Abstract
colture cellulari di mammifero in monostrati è ampiamente usato per studiare i vari processi fisiologici e molecolari. Tuttavia, questo approccio per studiare le cellule in crescita genera spesso artefatti indesiderati. Pertanto, coltura cellulare in un ambiente tridimensionale (3D), spesso utilizzando componenti della matrice extracellulare, emerso come un'alternativa interessante per la sua somiglianza al nativo nel tessuto vivo o organo. Abbiamo sviluppato un sistema di coltura cellulare 3D utilizzando due compartimenti, cioè (i) un vano centrale contenente cellule tumorali annegate in una recitazione gel di collagene come tumore macrospherical pseudo-primaria e (ii) un vano privo di cellule periferiche in un gel di fibrina, cioè un componente della matrice extracellulare diverso da quello utilizzato nel centro, in cui le cellule tumorali può migrare (anteriore invasione) e / o formare tumori microspherical rappresentano tumori secondari o satellitari. La formazione di tumori satellite nel compartimento periferico ènotevolmente correlata all'aggressività noto o l'origine metastatica delle cellule tumorali native, che rende questo sistema di coltura 3D unica. Questo approccio coltura cellulare può essere considerata per valutare invasività cancro delle cellule e la motilità, interazioni cellula-matrice e come un metodo per valutare le proprietà anti-cancro droga.
Introduction
Indagare le caratteristiche fondamentali e biomediche di invasione delle cellule tumorali / migrazione e la successiva creazione di metastasi è oggetto di un intenso lavoro di ricerca 1,2. Metastasi è la fase finale di cancro e la sua gestione clinica resta sfuggente. Una migliore comprensione di metastasi a livello cellulare e molecolare consentirà lo sviluppo di terapie più efficaci 3.
Diverse proprietà di cellule metastatiche possono essere esplorate in vitro 4 compreso il loro stemness e potenziale per acquisire uno stato di transizione (per esempio, epithelioid-mesenchimale transizione) di migrare e invadere all'interno e dal tumore primario 5. Tuttavia, la valutazione in vitro di processi / metastasi invasione è stata una sfida poiché esclude praticamente il contributo del sangue / circolazione linfatica. colture organotipiche che incorporano frammenti di tumore in gel di collagene hanno Precesornione stato utilizzato per monitorare l'aggressività del cancro. Anche se la complessità dei tumori è conservata (ad esempio, la presenza di cellule non cancerose), frammenti di tumore sono esposti a limitata diffusione media, la variazione di campionamento, e ad una crescita eccessiva di cellule stromali 6. Un metodo alternativo consiste nel crescere cellule tumorali all'interno dei componenti della matrice extracellulare (ECM), che imita l'ambiente cellulare tridimensionale (3D). La proliferazione di linee cellulari di cancro al seno in un gel di collagene e / o una matrice membrana basale-derivato è tra gli esempi meglio caratterizzati di coltura cellulare 3D. Utilizzando specifici ambienti di coltura cellulare 3D, il gruppo disorganizzato osservata per le cellule del cancro al seno coltivate in condizioni standard può essere invertito per la formazione spontanea di acini mammaria e strutture tubolari 7-10. Inoltre, la formazione di sferoidi tumorali multicellulari derivate da cellule tumorali adenocarcinoma congregata con tecniche diverse (ad esempio, appeso gocce, sferoidi galleggiante, agar embedment) ora costituisce la coltura delle cellule 3D test più comunemente usato 11-13. Tuttavia, questo test è limitata dal ristretto insieme di linee cellulari tumorali che possono formare sferoidi e dal breve periodo a disposizione per studiare le cellule in queste condizioni.
In questa tecnica visualizzata, abbiamo qui introduciamo un sofisticato test di coltura cellulare 3D in cui le cellule tumorali di interesse sono incorporati in un gel di collagene per consentire la formazione in vitro di un tumore pseudo-primario che può essere alternativamente rivestita con una matrice di membrana derivate interrato. Una volta formato, il tumore pseudo-primaria viene poi inserita in una matrice acellulare (gel di fibrina nel presente caso), che permette alle cellule tumorali di attraversare l'interfaccia tra i due compartimenti matrice (vedi Figura 1). È interessante notare che le strutture di tumore-come secondarie provenienti dal tumore pseudo-primaria con le cellule tumorali aggressive appaiono nelgel di fibrina. Tale sistema di coltura 3D offre la flessibilità necessaria per indagare, ad esempio, farmaci antitumorali, espressione genica e cellula-cellula e / o interazioni cellula-ECM 14-16.
Figura 1:.. Panoramica del metodo di sintesi schematica del metodo per generare il sistema di coltura cellulare 3D come modello per lo studio del cancro Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Protocol
NOTA: Non etica considerazione dal momento che le cellule tumorali umane e animali sono stati acquistati o gentilmente forniti da noi.
1. Fare collagene spine (Pseudo-primaria del tumore)
- Preparare una dispersione di collagene. Collagene di tipo I da tendini coda di topo (RTT) possono essere estratti sia e sterilizzati come riportato in precedenza 17, o acquistati. Disperse collagene liofilizzato RTT (3,25-3,50 mg / ml in 0,02 N acido acetico) utilizzando un miscelatore (impostazione alta velocità; cinque 2 min funzionamenti) per una miscelazione uniforme.
- Harvest (tripsina-EDTA, di solito) e utilizzare esclusione trypan blu per il conteggio delle cellule vitali con un emocitometro. Regolare la densità cellulare desiderato (5 x 10 4 cellule per spina).
- Preparare tutte le soluzioni (NaOH, siero fetale bovino, DMEM 5x, NaHCO 3) separatamente (Tabella 1) in condizioni sterili e mantenere refrigerata in ghiaccio. Nota: L'ordine di aggiunta dei vari soluzioni è importante per evitare shock osmotici o acidi nelle cellule.
- Eseguire dispersione cella (1,25 x 10 6 cellule) nella soluzione di collagene finale (5 ml) più rapidamente possibile. Mescolare bene (pipettando su e giù) evitando bolle d'aria, e quindi distribuire rapidamente 200 microlitri della soluzione pronta all'uso in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. colpire delicatamente la piastra multi-bene sulla superficie della cappa di coltura cellulare di lavoro per rimuovere le bolle d'aria e diffondere uniformemente la soluzione all'interno dei pozzetti.
- Dopo aver riempito fino tutti i pozzetti (questo passaggio richiede circa 15-20 minuti per ogni piastra a 96 pozzetti), memorizzarlo in incubatrice.
- Incubare la piastra a 37 ° C da 2 ore a notte. Il collagene gelificazione (cioè, fibrillogenesi) si verifica entro 30 min. Aggiungere terreno di coltura (100 ul / pozzetto) alla cultura per eseguire una notte di incubazione.
2. Primo strato di fibrina gel
- Fibrinogeno preparazione della soluzione.
NOTA: Lo stesso lotto di gel di fibrina dovrebbe idealmente essere utilizzato per Resul più riproducibilets, formazione di gel di fibrina come può variare tra i diversi lotti di fibrinogeno liofilizzato commerciale.- Usare sempre una soluzione di fibrinogeno preparati al momento. Portare il fibrinogeno liofilizzato a temperatura ambiente prima di aprire il flacone per evitare la formazione di cristalli di idrati.
- Progressivamente sciogliere il fibrinogeno in pre-riscaldato (37 ° C) soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con Ca 2+ / Mg 2+ ad una concentrazione di lavoro di 3 mg / ml (non preparare un eccesso del 15% del volume finale minima necessaria : ad esempio, 17.25 mg a 5,75 ml di soluzione 5 ml).
- Aggiungere pre-riscaldato a gocce HBSS in un primo momento per solubilizzare frammenti di fibrinogeno. Abbattere i frammenti più grandi con una spatola nel bicchiere. Agitare il bicchiere di volta in volta a facilitare la miscelazione. Non usare una piastra di agitatore durante la procedura. Sciogliere la polvere rimanente pipettando sospensione su e giù.
- Conservare la soluzione di fibrinogeno tiepida mentre sterilizing la soluzione passa attraverso un filtro di 0,22 micron. Nota: se il HBSS non è abbastanza caldo o il fibrinogeno non completamente dissolto, la soluzione può intasare il filtro. Se del caso, sostituire il filtro una o due volte, che possono ridurre la concentrazione di fibrinogeno, e la rigidità quindi coagulo di fibrina.
- Sospendere le cellule di interesse (ad esempio, cellule endoteliali) in soluzione di fibrinogeno pronta per l'uso durante la regolazione il volume finale, quale procedura alternativa.
- Preparare le soluzioni di trombina.
- Preparare una soluzione madre in DDH 2 O (50 NIH unità / ml), quindi sterilizzarlo con un filtro 0,22 micron.
- Utilizzare un rapporto / trombina fibrinogeno ≥1: 0,0075 (v / v) per generare il gel di fibrina.
- Generazione del gel di fibrina.
- Tenere il fibrinogeno e trombina sterili soluzioni stock su ghiaccio durante tutte le fasi successive. I gel di fibrina possono formare in piastre da 24 pozzetti.
- Prontamente sovrapposizione °e la superficie di ciascun pozzetto con la soluzione di fibrinogeno (200 pl / pozzetto) evitando la formazione di bolle d'aria. Processo 6 pozzetti alla volta.
- Una volta che la soluzione di fibrinogeno copre completamente la superficie dei pozzetti, inclinare il piatto in un angolo di 45 ° e aggiungere 1,5 ml di soluzione di trombina al primo pozzo facendo cadere la trombina al centro del pozzo, e poi ruotare delicatamente la piastra orizzontale per 1-2 sec.
- Lasciare la piastra in posizione stabile sotto cappa a flusso laminare (5-10 min) fino a quando il processo di gelificazione / coagulazione ha completato (NB: il processo di polimerizzazione non deve essere disturbato, ad esempio, trasportando la piastra alla incubatore).
- Una volta che i primi sei pozzi sono polimerizzati, ripetere la stessa sequenza (cioè i 3 passaggi precedenti) per i prossimi sei pozzi fino a quando tutti i pozzetti sono stati elaborati.
3. secondo strato di fibrina gel e sandwich collagene Plug
- OpzioneA: (Utilizzo del plug collagene immediatamente).
- Assicurarsi che il primo strato di gel di fibrina è polimerizzato in tutti i pozzetti con delicatezza, inclinando la piastra. Posizionare la piastra a 96 pozzetti contenente lato tappi di gel di collagene fianco con piastra da 24 pozzetti (contenente gel di fibrina) per facilitare il trasferimento dei tappi di collagene.
- Aggiungere una goccia di HBSS in ciascun pozzetto della piastra contenente i tappi di collagene.
- Rimuovere ciascun tappo collagene dal pozzo con un ago sottile montato su una siringa (usato come una maniglia) o utilizzando un micro-cucchiaio (vedi video). Trasferire ogni spina collagene sul primo strato di gel di fibrina utilizzando uno o due micro-cucchiai, facendo in modo che il tappo di collagene sia ben centrato nel bene e che la sterilità è ben mantenuto.
- Sovrapporre il gel di fibrina precedentemente formato con il secondo strato di soluzione di fibrinogeno (300 ml / pozzetto) e introdurre la trombina come descritto in 2.3, mantenendo una minima 1:. Rapporto di 0,0075 e una sequenza di sei pozzetti alla volta </ Li>
- Opzione B (rivestimento Plug collagene con un sottile strato di Growth Factor-ridotto membrana basale (GFRBM)).
- Raffreddare tutte le soluzioni preparate e gli strumenti in anticipo e tenerli a 4 ° C o su ghiaccio (ad esempio, pipette, consigli, provette) durante la movimentazione da aliquote congelate di GFRBM sono molto sensibili alla velocità di riscaldamento eccessivo durante lo scongelamento (seguire le istruzioni del produttore) .
- Dopo la rimozione dai pozzetti della piastra, immergere ogni spina collagene per 2 minuti in una provetta da centrifuga da 1,5 ml su ghiaccio contenente 100 ml di una soluzione GRFBM puro.
- Trasferire ciascun tappo rivestito sul primo strato di fibrina assicurando è ben centrata, come descritto in precedenza. Incubare le piastre a innesto contenente a 37 ° C per 5 minuti per consentire la GRFBM per formare un gel. Aggiungere il secondo strato di fibrina come al punto 3.1.4.
4. colture cellulari condizioni medie
- Riempire ogni pozzetto con terreno di coltura (400 ml). I terreni di coltura e supplementi saranno selezionati in base alla linea cellulare e condizioni sperimentali.
- Aggiungere aprotinina, un agente antifibrinolitico, al mezzo di coltura ad una concentrazione finale di 100 unità di inibitore callicreina (KIU) / ml.
NOTA: Conservare le piastre in un incubatore di coltura cellulare nelle condizioni utilizzate per la linea cellulare testato. - Rifornire culture con terreno fresco ogni altro giorno o in base alla pianificazione sperimentale, e aggiungere aprotinina. Prima di aggiungere mezzo fresco, inclinare leggermente la piastra (con un angolo di 30-35 °) e inclinare il pipetta contro il lato del bene mentre accuratamente aspirazione terreno condizionato sotto costante osservazione.
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Representative Results
Come precedentemente accennato, una caratteristica interessante di questo test coltura cellulare 3D è che le cellule tumorali possono non solo migrare dalla spina collagene al gel di fibrina adiacente, ma anche stabilire tumori secondari (strutture ad esempio, satellite tumore-like). Questo può essere direttamente osservata con un microscopio a contrasto di fase invertito a bassi e alti ingrandimenti attraverso lo spessore di gel, in particolare con una distanza di lavoro condensatore (Figura 2). Usando questo metodo di coltura delle cellule 3D, il comportamento delle cellule metastatiche noti può essere facilmente paragonato a quello trovato in cellule non-metastatiche, come dimostrato ripetutamente con vari apparati sperimentali 15. Ad esempio, numerosi tumori satelliti si trovano disperse in modo casuale nel gel di fibrina con il metastatico linea cellulare B16F10 mentre solo pochissimi tumori satellitari piccoli possono così essere rilevati con la sua controparte non metastatico, linea cellulare B16F0 (Figura 2).
Figura 2:. Comportamento di mouse Melanoma B16F10 (A) e B16F0 Cellule (B) nel Cell 3D cultura del sistema Il B16F10 e cellulari B16F0 linee sono noti per essere metastatico e debolmente metastatico, rispettivamente. Un punto di vista superiore del gel composito viene visualizzato dopo 15 giorni di coltura in 24-pozzetti. La spina collagene (*) è adiacente ad uno strato di gel di fibrina in cui le cellule sono migrate (frecce) e formato tumori satellitari come visto a maggiore ingrandimento. Molto convenientemente, queste linee cellulari esprimono un elevato livello di melanina che permette la visualizzazione diretta (cioè senza la colorazione). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
La forma della parte anteriore e satellitari tumori migrazione può variare in funzione di caratteristiche della linea cellulare. Per esempio, le cellule murine 4T07 carcinoma mammario ghiandola, che sono scarsamente metastatico ma sono molto invasivi localmente, formano un fronte di migrazione che si estende radialmente nel gel di fibrina (Figura 3A). Dopo 14 giorni di coltura, le cellule hanno tirato via dal fronte migratorio a formare strutture stellare a forma di molto somiglianti a strutture della ghiandola mammaria (Figura 3B-D).
Figura 3: Mouse ghiandola mammaria carcinoma cellule 4T07. Queste cellule mostrano una forte capacità di migrare nel gel di fibrina (A). La linea tratteggiata delinea la spina collagene e le frecce indicano la direzione del fronte di migrazione. Le cellule in modo uniforme invadono la matrice di fibrina (A), e ben organizzati, strutture tubolari stellare a forma possono essere osservati in 3D (B und C). Vista al microscopio a contrasto di fase. (A - C) e le sezioni istologiche colorate con ematossilina e eosina (D) sono visualizzabili Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Le strutture cellulari osservate con questo sistema di coltura 3D, in particolare i tumori satellitari, possono essere quantificate mediante proiezione planare dopo colorazione del gel con una soluzione di blu di metilene come illustrato in precedenza 16. Colorazione campioni di gel con Hoechst 33258 nelle varie fasi della coltura cellulare permette di visualizzare i nuclei delle cellule sotto epifluorescenza invertita microscopia (Figura 4).
Figura 4: cellule di carcinoma mammario ormono-sensibile. materno umanoCancro cellule MCF-7 sono stati esposti a diverse concentrazioni di Tamoxifene. Tumori satellitari in gel di fibrina (riga superiore) sono stati osservati al microscopio a contrasto di fase. DNA da gel di collagene (che indicano la presenza di cellule nei tumori pseudo-primario) (fila in basso), era macchiato di Hoechst 33258 e osservata con un microscopio a epifluorescenza. Come previsto, il tamoxifene frammentazione del DNA indotta a causa di apoptosi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| reagenti | Volume |
| DMEM 5x (senza bicarbonato) Preparare da polveri | 1 ml |
| FBS | 0,5 ml |
| 0,26 M NaHCO 3 | 0,5 ml |
| 1 N NaOH | 20 microlitri |
| ddH2O | 100 pl |
| Conservare questa soluzione sul ghiaccio | |
| sospensione cellulare | 880 ml |
| Bene mescolare sul ghiaccio e alla fine aggiungere rapidamente: | |
| RTT collagene (3,5 mg / ml) | 2 ml |
| Volume totale | 5 ml |
Tabella 1:. Collagene Spine reagenti necessari e per la preparazione di una soluzione di collagene per 18-19 spine. Mescolare bene subito dopo l'aggiunta del collagene (capovolgendo il contenitore su e giù), evitando bolle d'aria, e poi prontamente distribuire 200 ul per ogni pozzetto.
| passi | | Possibili ragioni | soluzioni | |
| Passo 1. spina collagene | Bolle d'aria | pipettaggio inappropriato * | Mescolare bene evitando bolle eccessive. |
| Disegnare ogni 200 ml con pistone pipetta tutto fino in fondo e rilasciarlo solo 200 pl (reverse pipettaggio). * | |||
| spina collagene contrazione | spina collagene si restringe con alcune linee cellulari, in particolare quando incubate durante la notte. | Controllare se le cellule inducono contrazione del collagene prima di iniziare esperimento. Si raccomanda di monitorare la contrazione in pochi giorni. In caso contrario, le spine possono contrarre nel gel sandwich. | |
| Gelificazione non si verifica | Vedi reagenti per freschezza, molarità, pH, ecc); assicurarsi che nessuno dei reagenti è stato omesso. | Ricominciare da beginning. | |
| Passo 2. Primo strato di gel di fibrina | Bolle d'aria | Stesse osservazioni *; bisogno di pratica. | Stessa soluzione. * Le bolle d'aria può rimanere nel gel di fibrina, ma di solito scompaiono nel corso del tempo a 37 ° C. |
| Gelificazione non si verifica | quantità sbagliata di fibrinogeno utilizzato; controllare la concentrazione di trombina o il degrado. | Inizia di nuovo dall'inizio. | |
| Si supponga che la trombina soluzione è inadeguata; aumentare leggermente la concentrazione e / o il volume della trombina (ad esempio, due volte). | |||
| fase liquida residua dopo gelificazione | soluzione di fibrinogeno e trombina non ben mescolati. | Inizia di nuovo dall'inizio. | |
| La fibrina non è omogenea (cioè strutture fibrillari, agglomerati) | La trombina è adeguatamente diffusa in gel; exagitazione cessiva o insufficiente | Hai bisogno di pratica; ripartire dall'inizio. | |
| Fase 3. Strato di fibrina / 2 ° Sandwich | Stesse commenti come al punto 2. | ||
| spina collagene è rapidamente (poche ore) circondati da aree vuote in fibrina | Fibrina non è polimerizzata sufficientemente in contatto con il gel di collagene | Ricominciate dall'inizio | |
| tappi di collagene possono essere progressivamente (giorni-settimane) circondata da aree vuote in fibrina | lisi locale; | Se si è limitato a un paio di posti in giro per la spina, l'esperimento può andare avanti. Se no, considera cominciare dall'inizio. Potrebbe essere a causa di cellule secernenti quantità eccessiva di plasminogeno. | |
| Non dimenticare l'agente antifibrinolitico! | |||
| Fase 4 e 5. Cell la cultura e follow-up | fibrinolisi | Problema con l'agente antifibrinolitico (degrado, la dose ottimale, ecc.). | Se vasta quantità di tumori satellitari o di invasione, di aumentare la dose di agente antifibrinolitico. |
| acidificazione | L'eccessiva crescita cellulare. | Cambiare mezzo di coltura cellulare più frequentemente. | |
Tabella 2: risoluzione dei problemi possibili e le soluzioni proposte..
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Discussion
Come importante nota tecnica, è essenziale che non gap è presente all'interfaccia tra la centrale ei gel periferici. Altrimenti, si potrebbe ridurre la capacità delle cellule di migrare / invadere il gel di fibrina. Uno spazio tra il collagene e gel di fibrina possono formarsi durante il primo 24 ore di coltura se trombina non è stato opportunamente diluito. È anche possibile che la linea cellulare testato potrebbe portare il gel di collagene per contrarre durante la coltura, causando così uno spazio relativamente grande per formare tra le due gel. Questo è particolarmente previsto quando le cellule stromali sono mescolate nel gel di collagene con le cellule tumorali a causa dell'attività myofibroblastic simile 18. Per evitare questo manufatto, la spina collagene dovrebbe essere incubato a 37 ° C per un periodo più lungo (≥48 hr ) per indurre gel contrazione prima di assemblare il panino fibrina.
Un problema riscontrato anche con il test è la presenzadi discernibile fibrille di fibrina o agglomerati. Questo conferisce una torbida invece di aspetto traslucido al gel di fibrina, che complica l'interpretazione dei dati a causa di perturbazione dei percorsi migratori di cellule di cancro. Tali problemi possono derivare da scuotimento inadeguata o eccessiva della soluzione di fibrinogeno durante il processo di polimerizzazione in piastre di coltura. Può anche essere dovuto alla non corretta aggiunta di trombina nella soluzione di fibrinogeno (passo 2.3). Un gel di fibrina forma non corretta o nuvoloso non può essere risolto una volta solidificato. Collagene o di fibrina gel possono contenere bolle d'aria che, nella maggior parte dei casi, saranno liberati spontaneamente dopo pochi giorni in incubatrice; tuttavia, dispensazione riduce al minimo il loro verificarsi. Si raccomanda di introdurre un agente anti-fibrinolitica all'inizio del periodo di coltura cellulare. Fibrinolisi può verificare dopo un lungo periodo di coltura cellulare a causa di attività cellulare e l'attivazione di enzimi proteolitici (cioè, plasminogeno) all'interno del cspina ollagen e tumori satellitari, a seconda dei tipi di cellule tumorali e la loro aggressività 19 .Il rilascio della spina collagene dal gel di fibrina degradato e l'adesione delle cellule alla parte inferiore delle piastre sono due conseguenze di fibrinolisi eccessiva (vedere la sezione di risoluzione dei problemi nella Tabella 2). Una limitazione della presente tecnica è lo spessore del gel di fibrina, che può rendere difficile osservare cellule attraverso l'intero gel. Tuttavia, l'uso di un microscopio con una lunga distanza di lavoro del condensatore aiuta aggirare questa limitazione e per monitorare celle lungo l'intero asse Z. microscopia confocale o intravitale può anche fornire un'alternativa a visualizzare le cellule nel gel di fibrina.
Uno dei principali obiettivi per lo sviluppo di questo modello di coltura cellulare 3D è stato quello di fornire un vano matrice extracellulare attraverso il quale le cellule tumorali sono in grado di migrare liberamente e svilupparsi. Fibrina è stato scelto a causa della sua presenza nei tumori,che deve ad aumentare la permeabilità vascolare indotta da infiammazione, necrosi e l'angiogenesi alterata, e dal momento che la fibrina è noto anche per facilitare l'invasione delle cellule tumorali 20,21. L'interfaccia tra i due compartimenti presenta molto interesse in quanto imita la produzione di nuova matrice di supporto, come fibrina, nei tumori. Inoltre, ossigeno e nutrienti diffusione, e nel lungo periodo, la stabilità del pH, sono eventualmente disregolato nel vano collagene rispetto al compartimento di fibrina periferica in cui la diffusione è facilitata. A causa del gran numero di cellule tumorali inizialmente aggregate in una spina collagene centrale, segni di necrosi / apoptosi si osservano nel tumore primario durante la coltura, simulando il fenomeno osservato durante l'espansione dei tumori primari in pazienti 22. Inoltre, la formazione di tumori satellitari è notevolmente correlata all'aggressività delle cellule tumorali e il loro comportamento metastatico. A seconda della linea cellulare e il tipo oesperimento f, il periodo di incubazione necessario per osservare relativi processi metastatici possono essere fino a 30 giorni. Questo è di solito più a lungo rispetto ad altri test in 3D, ma il ritardo aggiunto porta il vantaggio di studiare un modello più rappresentativo di tumori in situ.
E 'ben noto che le cellule coltivate in modelli di coltura 3D mostrano differenze nella segnalazione cellulare e l'espressione genica rispetto alle colture cellulari monostrato 5,23. Crescere le cellule tumorali in 3D riguarda anche la loro sensibilità agli agenti chemioterapici 24-26. Una caratteristica importante e interessante di questo modello di coltura cellulare 3D risiede nella possibilità di modificare la concentrazione ECM, e quindi la rigidità del gel, che può essere di interesse per coloro che lavorano sulle proprietà biomeccaniche del cellula-cellula e cellula-ECM interazioni, nonché l'effetto delle proprietà della matrice su invasione delle cellule / migrazione processi 27. Il saggio di coltura cellulare 3D presentato qui può essere adattarsiEd per soddisfare le diverse impostazioni e / o condizioni sperimentali. Per esempio, il dosaggio può essere scalato per ospitare studi che richiedono un gran numero di cellule; raddoppiando la quantità di materiale e il numero di cellule, tappi di collagene possono essere preparati in una piastra a 48 pozzetti e strato su gel di fibrina in una piastra da 6 pozzetti. D'altra parte, può essere difficile miniaturizzare il sistema di coltura per gli studi high throughput e misurazioni a causa di omogeneità incoerente del gel di fibrina.
L'introduzione di cellule non tumorali in uno dei due compartimenti gel può modificare il comportamento delle cellule tumorali. Per esempio, la formazione di tumori satellitari è aggravato quando la linea cellulare PC3 cancro della prostata è mescolato con fibroblasti e cellule endoteliali 14. Alternativamente, linee cellulari fluorescenza marcata possono essere introdotti negli scomparti gel per studiare le interazioni cellula-cellula e / o per monitorare le cellule durante il periodo di coltura. Inoltre, hisezioni stological possono essere preparati dopo la fissazione del gel; Tuttavia, la qualità dei risultati immunoistochimica può variare tra anticorpi poiché possono verificarsi reazioni crociate fibrina. Colorazione di routine delle sezioni istologiche, come con ematossilina e eosina (H & E) può rivelare l'organizzazione delle cellule all'interno delle matrici di gel (Figura 3D).
È relativamente facile rimuovere la spina collagene dal gel di fibrina (ad esempio, estraendo la spina con una pipetta di vetro). Così, cellule e tumori satelliti presenti nel gel di fibrina possono essere coltivate separatamente da quelli che si trovano nella spina collagene. Le cellule delle colonie satelliti possono essere raccolte estraendo le colonie con le forbici chirurgiche o un bisturi e di crescere in terreno di coltura senza aprotinina a celle libere dal gel di fibrina. Raccolta delle cellule dei diversi comparti del gel composito può permettere ulteriori studi diversi, tra cui genica e l'analisi di espressione proteica. Puòanche essere usato per isolare popolazioni di cellule con fenotipi aggressivi per ulteriore in vitro o in vivo. Per esempio, questo modello di coltura 3D è stato utilizzato per identificare geni coinvolti nella metastasi del melanoma 16. Tutte queste applicazioni rappresentativi dimostrano chiaramente la flessibilità consentita da un sistema di coltura cellulare 3D bi-compartimentale in quale cella co-coltura può essere effettuata.
In conclusione, il disegno del nostro sistema di coltura 3D è flessibile e può offrire nuove strade per indagare eventi biologici e molecolari durante apoptosi delle cellule di cancro, la migrazione e metastasi nonché per la valutazione farmaco antitumorale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-dried collagen | Sigma-Aldrich | C7661 | from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14) |
| Fibrinogen (freeze-dried) | Sigma-Aldrich | F8630 | Type I-S, 65 - 85% protein with ≥ 75% of protein is clottable |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356234 | Previously from BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit) |
| Micro-spoons | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 well plate, round base | Sarstedt | 3925500 | |
| 24 well plate | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco's modified Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| Fetal Bovine Serum | VWR | CAA15-701 | FBS, Canadian origin. |
| Trypsin-EDTA | Sigma Chemical, Co. | T4049 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Chemical, Co. | H8264 | HBSS |
References
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv Drug Deliv Rev. , (2016).
- Bill, R., Christofori, G. The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality. FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In Vitro Three-Dimensional (3D) Models in Cancer Research: an Update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a Distance Organ-Specific Metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Sykes, J. A. Separation of Tumor Cells from Fibroblasts. Human Tumor Cells In Vitro. Fogh, J. 1, Chapter 1 1-22 (1975).
- Lang, S. H., Stark, M., Collins, A., Paul, A. B., Stower, M. J., Maitland, N. J. Experimental Prostate Epithelial Morphogenesis in Response to Stroma and Three-Dimensional Matrigel Culture. Cell Growth Differ. 12 (12), 631-640 (2001).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and Oncogenesis of MCF-10A Mammary Epithelial Acini Grown In Three-Dimensional Basement Membrane Cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Shaw, L. M.
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Modeling Dynamic Reciprocity: Engineering Three-Dimensional Culture Models of Breast Architecture, Function, and Neoplastic Transformation. Semin Cancer Biol. 15 (5), 342-352 (2005).
- Hedlund, T. E., Duke, R. C., Miller, G. J. Three-Dimensional Spheroid Cultures of Human Prostate Cancer Cell Lines. Prostate. 41 (3), 154-165 (1999).
- Le, V. M., Lang, M. D., Shi, W. B., Liu, J. W. A Collagen-Based Multicellular Tumor Spheroid Model for Evaluation of the Efficiency of Nanoparticle Drug Delivery. Artif. Cells Nanomed Biotechnol. 15, 1-5 (2014).
- Neto, A. I., et al. A Novel Hanging Spherical Drop System for the Generation of Cellular Spheroids and High Throughput Combinatorial Drug Screening. Biomater Sci. 3 (4), 581-585 (2015).
- Janvier, R., Sourla, A., Koutsilieris, M., Doillon, C. J. Stromal Fibroblasts are Required for PC-3 Human Prostate Cancer Cells to Produce Capillary-like Formation of Endothelial Cells in a Three-dimensional Co-culture System. Anticancer Res. 17 (3A), 1551-1557 (1997).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity. Anticancer Res. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J., Green, M. R. A Genome-Wide shRNA Screen Identifies GAS1 as a Novel Melanoma Metastasis Suppressor Gene. Genes Dev. 22 (21), 2932-2940 (2008).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation Of Ready-To-Use, Storable And Reconstituted Type I Collagen From Rat Tail Tendon For Tissue Engineering Applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2007).
- Horie, M., et al. Characterization of Human Lung Cancer-associated Fibroblasts in Three-dimensional In Vitro Co-culture Model. Biochem Biophys Res Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
- Banyard, J., et al. Identification of Genes Regulating Migration and Invasion Using a New Model of Metastatic Prostate Cancer. BMC Cancer. 30 (14), 387 (2014).
- Palumbo, J. S., Degen, J. L. Fibrinogen and Tumor Cell Metastasis. Haemostasis. 31, Suppl. 1 11-15 (2001).
- Dvorak, H. F. Tumor Stroma, Tumor Blood Vessels, and Antiangiogenesis Therapy. Cancer J. 21 (4), 237-243 (2015).
- Luoto, K. R., Kumareswaran, R., Bristow, R. G. Tumor Hypoxia as a Driving Force in Genetic Instability. Genome Integr. 4 (1), 5 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically Relevant In Vitro Tumor Models for Drug Screening. Drug Discov Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Longati, P., et al. 3D Pancreatic Carcinoma Spheroids Induce a Matrix-rich, Chemoresistant Phenotype Offering a Better Model for Drug Testing. BMC Cancer. 13 (95), (2013).
- Tan, P. H., Chia, S. S., Toh, S. L., Goh, J. C., Nathanm, S. S. Three-dimensional Spatial Configuration of Tumour Cells Confers Resistance to Chemotherapy Independent of Drug Delivery. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Koutsilieris, M., Reyes-Moreno, C., Choki, I., Sourla, A., Doillon, C., Pavlidis, N. Chemotherapy Cytotoxicity of Human MCF-7 and MDA-MB 231 Breast Cancer Cells is Altered by Osteoblast-Derived Growth Factors. Mol Med. 5 (2), 86-97 (1999).
- Lang, N. R., et al. Biphasic Response of Cell Invasion to Matrix Stiffness in Three-Dimensional Biopolymer Networks. Acta Biomater. 13, 61-67 (2015).
