפוי בתוך 10: 1 (w: w) יחס.
- הכן את המדיום תרבית תאים כדלקמן: עד 500 מ"ל של מדיום הנשר שונה של המניות Dulbecco: תערובת מזין F-12 (DMEM / F-12), להוסיף 10 מ"ל של סרום שור העובר סטרילי (FBS), 500 μl של מגיב גנטמיצין, ו 500 μl של 5 מ"ג / מ"ל אינסולין.
- כדי להכין את אלבומין 1% שור (BSA) בתמיסה 1x PBS, להוסיף 1% (w: פתרון v) של אבקת BSA כדי 1X PBS ומערבבים היטב.
- כדי להכין פתרון 4 מ"ג / מ"ל של סוג שור לנטרל שאני קולגן, להוסיף 50 μl 10x תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) חיץ, 30 μl 0.1 N נתרן הידרוקסידי (NaOH), 30 μl המדיום הסלולרי תרבות, ו -400 μl של קולגן המניות כדי צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge צונן. מערבבים לאט על ידי pipetting למעלה ולמטה; למנוע החדרת בועות. כדי להסיר בועות, בקצרה צנטריפוגות את התערובת על 4 מעלות צלזיוס.
- כן פתרון מקבע על ידי דילול 16% paraformaldehyde 1: 4 (v: v) ב 1x PBS.
- כן פתרון תיוג גרעינים על ידי דילול פתרון תיוג גרעיני מנייה 1: 1,000 (v: v) ב 1x PBS.
- כן מלוח 0.3% פוספט שנאגר והדטרגנטים (PBST) פתרון על ידי ערבוב PBS 1x עם 0.3% (v: v) חומר ניקוי.
- הכן חיץ חסימת ידי דילול עז בסרום 01:10 (v: v) 0.3% PBST.
- כן פתרון נוגדן ראשוני של חלבון מסוים של עניין על ידי דילול הפרימרי נוגדן (למשל, קינאז נגד מוקדי הדבקה ארנב (FAK)) 1: 200 (v: v) בחסימת המאגר.
- הכן פתרון נוגדנים משני על ידי דילול נוגדן פלורסנט מצומדות-בדיקה (למשל, עז נגד ארנב) 1: 1,000 (v: v) בחסימת המאגר.
2. הכנת חותמות אלסטומרי עבור 3D micropatterning
הערה: בולי אלסטומרי נעשים עם PDMS.
- בצע פתרון PDMS באותו יחס כפי שמתואר בשלב 1.3 ומערבבים היטב. מניחים את התערובת בתא ואקום למשך 15-30 דקות כדי להסיר בועות אוויר אשר הוצגו במהלך תהליך ערבוב.
- יוצקים את הפתרון degassed לתוך פלסטיק לשקול סירה או צלחת פטרי המכילה מאסטר סיליקון כי הוא בדוגמת lithographically עם תכונות של הגיאומטריה הרצויה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לרפא פתרון PDMS ב 60 מעלות צלזיוס במשך ~ 12 שעות.
הערה: המאסטרים סיליקון הם להתאמה אישית; פרוטוקול זה משתמש מבנים מלבניים עם ממדים של 50מיקרומטר x 200 מיקרומטר x 50 מיקרומטר במרווחים 200 מיקרומטר. מאסטרי סיליקון יכולים להתבצע באמצעות טכניקות photolithography סטנדרטיות. בקצרה, גידול photoresist מבוסס אפוקסי הוא ספין מצופה על גבי פרוסות סיליקון. מסכה המפרט את התכונות חותמת הרצוי מושם על גבי פרוסות סיליקון מצופה photoresist, אשר נחשף אז לאור UV. התכונות הרצויות לא חוסמות את המסכה נחשפות האור photoresist במקומות אלה הופך crosslinked, והשאר של ציפוי photoresist הוא מסיס וניתן נשטף. - לאחר PDMS ריפא סביב התכונות הרצויות על המאסטר סיליקון, להסיר את PDMS ואדון ממיכל פלסטיק. פרד בזהירות את PDMS מן פרוסות סיליקון ולהסיר PDMS העודף מרחבי התכונות המוטבעות באמצעות סכין גילוח נקי.
- עכשיו לחתוך את PDMS בדוגמת עם תכונות מוטבעות לתוך בולים מלבנים פרט (~ 8 מ"מ x 5 מ"מ) עם סכין גילוח. אחסן תכונה בצד למעלה הללו CLEצלחת פטרי 100 מ"מ קוטר.
- בנוסף לכך, השתמש פתרון PDMS כמתואר בשלב 1.3 לעשות תומך עבור בולים מלבני.
- באמצעות coater ספין, להפיץ ~ 2-3 גרם של הפתרון PDMS באופן שווה על צלחת 100 מ"מ קוטר פטרי לרפא את PDMS עבור ~ 12 שעות ב 60 ° C כמו בשלב 2.1. לאחר מכן, באמצעות סכין גילוח, לחתוך את השכבה הדקה של PDMS למלבנים (~ 5 מ"מ x 2 מ"מ).
הערה: שני תומך נדרש עבור כל חותמת PDMS עשתה צעד 2.3. התומך ניתן לאחסן בצלחת 100 מ"מ קוטר פטרי שמכילה את חותמות PDMS. - לפני הבולים ותומכים PDMS יכולים לשמש תרבית תאים, לעקר על ידי טבילה 70% אתנול ויבש באמצעות aspirator בתוך ארון בטיחות ביולוגי (מכסה מנוע תרבית תאים).
3. הכנת רקמות אפיתל 3D
- בארון בטיחות ביולוגית, להוסיף טיפה של כ 50 μl של BSA 1% ב PBS בראש כל חותמת. מניח את האגל מכוסה בולים ב 4 מעלות צלזיוס למשך תקופה מיניאמא של 4 שעות על מנת להבטיח כי BSA adsorbs אל פני השטח של הבול.
- פתרון BSA לשאוב מן בולי PDMS.
- שטפו את פני השטח של בולים פעמיים עם תרבית תאים בינוניים (50 μl לכל לשטוף לכל חותמת צריך להספיק), aspirating אחרי כל שטיפה.
- טפול בולי PDMS מעוקר תומך באמצעות פינצטה נירוסטה מעוקלת. בארון בטיחות ביולוגי, להוציא אחד 35 מ"מ קוטר צלחת בתרבית רקמה לכל PDMS חותם. בכל צלחת, נשכב שתי תמיכות PDMS מופרדים על ידי מרחק מעט פחות מאורך של בולים PDMS.
- באמצעות פינצטה, לעקר coverslips זכוכית עגול כמו רבים (15 מ"מ קוטר, # 1) כפי שיש בולים PDMS באמצעות אתנול 70%. לשאוב את הנוזלים העודפים coverslips תוך החזקת אותם בפינצטה. אחסן את coverslips שטף בצלחת פטרי 100 מ"מ קוטר נפרדת.
- לוותר ~ 50 μl של תערובת קולגן שווה לצפות את פני השטח של כל PDMS חותמת.
- לאסוףכל PDMS מצופה קולגן להחתים עם פינצטה ו להפוך אותם בעדינות. מנמיכים את הבולים הפוכה על גבי PDMS תומך ערוכים בתרבית רקמה 35 מ"מ קוטר השביעו כך קולגן הוא בין חותמת והחלק התחתון של המנה בתרבית רקמה. דגירת המנות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לוותר ~ 50 μl של תערובת קולגן הנותרים על כל אחד coverslips עגול (מאוחר יותר, אלה יוצבו על גבי רקמות מהונדסות כדי לתמצת אותם לחלוטין קולגן) דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- השג צלחת בתרבית רקמת 100 מ"מ קוטר המכילה תאי אפיתל (לשעבר. EpH4 עכבר חלב תא אפיתל) ב ~ 40% confluency. לשאוב את המדיום תרבית תאים ולשטוף פעם עם 10 מ"ל 1x PBS. הוסף 2 מ"ל של טריפסין אל התאים לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
- הוסף 8 מ"ל של מדיום תרבות טרי כדי בצלחת בתרבית רקמה המכילה תאים trypsinized, ניתוק תאים חסיד הנותרים כל מצלחת. מערבבים בעדינות על ידי pipetting ולהעביר את התערובת לתא צינור צנטריפוגות חרוטי 15 מ"ל ב 100 × גרם במשך 5 דקות.
- לשאוב supernatant מהצינור חרוטי ו resuspend התא גלולה במדיום תרבית תאים. באמצעות hemocytometer, לספור את התאים כדי לקבוע את הריכוז של השעיה. התאם את עוצמת ההשעיה לקבל ריכוז סופי של ~ 10 6 -10 7 תאים / מ"ל.
- הסר את דגימות קולגן בג'ל מן החממה. באמצעות פינצטה, בעדינות להרים את בולי PDMS ישר כלפי מעלה כדי לנתק אותם מן קולגן היצוק וזורק אותן.
- לוותר ~ 30 μl של השעית התא המרוכזת על פני השטח של כל ג'ל המכיל קולגן חללים יצוקים של גיאומטריה רצויה. שים את התאים תחת מיקרוסקופ brightfield עם מטרת NA 10X / 0.25 ואילו צד טלטול המנות בעדינות לצד כדי לקדם תא שיקוע בתוך החללים. החללים צריכים להתמלא בתוך דקות ~ 5.
- כדי rסר תאים עודפים מרחבי החללים, להטות כל מנה בתרבית רקמה על צידו בעדינות לוותר ~ 400 μl תרבית תאים בינוניים על פני השטח של ג'ל קולגן. לשאוב את הנוזל וחזור על לשטוף 1-2 פעמים יותר, לבדוק את ג'ל קולגן מתחת למיקרוסקופ בין כל שטיפה.
- אחרי התאים העודפים נוקו מכל רחבי החללים מלאי תא עובש קולגן, למקם את הכלים בתרבית הרקמה לתוך תרבית תאי חממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, באמצעות פינצטה, בעדינות להפוך את coverslips בכיתה מצופה קולגן ומניח אותם על גבי תבניות קולגן מלאת תא כזה כי קולגן מן coverslips טפסי כובע מעל החללים מלאי תא. דגירת הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- לאחר כמוסות קולגן דבקו עובש קולגן מלא התא, לוותר ~ 2-2.5 מ"ל תא בינוני תרבות באיטיות על coverslip זכוכית על גבי ג'לים. תרבות הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-3 ימים.
הערה:24 שעות לאחר זריעה הראשונית, ניתן לטפל ברקמות האפיתל עם גורמי גדילה כגון גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) או גורם גדילה hepatocyte (HGF) כדי לגרום הסתעפות.
4. Immunofluorescence וניתוח תמונה
- לשאוב את מדיום תרבית תאים מן המנות בתרבית רקמה ולהוסיף פתרון מקבע מספיק כדי לכסות את הג'לים המכיל תא. דגירה מנות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות על שייקר ב 200 סל"ד.
- לשאוב מקבע, למלא את הכלים בתרבית רקמה עם PBS 1x, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות על שייקר ב 200 סל"ד. חזור פעמים עבור שלושה שוטף כולל.
- כדי לתייג גרעינים: לשאוב את PBS מצלחת בתרבית רקמה ולהחליף עם פתרון Hoechst. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15-20 דקות. כדי להכתים עבור FAK או סמן אחר כי ניתן לזהות עם נוגדנים, דלג לשלב 4.5.
- לשאוב את פתרון התיוג הגרעיני ולשטוף את הגרם המכיל תאיםאלס שלוש פעמים עם 1x PBS כמו בשלב 4.2. ניתן לאחסן דגימות ויטראז ב PBS 1x ב 4 ° C עד לשימוש נוסף.
- כדי להכתים עבור החלבון של עניין: לשאוב את PBS מנות בתרבית רקמה, להוסיף 300 μl של 0.3% PBST, דגירה מדגם בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- לשאוב PBS, לכסות את הג'לים עם חסימת חיץ, דגירה על שייקר (200 סל"ד) בטמפרטורת החדר למשך כ -4 שעות.
- לשאוב את חיץ החסימה, לכסות את הג'לים עם פתרון נוגדן ראשוני, דגירה על שייקר ב 200 סל"ד הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- לשאוב את הפתרון נוגדן ראשוני, ולהוסיף פתרון 0.3% PBST, דגירה על שייקר ב 200 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לשאוב PBST וחזור כל 30 דקות במשך 3-4 שעות.
- חזור על שלבי 4.7 ו -4.8, הפעם דוגר עם פתרון הנוגדנים משני. עוטפים את הכלים בתרבית רקמה עם רדיד אלומיניום על מנת למנוע photobleaching של נוגדנים משני. לאחר הפינהלשטוף l, ניתן לאחסן דגימות מוכתמות 1x PBS על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
- כדי להמחיש דוגמאות, להשתמש מטרת NA 10X / 0.30 התמקדה midplane של רקמות אפיתל.
- כדי להמחיש בגרעיני תאים, דגימות קבעו את דימויה שסומנו בסמן גרעיני באמצעות מטרת NA 10X / 0.30 תחת תאורת UV.
- כדי להמחיש דגימות מוכתמות עבור חלבון של עניין, תמונה באמצעות מטרת NA 10X / 0.30 על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
- כדי ליצור מפות תדירות חלבון מכתים של רקמות מרובות (בדרך כלל 50 או יותר) של גיאומטריה ראשונית זהה, היבוא ראשון כל אחד את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה רגילה (ראה חומרים) ולהמיר אותם 8 סיביים בגוונים אפורים.
- כדי סף תמונות אלה, להמיר אותם לפורמט בינארי (כלומר, halftone / שחור ולבן) על ידי הגדרת נקודת חיתוך בגווני אפור; grayscale ערכים מתחת לסף להיות שחורים, ואלה מעל הסף הפכו לבן. ואז, לשלבכל אחת מהתמונות בינארי הבודדות לתוך ערימת תמונה אחת.
- לאחר מכן, לרשום את התמונות המוערמות (כלומר, ליישר או להתאים אותם) בתוכנת הניתוח. חבילות תוכנה לניתוח תמונה רבות מגיעות עם תוסף רישום זמין בחינם.
- השתמש בכל תמונה בערימה כתבנית עבור היישור של התמונה הבאה, כך התמונות בערימה כולו מיושרות על ידי התפשטות. לבסוף, כיסוי (פרויקט) את התמונות בערימת התמונה המיושרת המבוססות על עצמה ממוצעת כדי ליצור תמונה אחת עם מפת תדר פיקסל. תמונה זו אז יכולה להיות בצבעים באמצעות תוכנה לעריכת תמונות של בחירת 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סכמטית כללית של microfabrication רקמות אפיתל חלב
סכימטי כללי של הליך microfabrication מתאר את זרימת העבודה הניסויית מוצג באיור 1. התוצאה הסופית היא מערך של רקמות אפיתל של גיאומטריה זהה וריווח מוטבעים לחלוטין בתוך ג'ל ECM. ניסוי נציג משתמשת בתאי אפיתל החלב עכבר EpH4 בתרבית ג'ל מסוג שור אני קולגן בריכוז של 4 מ"ג / מ"ל. כדי להבטיח את האיכות הגבוהה של רקמות מהונדסות, הטכניקות המתוארות הפרוטוקול צריכים להיות במעקב צמוד. דמויות 2A ולהראות 2B נוף בהגדלה נמוכה וגבוהה של מערכים של בארות מלבניות כי כבר יצוקים לתוך טיפוס שאני קולגן ג'ל לפני זריעת תאים. צורת הבארות נקבעה על ידי הצורה של התכונות על המאסטר סיליקון. חשוב להרים הדואר PDMS עובש היישר מן קולגן כדי לא לעוות את גיאומטרית החלל. איור 2C מציג בארות מלבנות טיפוס שאני קולגן ג'ל כי מולא עם תאי אפיתל חלב (תאים עודפים נשטפו מעל פני השטח של קולגן). בדוגמה זו, היטב כל מלבני 200 מיקרומטר x 50 מיקרומטר מכיל כ 80-100 התאים.
תוספת של גורמי גדילה גורם morphogenesis
24 שעות לאחר הזריעה, הרקמות ניתן לטפל עם גורמי גדילה כגון HGF או EGF ותרבותיים על פני כמה ימים לבנות מודל הסתעפות המורפוגנזה. בדרך כלל, סניפים מתחילים להיווצר מוקדם ככל 4 שעות לאחר גירוי גורם הגדילה. איור 3 א מציג תוצאות נציג מרקמות אפיתל החלב מלבני בתוך טיפוס שאני קולגן ג'ל 24 שעות לאחר ההליך microfabrication, שלאחריו cells דבק קולגן זה לזה. אין סניפים הם נצפו לפני תוספת גורם גדילה. איור 3 ב מציגים רקמה מלבנה נציג שעברה הסתעפות 24 שעות לאחר התוספת של HGF ב 10 ng / ml. במקרה זה, סניפים להתרחש בקצות הרקמות (להבדיל באמצע), שבו התאים לחוות את הלחץ המכני הגבוה ביותר 9. רקמות מרובות של גיאומטריה ראשונית זהה באותו ג'ל ניתן הדמיה מכן כדי לקבוע ממוצעי אוכלוסיית מיקום סניף ואורך סניף, המאפשרים ניתוח תפוקה גבוהה.
מכתים Immunofluorescence לדמיין לוקליזציה חלבון
מכתים immunofluorescence של מערכי רקמות במודל התרבות מאפשר לנו לקבוע לוקליזציה חלבון בתוך רקמה בביטחון סטטיסטי גבוה. איור 4 א מראה repre תוצאות sentative מתוך רקמה מלבני חלב אפיתל הסתעפות המוכתמת עבור קינאז הדבקה מוקדים (FAK). יצירת מפות תדירות רקמות של גיאומטריה זהה יכול לשמש כדי לחזות לוקליזציה מרחבית הממוצע של חלבונים בעלי עניין בתוך הרקמות, אשר ניתן להשוות ל הלוקליזציה של חלבונים אחרים, כמו גם פעילות הסתעפות. איור 4B מראה מפה תדירה FAK מכתים ממוצע עבור 50 רקמות מראות העשרת FAK בקצים הקצרים של רקמות מלבניות, שם הסתעפות מתרחש בדרך כלל.
איור 1. סכמטי המתאר את הליך microfabrication. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
n-page = "1"> 
תמונות איור 2. שצולמו במהלך תהליך microfabrication. (א) נמוך (B) ותמונות שלב בניגוד והגברה גדולות של חללים מלבנים סוג אני קולגן שנוצרו באמצעות עובש PDMS אלסטומרי. (C) חללים מ (א) ו- (ב) מלאים תאי אפיתל חלב. ברי סולם, 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. microfabricated רקמות עוברים הסתעפות morphogenesis. (א) התמונה ניגודיות שלב של microfabrication מלבני רקמת 24 שעות לאחר נציג. (ב) תמונה בניגוד שלב של מחדשרקמת מלבני presentative כי החלה לעבור הסתעפות 24 שעות לאחר תוספת של HGF ב 10 ng / ml. חיצים לבנים מציינים ענפים שהוקמו זה עתה. ברי סולם, 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. מכתים Immunofluorescence של רקמות microfabricated. (א) מכתים Immunofluorescence עבור FAK בתוך רקמות אפיתל החלב לאחר תחילת הסניף. (ב) מפה תדירה מכתים FAK הממוצע ב -50 רקמות. ברי סולם, 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של NIH (HL118532, HL120142, CA187692), דוד & לוסיל פקארד קרן, קמיל & הנרי דרייפוס קרן, ואת בורוז ברוך הבא הקרן. ASP נתמכה בחלקה על ידי מלגת כבוד שרלוט אליזבת פרוקטר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 ml conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1x Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/ml |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
- Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
- Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
- Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
- Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
- Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
- Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).
