Summary
Este manuscrito describe una técnica basada en litografía suave para diseñar matrices uniformes de tres dimensiones (3D) los tejidos epiteliales de la geometría definida rodeadas por matriz extracelular. Este método es susceptible de una amplia variedad de tipos de células y contextos experimentales y permite la selección de alto rendimiento de repeticiones idénticas.
Introduction
El desarrollo de los tejidos epiteliales ramificados, conocidos como la morfogénesis de ramificación, está regulada por factores ambientales, y derivados de células, físicos. En la glándula mamaria, la morfogénesis de ramificación es un proceso iterativo mediante el cual guiada migración celular colectiva crea una arquitectura de árbol. El primer paso es la formación de yemas primaria de los conductos de la leche, seguido de la iniciación y elongación rama de 1,2. La invasión de las ramas en el estroma circundante es inducida por la liberación sistémica de hormonas esteroides en la pubertad. Nuevos brotes primarios inician entonces desde los extremos de las ramas existentes, y este proceso continúa para crear un árbol de 3 epitelial. Aunque muchas señales bioquímicas importantes han sido identificados, una amplia comprensión de los mecanismos celulares biológica que guían este proceso complejo de desarrollo actualmente se carece. Por otra parte, los estudios sobre los mecanismos de las influencias de las señales específicas son difíciles de deconstruir de expementos in vivo, las perturbaciones y las mediciones espaciotemporales como precisas a menudo no son posibles.
(3D) de las técnicas de cultivo en tres dimensiones, como la cultura entera de órganos, organoides primarios, y modelos de cultivo celular, son herramientas útiles para investigar sistemáticamente los mecanismos que subyacen a la morfogénesis de tejidos 4-6. Estos pueden ser particularmente útiles para la determinación de las influencias de los factores específicos de forma individual, como las fuerzas mecánicas y señales bioquímicas, en una variedad de comportamientos celulares, incluyendo la migración, la proliferación y la diferenciación. 6 modelos de cultivo de células de ingeniería, en particular, permite fácilmente la perturbación de las células individuales y su microambiente.
Un tal modelo de cultivo utiliza un enfoque basado en la microfabricación para diseñar tejidos epiteliales mamarias modelo con estructura 3D controlado que consistente y reproducible forman ramas que migran colectivamente cuando se induce con la unafactores de crecimiento apropiadas, con. La principal ventaja de este modelo es la capacidad de manipular y medir los efectos de los factores físicos y bioquímicos, tales como los patrones de tensión mecánica, con alta confianza estadística precisa. Esta técnica, junto con modelado computacional, ya ha sido utilizado para determinar las contribuciones relativas de las señales físicas y bioquímicas en la dirección del desarrollo normal de los tejidos epiteliales mamarias y otros epitelios ramificados 7-11. Se presenta aquí es un protocolo detallado para la construcción de estos tejidos modelo, que pueden ser fácilmente extenderse a otros tipos de células y la matriz extracelular (ECM) geles, y que sirve como una herramienta potencial para la prueba de la terapéutica.
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Protocol
1. Preparación de soluciones
- Para preparar una solución de 5 mg / ml de insulina, se diluye la insulina de stock en polvo con 5 mM de ácido clorhídrico (HCl) en dH 2 O (500 mg de insulina en 100 ml de disolvente). Preparar 100 ml de disolvente mediante la adición de 50 l de HCl concentrado a 100 ml de agua destilada (dH2O).
- Para hacer una solución de PBS 1x de, diluir la solución madre 10x solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 1x con dH2O en condiciones estériles.
- Preparar el (PDMS) de elastómero de polidimetilsiloxano solución de la siguiente manera: mezclar el prepolímero PDMS junto con el agente de curado en una relación de 10:: 1 (w w).
- Preparar el medio de cultivo celular como sigue: a 500 ml de las acciones de Eagle modificado por Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM / F-12), añadir 10 ml de suero bovino fetal estéril (FBS), 500 l de reactivo de gentamicina, y 500 l de 5 mg / ml de insulina.
- Para preparar el 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en solución 1x PBS, añadir 1% (w: V) de BSA en polvo a PBS 1X y mezclar bien.
- Para preparar una solución de 4 mg / ml de tipo bovino neutralizado I colágeno, añadir 50 l de 10x solución salina equilibrada de Hank (HBSS) de tampón, 30 l 0,1 N de hidróxido de sodio (NaOH), medio de cultivo celular 30 l, y 400 l de colágeno de la a un tubo de microcentrífuga refrigerada 1,5 ml. Mezclar lentamente la pipeta hacia arriba y hacia abajo; evitar la introducción de burbujas. Para eliminar las burbujas, centrifugar brevemente la mezcla a 4 ° C.
- Preparar una solución de fijación mediante la dilución de 16% de paraformaldehído 1: 4 (v: v) en 1 x PBS.
- Preparar una solución de etiquetado núcleos por dilución de la solución de etiquetado núcleos de archivo de 1: 1000 (v: v) en 1 x PBS.
- Preparar una solución salina tamponada con fosfato 0,3% y solución de detergente (PBST) mediante la mezcla de 1x PBS con 0,3% (v: v) de detergente.
- Preparar tampón de bloqueo mediante la dilución de suero de cabra 01:10 (v: v) en 0,3% PBST.
- Preparar una solución de anticuerpo primario para una proteína particular de interés mediante la dilución de prianticuerpo mary (por ejemplo, de conejo anti-quinasa de adhesión focal (FAK)) 1: 200 (v: v) en tampón de bloqueo.
- Preparar una solución de anticuerpo secundario por dilución de un anticuerpo conjugado con sonda fluorescente (por ejemplo, cabra anti-conejo) 1: 1000 (v: v) en tampón de bloqueo.
2. Preparación de elastómeros Sellos para Micropatterning 3D
Nota: Los sellos elastoméricos se hacen con PDMS.
- Hacer una solución de PDMS en la misma proporción que en el paso 1.3 y mezclar bien. Colocar la mezcla en una cámara de vacío durante 15-30 minutos para eliminar cualquier burbuja de aire que se introdujeron durante el proceso de mezcla.
- Se vierte la solución desgasificada en un plástico pesan barco o placa de Petri que contiene un maestro de silicio que está modelada por litografía con las características de la geometría deseada. Para obtener los mejores resultados, curar la solución de PDMS a 60 ° C durante ~ 12 h.
Nota: Los maestros de silicio son altamente personalizable; Este protocolo utiliza estructuras rectangulares con dimensiones de 50micras x 200 micras x 50 micras espaciados 200 m de distancia. Los maestros de silicio se pueden hacer utilizando técnicas de fotolitografía estándar. Brevemente, una resina fotosensible a base de epoxi se recubrió por rotación en la parte superior de una oblea de silicio. Una máscara que detalla las características deseadas de sello se coloca en la parte superior de la oblea recubierta de resina fotosensible, que luego se expone a la luz UV. Las características deseadas no bloqueados por la máscara están expuestos a la luz y la fotoprotección en estos lugares se convierte reticulado, mientras que el resto de la capa de resina fotosensible es soluble y se puede lavar. - Después de que el PDMS se ha curado en torno a las características deseadas en el maestro de silicio, retire el PDMS y maestro del recipiente de plástico. separar cuidadosamente los PDMS de la oblea de silicio y eliminar el exceso de PDMS de alrededor de las características impresas utilizando una hoja de afeitar limpia.
- Ahora corte el PDMS con dibujos de características impreso en sellos rectangulares individuales (~ 8 mm x 5 mm) con una hoja de afeitar. Almacenar estas características de lado en un CLEuna placa de 100 mm de diámetro Petri.
- Además, utilizar la solución de PDMS se describe en el paso 1.3 para hacer soportes para los sellos rectangulares.
- Usando una recubridora de rotación, se extendió ~ 2-3 g de la solución de PDMS de manera uniforme en una placa de Petri de 100 mm de diámetro y curar los PDMS de ~ 12 horas a 60 ° C como en el paso 2.1. Entonces, usando una cuchilla de afeitar, cortar la delgada capa de PDMS en rectángulos (~ 5 mm x 2 mm).
Nota: Se necesitan dos soportes para cada sello PDMS realizado en el paso 2.3. Los soportes se pueden almacenar en el plato 100 mm de diámetro Petri que contiene los sellos PDMS. - Antes de que los sellos de PDMS y soportes pueden ser utilizados para el cultivo celular, esterilizar por inmersión en 70% de etanol y se seca utilizando un aspirador en una cabina de bioseguridad (cultivo celular campana).
3. Preparación de 3D epitelial tejidos
- En una cabina de bioseguridad, añadir una gota de aproximadamente 50 l de BSA al 1% en PBS a la parte superior de cada sello. Coloque la gotita sellos cubierta a 4 ° C para una minimadre de 4 h para asegurar que la BSA se adsorbe a la superficie del sello.
- Aspirar la solución de BSA a partir de los sellos de PDMS.
- Lavar las superficies de los sellos dos veces con medio de cultivo celular (50 l por lavado por el sello debe ser suficiente), la aspiración después de cada lavado.
- Manejar las PDMS sellos y apoyos esterilizados utilizando pinzas de acero inoxidable curvas. En una cabina de bioseguridad, disponga de un diámetro de 35 mm placa de cultivo de tejidos para cada sello PDMS. En cada plato, establecer dos soportes PDMS separadas por una distancia ligeramente menor que la longitud de los sellos de PDMS.
- El uso de las pinzas, esterilizar como muchos cubreobjetos de vidrio circular (15 mm de diámetro, # 1), ya que hay PDMS sellos utilizando 70% de etanol. Aspirar el exceso de líquido de los cubreobjetos mientras sostiene con las pinzas. Almacenar los cubreobjetos se lavaron en un 100 mm de diámetro del plato de Petri por separado.
- Dosificar ~ 50 l de la mezcla de colágeno para cubrir uniformemente la superficie de cada PDMS sello.
- Recogercada uno de PDMS colágeno recubiertas de sello con las pinzas y suavemente invierten ellos. Bajar los sellos invertidas en la parte superior de la PDMS apoya presenta en el cultivo de tejidos de 35 mm de diámetro repartió de manera que el colágeno se encuentra entre el sello y la parte inferior de la placa de cultivo de tejidos. Incubar los platos a 37 ° C durante 30 min.
- Dispense ~ 50 l de la mezcla de colágeno que queda en cada uno de los cubreobjetos circulares (más tarde, éstos se colocan en la parte superior de los tejidos de ingeniería para encapsular por completo en el colágeno) y incubarlos a 37 ° C durante 30 min.
- Obtener una placa de cultivo de tejidos de 100 mm de diámetro que contiene células epiteliales (ex. EpH4 ratón células epiteliales mamarias) en ~ 40% de confluencia. Aspirar el medio de cultivo celular y se lava una vez con 10 ml de 1x PBS. Añadir 2 ml de tripsina a las células y se incuba a 37 ° C durante 5 a 10 min.
- Añadir 8 ml de medio de cultivo fresco a la placa de cultivo de tejido que contiene células tratadas con tripsina, separando las células adherentes restantes de la placa. Mezclar suavemente pipeteando y mover la mezcla de células a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 100 xg durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante del tubo cónico y resuspender el sedimento celular en medio de cultivo celular. El uso de un hemocitómetro, contar las células para determinar la concentración de la suspensión. Ajustar el volumen de la suspensión para obtener una concentración final de ~ 10 6 -10 7 células / ml.
- Retire las muestras de colágeno gelificado de la incubadora. Usando las pinzas, levante suavemente los sellos PDMS directamente hacia arriba para separarlas del colágeno moldeado y desecharlos.
- Dispensar ~ 30 l de la suspensión concentrada de células sobre la superficie de cada gel de colágeno que contiene cavidades moldeadas de geometría deseada. Observar las células bajo un microscopio de campo claro con un objetivo de 10X / 0.25 NA mientras se agita suavemente el lado platos a lado para promover la sedimentación celular dentro de las cavidades. Las cavidades deben rellenarse dentro de ~ 5 min.
- para rquítelo exceso de células de alrededor de las cavidades, incline cada placa de cultivo tisular en su lado y suavemente dispensar ~ 400 l de medio de cultivo de células sobre la superficie del gel de colágeno. Aspirar el líquido y repetir el lavado 1-2 veces más, la comprobación de los geles de colágeno bajo el microscopio en entre cada lavado.
- Después las células en exceso se han limpiado de alrededor de las cavidades llenas de células en el molde de colágeno, colocar las placas de cultivo de tejido en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C durante 15 min. Luego, utilizando las pinzas, invertir suavemente el cubreobjetos revestidos con colágeno de clase y colocarlos en la parte superior de los moldes de colágeno llena de células de manera que el colágeno de los cubreobjetos forma una tapa sobre las cavidades llenas por células. Se incuban las muestras a 37 ° C durante 15 min.
- Una vez que las tapas de colágeno se han adherido al molde lleno de colágeno por células, dispensar ~ 2-2,5 ml de medio de cultivo celular lentamente sobre el cubreobjetos de vidrio en la parte superior de los geles. Cultivar las muestras a 37 ° C durante 1-3 días.
Nota:24 horas después de la siembra inicial, los tejidos epiteliales pueden ser tratados con factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) para inducir la ramificación.
4. La inmunofluorescencia y análisis de imágenes
- Aspirar el medio de cultivo celular de las placas de cultivo de tejido y añadir la solución de fijación suficiente para cubrir los geles que contienen células. Incubar los platos a temperatura ambiente durante 15 min en un agitador a 200 rpm.
- Aspirar el fijador, llenar los platos de cultivo de tejidos con 1x PBS, y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min en un agitador a 200 rpm. Repetir dos veces por tres lavados totales.
- Para etiquetar núcleos: Aspirar el PBS de la placa de cultivo de tejidos y reemplazar con una solución de Hoechst. Incubar a temperatura ambiente durante 15-20 min. Para la tinción de FAK u otro marcador que es detectable con anticuerpos, vaya directamente al paso 4.5.
- Aspirar la solución de etiquetado nuclear y lavar la g que contiene célulasels tres veces con 1 x PBS como en el paso 4.2. muestras teñidas se pueden almacenar en 1x PBS a 4 ° C hasta su uso posterior.
- Para la tinción para una proteína de interés: Aspirar el PBS de los platos de cultivo de tejidos, añadir 300 l de 0,3% de PBST, y se incuba la muestra a temperatura ambiente durante 15 min.
- Aspirar el PBS, cubrir los geles con tampón de bloqueo, y se incuba en un agitador (200 rpm) a temperatura ambiente durante ~ 4 hr.
- Aspirar el tampón de bloqueo, cubre los geles con solución de anticuerpo primario, y se incuba en un agitador a 200 rpm durante la noche a 4 ° C.
- Aspirar la solución de anticuerpo primario, añadir solución PBST 0,3%, y se incuba en un agitador a 200 rpm a temperatura ambiente durante 30 min. Aspirar el PBST y repetir cada 30 min durante 3-4 hr.
- Repetir los pasos 4.7 y 4.8, esta vez incubación con la solución de anticuerpo secundario. Envolver las placas de cultivo de tejido con papel de aluminio para evitar photobleaching del anticuerpo secundario. Después de la FINAl de lavado, las muestras teñidas se puede almacenar en 1x PBS a 4 ° C hasta su uso posterior.
- Para visualizar las muestras, utilice un 10x / 0,30 NA objetivo centrado en el plano medio de los tejidos epiteliales.
- Para visualizar los núcleos celulares, muestras de imagen fija etiquetados con un marcador nuclear utilizando un objetivo 10X NA / 0.30 bajo iluminación UV.
- Para visualizar muestras teñidas para una proteína de interés, la imagen usando un objetivo 10x / 0,30 NA en un microscopio de fluorescencia invertido.
- Para crear mapas de frecuencia de tinción de proteínas de múltiples tejidos (típicamente 50 o más) de idéntica geometría inicial, primera importación cada una de las imágenes utilizando el software de análisis de imagen estándar (ver Materiales) y los convierte a escala de grises de 8 bits.
- Para umbral de estas imágenes, los convierte a binario (es decir, medios tonos / negro y blanco) mediante la definición de un punto de corte en escala de grises; Los valores de escala de grises por debajo del umbral se convierten en negro, y aquellos por encima del umbral se convierten en blanco. A continuación, se combinancada una de las imágenes binarias individuales en una sola pila de imagen.
- A continuación, registrar las imágenes apiladas (es decir, alinear o el partido) en el software de análisis. Muchos paquetes de software de análisis de imágenes vienen con un plugin de registro de libre acceso.
- Use cada imagen en una pila como una plantilla para la alineación de la siguiente imagen, de manera que las imágenes de toda la pila están alineados por propagación. Por último, superposición (proyecto) las imágenes de la pila imagen alineada a base de intensidad media para formar una sola imagen con un mapa frecuencia de píxel. Esta imagen puede ser entonces un código de colores utilizando el software de edición de imágenes de elección 10,11.
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Representative Results
Esquemática general de microfabricación tejido epitelial mamaria
Un esquema general del procedimiento de microfabricación esbozar el flujo de trabajo experimental se muestra en la Figura 1. El resultado final es una matriz de los tejidos epiteliales de la geometría idéntica y el espaciamiento que se incrustan completamente dentro de un gel de ECM. Un experimento representativo utiliza células epiteliales mamarias EpH4 de ratón en cultivo en un gel de colágeno bovino tipo I a una concentración de 4 mg / ml. Para asegurar la más alta calidad de los tejidos de ingeniería, las técnicas descritas en el protocolo deben ser vigilados estrechamente. Las figuras 2A y 2B muestran vistas de baja y alta magnificación de matrices de pozos rectangulares que han sido moldeados en un colágeno tipo I gel antes de la siembra de células. La forma de los pozos se determina por la forma de las características en el maestro de silicio. Es importante para levantar THmolde e PDMS hacia arriba desde el colágeno a fin de no distorsionar la geometría de la cavidad. La figura 2C muestra pozos rectangulares en un colágeno de tipo I gel que se han llenado con las células epiteliales mamarias (exceso de células se han lavado de la superficie del colágeno). En este ejemplo, cada 200 micras x 50 micras bien rectangular contiene aproximadamente 80 a 100 células.
La adición de factores de crecimiento induce la morfogénesis
24 horas después de la siembra, los tejidos pueden ser tratados con factores de crecimiento tales como HGF o EGF y cultivadas durante varios días para modelar la morfogénesis de ramificación. Típicamente, ramas comienzan a formarse tan pronto como 4 horas después de la estimulación del factor de crecimiento. La Figura 3A muestra los resultados representativos de los tejidos epiteliales mamarias rectangulares dentro de un gel de colágeno de tipo I de 24 horas después del procedimiento de microfabricación, después de lo cual cells se han adherido al colágeno y de la otra. No hay ramas se observan antes de la adición del factor de crecimiento. La Figura 3B muestra un tejido rectangular representativa que ha sido objeto de ramificación 24 horas después de la adición de HGF a 10 ng / ml. En este caso, las ramas se producen en los extremos de los tejidos (en comparación con el medio), donde las células experimentan la más alta tensión mecánica 9. Múltiples tejidos de idéntica geometría inicial en el mismo gel a continuación se pueden obtener imágenes para determinar promedios de la población de sucursal y longitud de las ramas, que permite el análisis de alto rendimiento.
La tinción de inmunofluorescencia para visualizar la localización de proteínas
La tinción de inmunofluorescencia de los arrays de tejido en el modelo de cultivo nos permite determinar la localización de proteínas dentro de un tejido con alta confianza estadística. Figura 4A muestra represenResultados representativas de un tejido epitelial mamaria rectangular ramificación manchado de la quinasa de adhesión focal (FAK). La creación de mapas de frecuencia de los tejidos de la geometría idéntica se puede utilizar para visualizar la localización espacial media de las proteínas de interés dentro de los tejidos, que se pueden comparar a la localización de otras proteínas así como la actividad de ramificación. La Figura 4B muestra un mapa de la frecuencia de tinción promedio FAK para 50 los tejidos que presenten FAK enriquecimiento en los extremos cortos de los tejidos rectangulares, donde de ramificación se produce normalmente.
Figura 1. Esquema delineando el procedimiento de microfabricación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Las imágenes tomadas durante el proceso de microfabricación. (A) y baja (B) y las imágenes de contraste de fase de magnificación de alta de cavidades rectangulares en colágeno de tipo I creados usando un molde de elastómero PDMS. (C) Las caries a partir de (A) y (B) están llenos de células epiteliales mamarias. Las barras de escala, 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
(A) Imagen de contraste de fases de un representante rectangular de tejido de 24 horas después de la microfabricación Figura 3. microfabricado tejidos se someten a la morfogénesis de ramificación.. Imagen de contraste de fases de una re (B)tejido rectangular presentative que ha comenzado a someterse a la ramificación 24 horas después de la adición de HGF a 10 ng / ml. Las flechas blancas indican las ramas recién formadas. Las barras de escala, 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. La inmunofluorescencia tinción de los tejidos microfabricados. (A) La tinción de inmunofluorescencia para la FAK en un tejido epitelial mamaria después de la iniciación rama. (B) Un mapa frecuencia de tinción promedio de FAK en 50 tejidos. Las barras de escala, 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH (HL118532, HL120142, CA187692), la Fundación David y Lucile Packard, la Fundación Camille y Henry Dreyfus, y el Burroughs Bienvenido Fondo. ASP fue apoyado en parte por una Charlotte Elizabeth Procter honorífico de becas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 ml conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1x Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/ml |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
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