Abstract
culture de cellules animales dans des monocouches est largement utilisé pour étudier divers processus physiologiques et moléculaires. Cependant, cette approche pour étudier les cellules en croissance génère souvent des artefacts indésirables. Par conséquent, la culture de cellules dans un (3D) de l' environnement en trois dimensions, souvent en utilisant des composants de la matrice extracellulaire, est apparue comme une alternative intéressante en raison de sa similitude avec le natif dans un tissu ou un organe in vivo. Nous avons développé un système de culture cellulaire 3D à l' aide de deux compartiments, à savoir : (i) un compartiment central contenant des cellules cancéreuses noyées dans une faisant office de gel de collagène comme une tumeur macrospherical pseudo-primaire et (ii) un compartiment acellulaire périphérique constituée d'un gel de fibrine, soit un composant de la matrice extracellulaire différent de celui utilisé dans le centre, dans lequel les cellules cancéreuses peuvent migrer (invasion avant) et / ou de former des tumeurs microsphériques qui représentent les tumeurs secondaires ou satellites. La formation de tumeurs par satellite dans le compartiment périphérique estremarquablement en corrélation avec l'agressivité connue ou d'origine métastatique des cellules tumorales d'origine, ce qui rend ce système de culture 3D unique. Cette méthode de culture des cellules peut être considérée pour évaluer le cancer invasif et de la motilité des cellules, les interactions cellule-matrice extracellulaire et une méthode pour évaluer les propriétés des médicaments anti-cancéreux.
Introduction
L' étude des caractéristiques fondamentales et biomédicales de l' invasion des cellules cancéreuses / migration et l' établissement de métastases ultérieures est l'objet d'un 1,2 de recherche intense. Métastase est le stade ultime du cancer et de sa prise en charge clinique reste insaisissable. Une meilleure compréhension des métastases aux niveaux cellulaires et moléculaires permettra le développement de thérapies plus efficaces 3.
Plusieurs propriétés des cellules métastatiques peuvent être explorées 4 in vitro , y compris leur stemness et le potentiel d'acquérir un état de transition (par exemple, la transition épithélio-mésenchymateuse) à migrer et à envahir et à l'intérieur de la tumeur primaire 5. Toutefois, l'évaluation in vitro de processus / de métastases d'invasion a été un défi , car il exclut pratiquement la contribution du sang / circulation lymphatique. cultures organotypiques qui intègrent des fragments de tumeur dans des gels de collagène ont Previously été utilisé pour surveiller l'agressivité du cancer. Bien que la complexité des tumeurs est conservée (par exemple, la présence de cellules non cancéreuses), des fragments de tumeur sont exposées à une diffusion moyenne limitée à une variation d'échantillonnage et à une prolifération de cellules stromales 6. Une méthode alternative consiste dans les cellules cancéreuses en croissance au sein des composants de la matrice extracellulaire (ECM), qui imite la (3D) de l'environnement de la cellule à trois dimensions. La prolifération des lignées de cellules de cancer du sein dans un gel de collagène et / ou une matrice de membrane basale dérivé est parmi les exemples les mieux caractérisés de la culture de cellules 3D. En utilisant des milieux de culture cellulaire 3D spécifiques, l'ensemble désorganisé observée pour les cellules cancéreuses du sein cultivées dans des conditions standard peut être inversé pour la formation spontanée d'acini mammaires et des structures tubulaires 7-10. En outre, la formation de sphéroïdes de tumeur multicellulaires dérivées de cellules cancéreuses d'adénocarcinome rassemblés en utilisant différentes techniques (par exemple, la pendaison gouttes, sphéroïdes flottante, agar embedment) constitue désormais la cellule 3D culture test le plus couramment utilisé 11-13. Cependant, cet essai est limité par l'ensemble limité de lignées cellulaires cancéreuses qui peuvent former des sphéroïdes et par la courte période disponible pour étudier les cellules dans ces conditions.
Dans cette technique visualisée, nous ici introduire un dosage de culture cellulaire 3D sophistiqué où les cellules cancéreuses d'intérêt sont incorporés dans un gel de collagène pour permettre la formation in vitro d'une tumeur pseudo-primaire qui peut être alternativement revêtue d'une membrane - matrice dérivée de sous - sol. Une fois formée, la tumeur pseudo-primaire est alors prise en sandwich dans une matrice acellulaire (gel de fibrine dans le cas présent), ce qui permet aux cellules cancéreuses de traverser l'interface entre les deux compartiments de la matrice (voir figure 1). Fait intéressant, des structures ressemblant à des tumeurs secondaires issues de la tumeur pseudo-primaire ainsi que des cellules cancéreuses agressives apparaissent dans leun gel de fibrine. Un tel système de culture 3D offre la flexibilité nécessaire pour enquêter sur , par exemple, les médicaments anticancéreux, expression génique et cellule-cellule et / ou les interactions cellule-ECM 14-16.
Figure 1:.. Vue d' ensemble de la méthode résumé schématique de la méthode pour générer le système de culture cellulaire 3D comme un modèle pour les études sur le cancer S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Protocol
NOTE: Aucune éthique considération car les cellules animales et les cancers humains ont été achetés ou aimablement fournis pour nous.
1. Faire de collagène Plugs (pseudo-tumeur primaire)
- Préparer une dispersion de collagène. Collagène de type I de tendons de queue de rat (RTT) peuvent être soit extraits et stérilisés comme indiqué précédemment 17, ou achetés. Disperser lyophilisé RTT collagène (3,25 à 3,50 mg / ml dans 0,02 N d'acide acétique) en utilisant un mélangeur (réglage haute vitesse; cinq 2 min pistes) pour un mélange uniforme.
- Harvest (trypsine-EDTA, généralement) et utiliser l'exclusion du bleu trypan pour compter les cellules viables en utilisant un hémocytomètre. Ajuster la densité cellulaire désirée (5 x 10 4 cellules par alvéole).
- Préparer toutes les solutions (NaOH, sérum fœtal bovin, DMEM 5x, NaHCO 3) séparément (Tableau 1) dans des conditions stériles et de garder sur la glace réfrigérée. Remarque: L'ordre d'addition des différentes solutions est important pour éviter les chocs osmotiques ou acides dans les cellules.
- Effectuer une dispersion cellulaire (1,25 x 10 6 cellules) dans la solution finale en collagène (5 ml) aussi rapidement que possible. Mélangez bien (par pipetage de haut en bas), tout en évitant les bulles d'air, puis de distribuer rapidement 200 ul de la solution prête à l'emploi dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. frapper doucement la plaque multi-puits sur la surface de la zone de travail de la hotte de culture cellulaire pour éliminer les bulles d'air et de répandre la solution uniformément à l'intérieur des puits.
- Après avoir rempli tous les puits (cette étape prend environ 15-20 minutes par plaque de 96 puits), le stocker dans l'incubateur.
- Incuber la plaque à 37 ° C de 2 heures pour la nuit. Collagène gélification (ie, fibrillogenèse) se produit dans les 30 minutes. Ajouter au milieu de culture (100 ul / puits) à la culture pour effectuer une incubation d'une nuit.
2. Première couche de fibrine Gel
- Préparation de la solution de fibrinogène.
NOTE: Le même lot de gel de fibrine devrait idéalement être utilisé pour resul plus reproductiblets, la formation d'un gel de fibrine comme peut varier entre les différents lots de fibrinogène lyophilisé commercial.- Toujours utiliser une solution de fibrinogène fraîchement préparé. Amener le fibrinogène lyophilisé à température ambiante avant d'ouvrir le flacon afin d'éviter la formation de cristaux d'hydrates.
- Progressivement dissoudre le fibrinogène dans préchauffé (37 ° C) une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec Ca 2+ / Mg 2+ à une concentration de travail de 3 mg / ml (envisager de préparer un excès de 15% du volume final minimum requis : par exemple, 17,25 mg dans 5,75 ml d'une solution 5 ml).
- Ajouter goutte à goutte HBSS préchauffé dans un premier temps pour solubiliser fragments de fibrinogène. Décomposer des fragments plus grands avec une spatule dans le bécher. Agiter le bêcher de temps à autre pour faciliter le mélange. Ne pas utiliser une plaque d'agitateur pendant la procédure. Dissoudre la poudre restante de la suspension par pipetage vers le haut et vers le bas.
- Gardez la solution de fibrinogène tiède tandis steriLIZING la solution en la faisant passer à travers un filtre de 0,22 um. Remarque: Si le HBSS est pas assez chaud ou le fibrinogène pas entièrement dissous, la solution peut obstruer le filtre. Le cas échéant, remplacer le filtre une ou deux fois, ce qui peut diminuer la concentration de fibrinogène, et la rigidité ainsi caillot de fibrine.
- Suspendre les cellules d'intérêt (par exemple, les cellules endothéliales) en solution prête à l' utilisation du fibrinogène tout en ajustant son volume final, comme une procédure alternative.
- Préparation des Solutions thrombine.
- Préparer une solution mère dans ddH 2 O (50 NIH unités / ml), puis le stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um.
- Utiliser un rapport / de la thrombine du fibrinogène ≥1: 0,0075 (v / v) afin de générer le gel de fibrine.
- Génération du gel de fibrine.
- Gardez le fibrinogène et la thrombine stérile des solutions mères sur la glace au cours de toutes les étapes suivantes. Les gels de fibrine peuvent se former dans des plaques à 24 puits.
- e Promptement overlaye surface de chaque puits avec la solution de fibrinogène (200 pl / puits), tout en évitant la formation de bulles d'air. Processus 6 puits à la fois.
- Une fois la solution de fibrinogène recouvre complètement la surface des puits, incliner la plaque à un angle de 45 ° et ajouter 1,5 pi de solution de thrombine dans le premier puits en laissant tomber la thrombine dans le centre du puits, puis agiter doucement la plaque horizontalement pour 1-2 sec.
- Laisser la plaque dans une position stable sous la hotte à flux laminaire (5-10 min) jusqu'à ce que le processus de gélification / coagulation est terminée (NB: le procédé de polymérisation ne doit pas être perturbée, par exemple, en transportant la plaque dans l'incubateur).
- Une fois les six premiers puits ont polymérisé, répéter la même séquence (ie les 3 étapes précédentes) pour les six puits à venir jusqu'à ce que tous les puits ont été traités.
3. Deuxième couche de fibrine Gel et intercalée Collagène plug
- OptionA: (Utilisation du plug Collagène immédiatement).
- Assurez-vous que la première couche de gel de fibrine a polymérisé dans tous les puits en inclinant délicatement la plaque. Placer la plaque à 96 puits contenant du côté des fiches de gel de collagène par côté avec la plaque de 24 puits (contenant les gels de fibrine) pour faciliter le transfert des bouchons de collagène.
- Ajouter une goutte de HBSS dans chaque puits de la plaque contenant les bouchons de collagène.
- Retirez chaque bouchon de collagène du puits avec une aiguille fine montée sur une seringue (utilisé comme une poignée) ou en utilisant un micro-cuillère (voir la vidéo). Transférer chaque bouchon de collagène sur la première couche de gel de fibrine en utilisant un ou deux micro-cuillères, tout en veillant à ce que le bouchon de collagène est bien centré dans le puits et que la stérilité est bien entretenu.
- Recouvrir le gel de fibrine formé au préalable avec la seconde couche de solution de fibrinogène (300 ul / puits) et introduire la thrombine comme décrit au point 2.3, en gardant un minimum. 1: rapport de 0,0075 et une séquence de six puits à une époque </ Li>
- Option B (revêtement Plug collagène avec une couche mince de facteur de croissance réduit la membrane basale (GFRBM)).
- Toutes les solutions et les instruments préparés Refroidir au préalable et de les garder à 4 ° C ou sur de la glace (par exemple, des pipettes, des conseils, des tubes à essai) lors de la manipulation depuis aliquotes congelées de GFRBM sont très sensibles aux taux d'échauffement excessif lors de la décongélation (suivre les instructions du fabricant) .
- Après le retrait des puits de la plaque, faire tremper chaque bouchon de collagène pendant 2 min dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml sur de la glace contenant 100 pi d'une solution de GRFBM pur.
- Transférer chaque bouchon enduit sur la première couche de fibrine, tout en assurant qu'il est bien centré, comme décrit précédemment. Incuber les plaques contenant enfichables à 37 ° C pendant 5 minutes pour permettre à la GRFBM pour former un gel. Ajouter la deuxième couche de fibrine comme dans l'étape 3.1.4.
4. Conditions de culture cellulaire moyen
- Remplir chaque puits avec du milieu de culture (400 ul). Les milieux de culture et les suppléments seront choisis en fonction de la lignée cellulaire et les conditions expérimentales.
- Ajouter l'aprotinine, un antifibrinolytique, un milieu de culture à une concentration finale de 100 unités inhibitrices de la kallikréine (KIU) / ml.
NOTE: Conserver les plaques dans un incubateur de culture cellulaire dans les conditions utilisées pour la lignée cellulaire testée. - Reconstituer cultures avec un milieu frais tous les jours ou selon le programme expérimental, et ajoutez aprotinine. Avant d'ajouter du milieu frais, inclinez légèrement la plaque (à un angle de 30-35 °) et incliner la pipette contre le côté du puits tout en aspirant soigneusement le milieu conditionné sous observation constante.
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Representative Results
Comme mentionné précédemment, une caractéristique intéressante de ce test de culture de cellules 3D est que les cellules cancéreuses ne peuvent pas migrer uniquement du bouchon de collagène dans le gel de fibrine adjacente, mais aussi d' établir des tumeurs secondaires (structures , par exemple, le satellite tumeurs similaires). Ceci peut être observé directement avec un microscope à contraste de phase inversée à des grossissements faibles et élevées à travers l'épaisseur du gel, en particulier avec une longue distance de travail condenseur (figure 2). En utilisant cette méthode de culture cellulaire 3D, le comportement des cellules métastasiques connues peut être aisément comparé à celui observé dans des cellules non métastatiques, comme le montrent de manière répétée avec différentes configurations expérimentales 15. Par exemple, de nombreuses tumeurs satellites sont trouvés dispersés au hasard dans le gel de fibrine avec le métastatique B16F10 de lignée cellulaire , tandis que seulement très peu de tumeurs satellites minuscules peuvent donc être détectés avec son homologue non-métastatique, la lignée cellulaire B16F0 (Figure 2).
Figure 2:. Comportement de souris mélanome B16F10 (A) et (B) B16F0 cellules dans la cellule 3D Système de culture Le B16F10 et cellules B16F0 lignes sont connues pour être métastatique et faiblement métastatique, respectivement. Une vue supérieure du gel composite est montré après 15 jours de culture en plaque de 24 puits. Le bouchon de collagène (*) est adjacente à une couche de gel de fibrine, dans laquelle les cellules ont migré (flèches) et les tumeurs formées par satellite comme on le voit à plus fort grossissement. Très commodément, ces lignées cellulaires expriment un niveau élevé de mélanine qui permet la visualisation directe (sans coloration). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La forme de l'avant et satellite tumeurs de migration peut varier en fonction des caractéristiques de la lignée cellulaire. Par exemple, les cellules mammaires murines 4T07 de carcinome de la glande, qui sont faiblement métastatique , mais sont très invasifs localement, forment un front de migration qui se prolonge radialement dans le gel de fibrine (Figure 3A). Après 14 jours de culture, ces cellules ont tiré loin du front migratoire pour former des structures en forme stellaire ressemblant étroitement à des structures de la glande mammaire (figure 3B-D).
Figure 3: Souris glande mammaire Carcinome cellules 4T07. Ces cellules montrent une forte capacité à migrer dans le gel de fibrine (A). La ligne pointillée délimite le bouchon de collagène et les flèches indiquent la direction du front de migration. Les cellules envahissent uniformément la matrice de fibrine (A), et bien organisés, des structures tubulaires stellaire forme peuvent être observées en 3D (B uned C). Vues sous microscope à contraste de phase. (A - C) et des coupes histologiques colorées par hématoxyline et éosine (D) ne sont montrés S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Les structures cellulaires observés avec ce système de culture en 3D, en particulier les tumeurs du satellite, peuvent être quantifiés par projection plane après coloration des gels avec une solution de bleu de méthylène comme indiqué précédemment 16. La coloration des échantillons de gel avec Hoechst 33258 à différents stades de la culture cellulaire permet de visualiser les noyaux des cellules au microscope inversé à épifluorescence dans le cadre (Figure 4).
Figure 4: Les cellules de cancer du sein hormono-sensible. sein humainCancer MCF-7 cellules ont été exposées à différentes concentrations de tamoxifène. Tumeurs satellites dans des gels de fibrine (rangée supérieure) ont été observées par microscopie à contraste de phase. L'ADN des gels de collagène (indiquant la présence de cellules dans les tumeurs pseudo-primaire) (rangée du bas), a été colorée avec Hoechst 33258 et visualisée en utilisant la microscopie à épifluorescence. Comme prévu, le tamoxifène fragmentation de l' ADN induite par suite de l' apoptose. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Réactifs | Le volume |
| DMEM 5x (pas bicarbonate) Préparer à partir de poudre | 1 ml |
| FBS | 0,5 ml |
| 0,26 M NaHCO3 | 0,5 ml |
| NaOH 1 N | 20 ul |
| ddH2O | 100 ul |
| Conserver cette solution sur la glace | |
| suspension cellulaire | 880 pi |
| Bien mélanger sur la glace et enfin ajouter rapidement: | |
| RTT de collagène (3,5 mg / ml) | 2 ml |
| Volume total | 5 ml |
Tableau 1:. Collagène bouchons réactifs requis et la préparation d'une solution de collagène à 18-19 bouchons. Bien mélanger immédiatement après l'addition du collagène (en inversant le récipient vers le haut et vers le bas), tout en évitant les bulles d'air, et distribuer ensuite rapidement 200 ul à chaque puits.
| Des pas | | Raisons possibles | Solutions | |
| Étape 1. Bouchon de collagène | Des bulles d'air | pipetage Inapproprié * | Bien mélanger, tout en évitant des bulles excessives. |
| Dessinez chaque 200 pi avec le piston de pipette tout chemin vers le bas et relâchez seulement 200 pi (reverse pipetage). * | |||
| bouchon de collagène contraction | bouchon de collagène diminue avec certaines lignées cellulaires, en particulier lors d'une incubation pendant une nuit. | Vérifiez si les cellules induisent la contraction du collagène avant de commencer l'expérience. Il est recommandé de surveiller la contraction pendant quelques jours. Sinon, les bouchons peuvent se contracter dans le gel en sandwich. | |
| Gélification ne se produit pas | Vérifiez réactifs pour la fraîcheur, molarité, pH, etc.); assurez-vous qu'aucun réactif a été omis. | Recommencer du débuttour de batte. | |
| Étape 2. La première couche de gel de fibrine | Des bulles d'air | Mêmes commentaires *; besoin pratique. | Même solution. * Les bulles d'air peut rester dans le gel de fibrine, mais ils disparaissent généralement au fil du temps à 37 ° C. |
| Gélification ne se produit pas | quantité incorrecte de fibrinogène utilisé; vérifier la concentration de thrombine ou de dégradation. | Recommencer du début. | |
| Supposons que la thrombine solution est insuffisante; augmenter légèrement la concentration et / ou le volume de la thrombine (par exemple deux fois). | |||
| phase liquide résiduelle après gélification | solution de fibrinogène et de thrombine pas bien mélangés. | Recommencer du début. | |
| Fibrine ne sont pas homogènes ( par exemple des structures fibrillaires, agglomérats) | La thrombine est mal diffuse dans le gel; exagitation excessive ou insuffisante | Besoin pratique; recommencer depuis le début. | |
| Étape 3. Sandwich couche de fibrine / 2 ème | Mêmes commentaires que dans l'étape 2. | ||
| bouchon de collagène est rapidement (quelques heures) entourées par des zones vides dans la fibrine | Fibrine n'a pas polymérisé suffisamment en contact avec un gel de collagène | Recommencer du début | |
| bouchons de collagène peuvent être progressivement (jours-semaines) entouré par des zones vides dans la fibrine | lyse locale; | Si elle est limitée à quelques endroits autour de la fiche, l'expérience peut continuer. Sinon, envisager de commencer du début. Peut-être en raison de cellules sécrétant quantité excessive de l'activateur du plasminogène. | |
| Ne pas oublier l'agent antifibrinolytique! | |||
| Étape 4 et 5. Cell la culture et le suivi | fibrinolyse | Problème avec l'agent antifibrinolytique (dégradation, dose suboptimale, etc.). | Si grande quantité de tumeurs satellites ou invasion, augmenter la dose d'agent antifibrinolytique. |
| Acidification | la croissance cellulaire excessive. | Changer le milieu de culture cellulaire plus fréquemment. | |
Tableau 2: Dépannage Problèmes possibles et les solutions proposées..
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Discussion
Comme une note technique important, il est essentiel qu'aucun écart est présent à l'interface entre la centrale et les gels périphériques. Dans le cas contraire, il pourrait réduire la capacité des cellules à migrer / envahissent le gel de fibrine. Un espace entre le collagène et les gels de fibrine peuvent se former pendant les 24 premières heures de la culture si la thrombine n'a pas été dilué de manière appropriée. Il est également possible que la lignée cellulaire testée pourrait entraîner le gel de collagène à se contracter au cours de la culture, ce qui provoque un espace relativement important pour former entre les deux gels. Ceci est particulièrement attendu lorsque les cellules stromales sont mélangés dans le gel de collagène ainsi que les cellules cancéreuses en raison de l' activité myofibroblastique comme 18. Afin d'éviter cet artefact, le bouchon de collagène doit être incubé à 37 ° C pendant une période plus longue (≥48 h ) pour induire la contraction du gel avant l'assemblage du sandwich de la fibrine.
Un problème rencontré aussi avec l'essai est la présencediscernable de fibrilles de fibrine ou d'agglomérats. Cela confère un trouble au lieu d'aspect translucide au gel de fibrine, ce qui complique l'interprétation des données en raison de la perturbation des voies de migration de cellules cancéreuses. De tels problèmes peuvent résulter d'une agitation insuffisante ou excessive de la solution de fibrinogène au cours du procédé de polymérisation dans les plaques de culture. Elle peut aussi être due à l'addition incorrecte de la thrombine dans la solution de fibrinogène (étape 2.3). Un gel de fibrine mal formé ou trouble ne peut être fixée une fois solidifié. Collagène ou de fibrine gels peuvent contenir des bulles d'air qui, dans la plupart des cas, seront spontanément libérés après quelques jours dans l'incubateur; néanmoins, pipetage correct, minimise leur apparition. Il est recommandé d'introduire un agent anti-fibrinolytique au début de la période de culture cellulaire. Fibrinolyse peut se produire après une longue période de culture de cellules en raison de l' activité cellulaire et l'activation des enzymes protéolytiques ( par exemple, l' activateur du plasminogène) dans le cbouchon ollagen et les tumeurs du satellite, en fonction des types de cellules cancéreuses et leur agressivité 19 .La libération du bouchon de collagène du gel de fibrine dégradé et l' attachement des cellules au fond des plaques sont deux conséquences de la fibrinolyse excessive (voir la section de dépannage dans le tableau 2). Une limitation de la technique actuelle est l'épaisseur du gel de fibrine, ce qui peut rendre difficile l'observation des cellules à travers tout le gel. Cependant, l'utilisation d'un microscope avec un condenseur à longue distance de travail permet de contourner cette limitation et de surveiller les cellules le long de l'axe Z entier. La microscopie confocale ou intravitale peut également constituer une alternative à visualiser les cellules dans le gel de fibrine.
L'un des objectifs majeurs de développement de ce modèle de culture cellulaire 3D était de fournir un compartiment de la matrice extracellulaire par lequel les cellules cancéreuses sont capables de migrer librement et de se développer. Fibrine a été choisi en raison de sa présence dans les tumeurs,qui doit à augmenter la perméabilité vasculaire induite par l' inflammation, de la nécrose et de l' angiogenèse altérée, et que la fibrine est également connu pour faciliter l' invasion des cellules tumorales 20,21. L'interface entre les deux compartiments présente un grand intérêt car il imite la production d'une nouvelle matrice de support, telles que la fibrine, dans les tumeurs. En outre, la diffusion de l'oxygène et des éléments nutritifs, et à plus long terme, la stabilité du pH, sont peut-être dérégulé dans le compartiment de collagène par rapport au compartiment de fibrine périphérique dans laquelle la diffusion est facilitée. En raison du grand nombre de cellules cancéreuses initialement regroupées dans un bouchon de collagène central, des signes de nécrose / apoptose observés dans la tumeur primaire au cours de la culture, la simulation du phénomène observé lors de l'expansion des tumeurs primaires chez les patients 22. En outre, la formation de tumeurs par satellite est remarquablement liée à l'agressivité des cellules cancéreuses ainsi que leur comportement métastatique. En fonction de la lignée cellulaire et du type of expérience, la période d'incubation nécessaire pour observer les processus métastatiques pertinents peuvent être aussi longtemps que 30 jours. Ce qui est généralement plus longue que pour d' autres essais en 3D, mais le retard supplémentaire apporte l'avantage de l' étude d' un modèle plus représentatif de tumeurs in situ.
Il est bien reconnu que les cellules cultivées dans des modèles de culture 3D montrent des différences dans la signalisation cellulaire et l' expression des gènes par rapport à des cultures de cellules en monocouche 5,23. Cultiver des cellules cancéreuses en 3D affecte également leur sensibilité aux agents chimiothérapeutiques 24-26. Une caractéristique importante et intéressante de ce modèle de culture cellulaire 3D réside dans la possibilité de modifier la concentration de l'ECM, et donc la rigidité du gel, qui peut présenter un intérêt pour les personnes qui travaillent sur les propriétés biomécaniques de la cellule-cellule et cellule-ECM interactions, ainsi que l'effet des propriétés de la matrice sur l' invasion des cellules / migration traite 27. 3D essai de culture cellulaire présenté ici peut adaptered en fonction de différents paramètres et / ou des conditions expérimentales. Par exemple, le dosage peut être adapté pour accueillir des études nécessitant un grand nombre de cellules; en doublant la quantité de matière et le nombre de cellules, prises de collagène peuvent être préparées dans une plaque à 48 puits et on les couche sur un gel de fibrine dans une plaque à 6 puits. D'autre part, il peut être difficile de miniaturiser le système de culture pour les études à haut débit et des mesures en raison de l'homogénéité incohérente du gel de fibrine.
L'introduction de cellules non cancéreuses dans l'un des deux compartiments de gel peut modifier le comportement des cellules cancéreuses. Par exemple, la formation de tumeurs par satellite est exacerbé lorsque le cancer de la prostate , une lignée cellulaire PC3 est mélangée avec des fibroblastes et des cellules endothéliales 14. En variante, des lignées cellulaires marqués par fluorescence peuvent être introduits dans les compartiments de gel pour étudier les interactions cellule-cellule et / ou pour suivre les cellules au cours de la période de culture. En outre, salutsections stological peuvent être préparés après fixation de gel; Cependant, la qualité des résultats d'immunohistochimie d'anticorps peut varier depuis des réactions croisées avec la fibrine peuvent se produire. La coloration des coupes histologiques de routine telles que l' hématoxyline et à l' éosine (H & E) peut révéler l' organisation des cellules à l' intérieur des matrices de gel (Figure 3D).
Il est relativement facile d'enlever le bouchon de collagène du gel de fibrine (par exemple, en tirant sur la fiche avec une pipette en verre). Ainsi, des cellules et des tumeurs par satellite présentes dans le gel de fibrine peuvent être cultivées séparément de ceux qu'on trouve dans le bouchon de collagène. Les cellules provenant des colonies satellites peuvent être récoltées en extrayant les colonies avec des ciseaux chirurgicaux ou un scalpel et les cultiver dans un milieu de culture sans aprotinine à cellules libres du gel de fibrine. Collecte de cellules à partir des différents compartiments du gel composite peut permettre différentes études supplémentaires, y compris l'analyse génétique et d'expression de protéine. Ça peutégalement être utilisés pour isoler des populations de cellules ayant des phénotypes agressives pour plus in vitro ou in vivo. Par exemple, ce modèle de culture en 3D a été utilisé pour identifier les gènes impliqués dans le mélanome métastatique 16. Toutes ces applications représentatives montrent clairement la flexibilité permise par un système de culture cellulaire 3D bi-compartimenté, dans lequel la cellule de co-culture peut être réalisée.
En conclusion, la conception de notre système de culture 3D est flexible et peut offrir de nouvelles avenues pour enquêter sur les événements biologiques et moléculaires au cours de l'apoptose des cellules cancéreuses, la migration et la métastase, ainsi que pour l'évaluation des médicaments anticancéreux.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-dried collagen | Sigma-Aldrich | C7661 | from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14) |
| Fibrinogen (freeze-dried) | Sigma-Aldrich | F8630 | Type I-S, 65 - 85% protein with ≥ 75% of protein is clottable |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356234 | Previously from BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit) |
| Micro-spoons | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 well plate, round base | Sarstedt | 3925500 | |
| 24 well plate | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco's modified Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| Fetal Bovine Serum | VWR | CAA15-701 | FBS, Canadian origin. |
| Trypsin-EDTA | Sigma Chemical, Co. | T4049 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Chemical, Co. | H8264 | HBSS |
References
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- Bill, R., Christofori, G. The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality. FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).
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