Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

का उपयोग करते हुए एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, बायोफिजिक्स, और कार्यात्मक assays तंत्र शासी टी-सेल कैंसर प्रतिजनों की रिसेप्टर मान्यता निर्धारित करने के लिए

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/54991
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3, 1, 1, 1, 1
1Division of Infection and Immunity and Systems Immunity Research Institute, Cardiff University, 2Department of Oncology, University Hospital of Lausanne (CHUV), 3Ludwig Insitutue for Cancer Research, Lausanne Branch, University of Lausanne
* These authors contributed equally

Introduction

एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी किया गया है, और हो सकता है, ligand रिसेप्टर बातचीत की प्रकृति को समझने के लिए एक अत्यंत शक्तिशाली तकनीक के लिए जारी रहेगा। परमाणु विस्तार में इन मुलाकातों visualizing, न केवल यह संभव कई जैविक प्रक्रियाओं गवर्निंग आणविक तंत्र का खुलासा करने के लिए है, लेकिन यह भी सीधे चिकित्सीय लाभ के लिए संपर्क इंटरफेस को बदलने के लिए संभव है। ऐसी सतह plasmon गूंज और इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति (नाम करने के लिए सिर्फ एक जोड़ी) के रूप में तकनीक के साथ युग्मित, इस तरह के संशोधन तो बंधन आत्मीयता, बातचीत के कैनेटीक्स, और ऊष्मा पर सीधा प्रभाव का आकलन करने के biophysically का विश्लेषण किया जा सकता है। अंत में, प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं पर कार्यात्मक प्रयोगों प्रदर्शन करके, रिसेप्टर ligand बातचीत करने के लिए संशोधन की आणविक और कार्यात्मक प्रभाव की एक विस्तृत चित्र बटोरा जा सकता है, बहुत विशिष्ट यंत्रवत जानकारी प्रदान करते हैं। कुल मिलाकर, तरीकों के इन प्रकार रोकते सक्षम करने के लिए एक परमाणु संकल्प चित्र प्रदान कैसे जैविक प्रणालियों काम करते हैं, निदान और उपचार के अग्रिमों के लिए परिचर प्रभाव के साथ की mination।

हमारी प्रयोगशाला नियमित रूप रिसेप्टर्स कि रोगज़नक़ों और कैंसर के लिए मानव टी सेल प्रतिरक्षा में मध्यस्थता, autoimmunity में अध्ययन करने के लिए इन तकनीकों का उपयोग करता है, और प्रत्यारोपण के दौरान। यहाँ, हम कैंसर के लिए मानव सीडी 8 + टी सेल प्रतिक्रिया, टी सेल रिसेप्टर (TCR) और मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) -restricted ट्यूमर व्युत्पन्न पेप्टाइड्स (Phla) के बीच एक संवाद द्वारा मध्यस्थता पर ध्यान केंद्रित। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि हालांकि सीडी 8 + टी कोशिकाओं के कैंसर की कोशिकाओं को लक्षित कर रहे हैं, हम और दूसरों को पहले से पता चला है कि विरोधी कैंसर TCRs suboptimally उनकी आत्मीय Phla 1, 2 करने के लिए बाध्य है। इस प्रकार, कई प्रयोगशालाओं में परिवर्तन करने का प्रयास किया तो TCR 3, 4, 5 या पेप्टाइड ligand 6,वर्ग = "xref"> 7, 8 आदेश प्रतिरक्षाजनकता को बढ़ाने के लिए और बेहतर लक्ष्य कैंसर की कोशिकाओं को। हालांकि, इन तरीकों हमेशा प्रभावी नहीं हैं और बंद लक्ष्य विषाक्तता 4, 9, 10 सहित गंभीर साइड इफेक्ट, हो सकता है। इसके अलावा अनुसंधान आणविक तंत्र है कि कैंसर एंटीजन की टी-सेल मान्यता शासन की खोज के इन खामियों को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण होगा।

वर्तमान अध्ययन में, हम ग्लाइकोप्रोटीन 100 (gp100) सीडी 8 + टी कोशिकाओं भेदभाव मेलानोसाईट प्रतिजन का एक टुकड़ा के लिए विशिष्ट द्वारा ऑटोलॉगस मेलेनोमा कोशिकाओं के खिलाफ प्रतिक्रियाएं, gp100 280-288, द्वारा एचएलए-ए * 0201 (सबसे अधिक प्रस्तुत करने पर ध्यान केंद्रित -expressed मानव Phla वर्ग मैं)। इस प्रतिजन मेलेनोमा प्रतिरक्षा चिकित्सा के लिए एक व्यापक रूप से अध्ययन लक्ष्य दिया गया है और एक तथाकथित "heteroclitic" पेप्टाइड जिसमें एक valine alanine की जगह के रूप में विकसित किया गया हैलंगर स्थिति 9 में Phla स्थिरता 11 में सुधार होगा। यह दृष्टिकोण इन विट्रो में मेलेनोमा प्रतिक्रियाशील CTLs की प्रेरण को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था और सफलतापूर्वक क्लिनिकल परीक्षण 12 में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, पेप्टाइड अवशेषों को संशोधनों के टी सेल विशिष्टता, क्लिनिक 6, 13 में सबसे heterolitic पेप्टाइड्स के गरीब प्रभावकारिता द्वारा प्रदर्शन पर अप्रत्याशित प्रभाव हो सकता है। दरअसल, gp100 280-288 का एक और heteroclitic रूप है, जो पेप्टाइड अवशेषों में Glu3 अला के लिए प्रतिस्थापित किया गया था, gp100 280-288 विशिष्ट टी कोशिकाओं 14, 15 के एक पॉलीक्लोनल आबादी द्वारा मान्यता निराकृत। हम पहले से दिखा दिया है कि पेप्टाइड लंगर अवशेषों में भी मामूली बदलाव काफी अप्रत्याशित तरीके 6, 16 में टी सेल मान्यता बदल सकते हैं। इस प्रकार, अध्ययन के निर्माण पर ध्यान केंद्रितकैसे सीडी 8 + टी कोशिकाओं को पहचान TCRs और Phla के बीच बातचीत का gp100 और कैसे संशोधनों की एक अधिक विस्तृत चित्र आईएनजी इस समारोह को प्रभावित कर सकता है।

यहाँ, हम gp100 280-288 एचएलए-ए * 0201 (A2-YLE) द्वारा प्रस्तुत करने के लिए विशिष्ट दो TCRs की अत्यधिक शुद्ध, घुलनशील रूपों, साथ ही Phla के प्राकृतिक और बदल रूपों उत्पन्न। इन अभिकर्मकों A2-YLE की heteroclitic रूप है, साथ ही साथ unligated रूप में उत्परिवर्ती pHLAs से दो के साथ परिसर में एक मानव TCR की त्रिगुट परमाणु संरचना का समाधान करने के लिए प्रोटीन क्रिस्टल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया। हम तो biophysical प्रयोगों में गहराई प्रदर्शन से TCRs पर पेप्टाइड प्रतिस्थापन के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए एक पेप्टाइड स्कैनिंग दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया। अंत में, हम एक आनुवंशिक रूप से संशोधित सीडी 8 + टी सेल लाइन उत्पन्न, ताकि विभिन्न पेप्टाइड संशोधनों के जैविक प्रभाव का परीक्षण करने के लिए कार्यात्मक प्रयोगों प्रदर्शन करने में A2-YLE विशेष TCRs में से एक व्यक्त करने के लिए, फिर से प्रोग्राम। ये आंकड़े दर्शाते हैं कि मोदीfications अवशेषों कि TCR बाध्यकारी मूल भाव के बाहर हैं पेप्टाइड अप्रत्याशित तोड़े पर आसन्न पेप्टाइड अवशेषों कि TCR बंधन और टी सेल मान्यता रद्द पर प्रभाव पड़ सकता है। हमारा निष्कर्ष मेलेनोमा के लिए इस महत्वपूर्ण चिकित्सीय लक्ष्य के टी सेल मान्यता अंतर्निहित संरचनात्मक तंत्र का पहला उदाहरण प्रतिनिधित्व करते हैं।

Protocol

1. प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. पहले 17, 18 में विस्तार से वर्णित है, घुलनशील TCRs और pHLAs की पीढ़ी के लिए जीन निर्माणों बनाओ। प्रत्येक एक 5 'BamH1 और एक 3' pGMT7 वेक्टर में सम्मिलन के लिए EcoR1 प्रतिबंध साइट के साथ निर्माण डिजाइन।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक pGMT7 व्युत्पन्न प्लाज्मिड अनुक्रम 50-200 एनजी / 5 मिनट के लिए कोलाई के 5 μL के साथ μL प्लाज्मिड के 1 μL incubating द्वारा ब्याज की प्रोटीन युक्त एन्कोडिंग वेक्टर के साथ ई कोलाई Rosetta (DE3) pLysS रूपांतरण 42 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए, और एक लेग अगर प्लेट 50 मिलीग्राम / एल carbenicillin के साथ पूरक पर 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बाहर थाली।
  3. अलग-अलग कालोनियों उठाओ और 37 डिग्री सेल्सियस और 30 TYP मीडिया के एमएल में 220 आरपीएम (16 जी / एल tryptone, 16 जी / एल खमीर निकालने, और 5 ग्राम / एल एच 2 ओ 4) निलंबन तक 100 माइक्रोन के carbenicillin के साथ पूरक से बढ़ने एक ऑप्टिकल डी पहुँचता हैnsity 0.4 और 0.6 के बीच का (600 आयुध डिपो)।
  4. 3 घंटे के लिए 0.5 मिमी isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) शुरू करने से एक 5 एमएल विभाज्य में प्रोटीन के उत्पादन प्रेरित। साथ और सोडियम सल्फेट dodecyl जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) के विश्लेषण के लिए प्रेरण बिना निलंबन के 20 μL रखें और जेल दाग।
  5. 100 माइक्रोन के carbenicillin के साथ पूरक TYP के 1 एल के लिए स्टार्टर संस्कृतियों जोड़ें और के रूप में 1.3 चरण में ऊपर वर्णित तक निलंबन 0.4 और 0.6 के बीच एक आयुध डिपो 600 तक पहुँच जाता है कोशिकाओं को विकसित।
  6. 0.5 मिमी IPTG के साथ 3 घंटे के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित। 3,000 XG पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला बंद डालना।
  7. बर्फ पर sonicate 30 से 60 मिनट में% बिजली एक 2 एस अंतराल प्रयोग करने के लिए lysis बफर के 40 एमएल में गोली भंग (; 10 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड, 2 MgCl; 150 मिमी NaCl और 10% ग्लिसरॉल 10 मिमी Tris, पीएच 8.1) और 0.1 ग्राम / एल DNase के साथ 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर सेते हैं।
  8. SUS समझोधोने बफर के 100 एमएल के साथ शामिल किए जाने निकायों (आईबी) के रूप में प्रोटीन युक्त पेंशन (0.5% ट्राइटन X-100; 50 मिमी Tris, 8.1 पीएच, 100 मिमी NaCl, और 10 मिमी EDTA)।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट और 8000 XG के लिए नमूना अपकेंद्रित्र और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला बंद डालना। पुनः निलंबित फिर से निलंबन बफर के 100 एमएल में गोली (50 मिमी Tris, पीएच 8.1, 100 मिमी NaCl, और 10 मिमी EDTA, पीएच 8.1), सेंट्रीफ्यूज के रूप में पहले 8,000 XG पर, और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला बंद डालना।
  10. अंत में, guanidine बफर के 10 एमएल में गोली भंग (6 एम guanidine; 50 मिमी Tris, 8.1 पीएच, 2 मिमी EDTA, पीएच 8.1, और 100 मिमी NaCl) और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग 280 एनएम पर प्रोटीन एकाग्रता को मापने।

2. Phla और TCR refolding

  1. Phla refolds के लिए, एचएलए-A2 के 30 मिलीग्राम (या एचएलए-A2 एक बायोटिन टैग के साथ) IBS, β2m IBS के 30 मिलीग्राम और 30 मिनट के लिए पेप्टाइड के 4 मिलीग्राम 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में अंतिम मात्रा में मिश्रण guanidine बफर के 6 एमएल 10 मिमी dithiothreitol के साथ पूरक की(डीटीटी)।
  2. एक पूर्व ठंडा एचएलए refold बफर का 1 एल में पिछले मिश्रण गिराए द्वारा प्रोटीन refolding आरंभ (50 मिमी Tris, पीएच 8.1; 400 मिमी एल arginine, 2 मिमी EDTA, पीएच 8.1, 6 मिमी cysteamine, और 4 मिमी cystamine)।
  3. छोड़ दो एचएलए 3 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सरगर्मी refold और फिर एक 12.4 केडीए MWCO में यह हस्तांतरण (आणविक वजन कट ऑफ) डायलिसिस ट्यूब और 10 मिमी Tris, पीएच 8.1 से 20 एल के खिलाफ 24 घंटे के लिए दो बार dialyze।
  4. TCR refolds के लिए, TCR β श्रृंखला IBS के 30 मिलीग्राम TCR α श्रृंखला IBS के 30 मिलीग्राम और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में 6 एमएल में guanidine बफर 10 मिमी डीटीटी के साथ पूरक का मिश्रण।
  5. एक पूर्व ठंडा TCR refold बफर का 1 एल में विकृत TCR मिश्रण गिराए द्वारा प्रोटीन refolding आरंभ (50 मिमी Tris, पीएच 8.1, 2.5 एम यूरिया, 2 मिमी EDTA, पीएच 8.1, 6 मिमी cysteamine, और 4 मिमी cystamine) 3 के लिए ज।
  6. एक 12.4 केडीए MWCO डायलिसिस ट्यूब में refold स्थानांतरण और 10 मिमी Tris, पीएच 8.1 से 20 एल के खिलाफ 24 घंटे के लिए दो बार dialyze।
  7. दोनों को फ़िल्टर Phla या TCR रेफरीशुद्धि चरणों के लिए एक 0.45 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर का उपयोग कर के बच्चों।

3. तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्धि (FPLC)

  1. एक 7.9 एमएल पर छान refold तैयारी (या तो Phla या TCR) लोड, 50 माइक्रोन आयनों विनिमय राल स्तंभ 10 मिमी Tris, एक लचीला और सहज क्रोमैटोग्राफी सिस्टम पर 8.1 पीएच के 20 एमएल के साथ पूर्व equilibrated।
  2. 5 एमएल / एक नमक ढाल के साथ मिनट में प्रोटीन Elute (10 मिमी Tris में 0-500 मिमी NaCl, पीएच 8.1, 8 स्तंभ की मात्रा से अधिक) और 1-एमएल अंशों इकट्ठा।
  3. अंशों एसडीएस पृष्ठ द्वारा ब्याज की प्रोटीन के लिए इसी का विश्लेषण करें, एक साथ ब्याज की प्रोटीन युक्त भिन्न पूल, और उन्हें नीचे 500 μL करने के लिए 10 केडीए के साथ MWCO 20 या 10 केडीए MWCO 4 centrifugation द्वारा 20 मिनट के लिए 4000 XG पर ध्यान केंद्रित प्रवाह के माध्यम से discarding।
  4. एक 24 मिलीलीटर आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी स्तंभ पर एक 2 एमएल इंजेक्शन पाश में केंद्रित प्रोटीन की तैयारी लोड अनुप्रयोग के साथ पूर्व equilibratedropriate क्षालन बफर: फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), HBS (10 मिमी HEPES, 7.4 पीएच, 150 मिमी NaCl, 3.4 मिमी EDTA, और 0.005% surfactant), या क्रिस्टल बफर (10 मिमी Tris, पीएच 8.1, और 10 मिमी NaCl )।
  5. 0.5 मिलीग्राम / मिनट पर 1 स्तंभ की मात्रा का एक प्रवाह दर पर प्रोटीन elute; 1 एमएल एसडीएस पृष्ठ द्वारा सत्यापित ब्याज की प्रोटीन युक्त भिन्न इकट्ठा।
    नोट: इन विधियों घुलनशील PMEL17 TCR और gp100 TCRs, के रूप में अच्छी तरह से pHLAs इस अध्ययन में इस्तेमाल सभी के रूप में उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया: एचएलए-ए * 0201 के साथ YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1 ए), YLAPGPVTA (A2-YLE -3 ए), YLEAGPVTA (A2-YLE -4 ए), YLEPAPVTA (A2-YLE -5 ए), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), या YLEPGPVAA (A2-YLE-8A)।

4. सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) विश्लेषण

  1. संतुलन बाध्यकारी विश्लेषण या thermodynamic विश्लेषण एक आणविक बातचीत विश्लेषण एक CM5 सेंसर चिप से लैस 19 सिस्टम का उपयोग कर प्रदर्शन करना।
  2. F से CM5 चिप को सक्रिय करेंlowing एक 1: 1 10 μL / मिनट की एक प्रवाह दर पर और 25 डिग्री पर 10 मिनट के लिए 100 मिमी एन hydroxysuccinimide (एनएचएस) और 400 मिमी 1-इथाइल-3- (3-dimethylpropyl) -carboiimide (ईडीसी) के मिश्रण सी।
  3. लोड लगभग 5,000 प्रतिक्रिया इकाइयों (आरयू) streptavidin की (200 माइक्रोग्राम के 110 μL / एमएल 10 मिमी एसीटेट में, पीएच 4.5) सहसंयोजक द्वारा सभी चार प्रवाह कोशिकाओं में चिप सतह को जोड़ने और निष्क्रिय करने के लिए 1 एम ethanolamine हाइड्रोक्लोराइड के 100 μL का उपयोग किसी भी शेष प्रतिक्रियाशील समूहों।
  4. युगल लगभग Phla के 500-600 आरयू, 10 μL / मिनट की एक धीमी गति से प्रवाह दर पर वाणिज्यिक बफर (निर्माता द्वारा प्रदान की) में ~ 1 माइक्रोन, CM5 सेंसर चिप करने पर चिप की सतह पर समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए।
  5. 1 मिमी 60 एस के लिए (निर्माता द्वारा प्रदान की) वाणिज्यिक बफर में बायोटिन के साथ चिप सतह तर।
  6. एक उच्च 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 μL / मिनट के प्रवाह की दर पर प्रासंगिक प्रवाह कोशिकाओं पर घुलनशील TCRs के दस धारावाहिक dilutions इंजेक्षन।
  7. संतुलन बाध्यकारी लगातार गणना(कश्मीर डी (ई)) एक nonlinear वक्र फिट (y = (P1x) / (p2 + x)) 20 का उपयोग कर मूल्यों।
    नोट: y = प्रतिक्रिया इकाइयों, एक्स = विश्लेषक एकाग्रता, P1 = आर मैक्स, P2 = कश्मीर डी।
  8. कैनेटीक्स विश्लेषण एक 1 मानते हुए प्रदर्शन करना: 1 Langmuir बंधन और सॉफ्टवेयर पैकेज 2 में एक वैश्विक फिट कलन विधि का उपयोग कर डेटा फिट बैठते हैं।
  9. 5 डिग्री सेल्सियस, 12 डिग्री सेल्सियस, 18 डिग्री सेल्सियस, 25 डिग्री सेल्सियस और 30 डिग्री सेल्सियस 19: तापमान निम्नलिखित में इस पद्धति का दोहरा द्वारा ऊष्मा प्रयोगों प्रदर्शन करना।
  10. मानक thermodynamic समीकरण (ΔG ° = -RTlnK डी), 19 का उपयोग कर ° ΔG गणना करने के लिए अलग तापमान पर एसपीआर द्वारा निर्धारित कश्मीर डी मूल्यों का प्रयोग करें।
    नोट: आर = गैस निरंतर, टी-कश्मीर में = तापमान, एल.एन. = प्राकृतिक प्रवेश।
  11. 19 - गिब्स-Helmholtz समीकरण (TΔS ° ° ΔG = ΔH) के अनुसार thermodynamic के मापदंडों की गणना। बाध्यकारी मुक्त ऊर्जा, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK डी), तापमान के खिलाफ (कश्मीर) एक nonlinear प्रतिगमन का उपयोग कर (तीन पैरामीटर समीकरण फिट करने की साजिश y = ΔH + ΔCp * (एक्स-298) -x * ΔS- एक्स * ΔCp * एल.एन. (एक्स / 298)) 19।
    नोट: y = कश्मीर में तापमान, एक्स = ΔG °।

5. इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry (आईटीसी)

  1. एक इज़ोटेर्माल अनुमापन कैलोरीमीटर का उपयोग कर आईटीसी प्रयोगों प्रदर्शन करना। कैलोरीमीटर सेल और लोड 210 माइक्रोन के घुलनशील TCR सिरिंज में में 30 माइक्रोन के Phla इंजेक्षन। 20 मिमी HEPES (7.4 पीएच) 150 मिमी NaCl युक्त निम्नलिखित बफर की स्थिति का प्रयोग करें।
  2. 20 TCR इंजेक्शन, एक 2 μL मात्रा में से प्रत्येक के प्रदर्शन करना। विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ΔH और कश्मीर डी की गणना।

6. क्रिस्टलीकरण, विवर्तन डेटा संग्रह, और मॉडल शोधन

  1. एक crystallization रोबोट का उपयोग crystallization परीक्षण प्रदर्शन करना।
  2. VAP द्वारा क्रिस्टल बढ़ोया एक जलाशय क्रिस्टलीकरण बफर के 60 μL (मां शराब), 21 को रोकने के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली में बैठे ड्रॉप तकनीक के माध्यम से 18 डिग्री सेल्सियस पर प्रसार।
  3. एक 10 केडीए आणविक वजन कट ऑफ केन्द्रापसारक concentrator में 3,000 XG पर कताई द्वारा क्रिस्टल बफर में लगभग 10 मिलीग्राम / एमएल (0.2 मिमी) घुलनशील Phla ध्यान लगाओ।
  4. सह जटिल संरचनाओं के लिए, एक 1 पर TCR और Phla मिश्रण: 1 दाढ़ अनुपात में लगभग 10 मिलीग्राम / एमएल (0.1 मिमी) एक प्रोटीन समाधान प्राप्त करने के लिए।
  5. 24 घंटे, 48 घंटे, 72 के बाद एक खुर्दबीन के नीचे एक crystallization रोबोट का उपयोग क्रिस्टलीकरण स्क्रीन से प्रत्येक जलाशय समाधान के 200 NL करने के लिए, TCR और Phla के 1 दाढ़ अनुपात मिश्रण और क्रिस्टल के लिए स्कोर: Phla के 200 नाथन अकेले जोड़ें, या 1 ज, और फिर एक सप्ताह में एक बार।
  6. स्वयं एक माइक्रोस्कोप और तहत क्रायो छोरों में उन्हें बढ़ते द्वारा हार्वेस्ट एकल क्रिस्टल उन्हें जलमग्न है और उन्हें तरल नाइट्रोजन (100 कश्मीर) में भंडारण के द्वारा क्रायो शांत।
    नोट: लोड हो रहा क्रिस्टल prac का एक सा लगता हैtice, और निर्णय लेने से जो क्रिस्टल डेटा संग्रह के लिए काफी अच्छा कर रहे अनुभव के साथ आता है। अंगूठे का एक नियम है, बड़ा और अधिक नियमित क्रिस्टल, बेहतर रूप में।
  7. 100 लालकृष्ण में नाइट्रोजन गैस की एक धारा में डेटा एकत्र
    नोट: इस डेटा डायमंड प्रकाश स्रोत (डीएलएस) ब्रिटेन में राष्ट्रीय सिंक्रोट्रॉन विज्ञान की सुविधा में अधिग्रहण कर लिया था।
  8. दोनों MOSFLM 22 का उपयोग कर xia2 साथ प्रतिबिंब तीव्रता का आकलन करके डेटा का विश्लेषण और XDS संकुल 23, और फिर SCALA या लक्ष्यहीन 24 और CCP4 पैकेज 25 के साथ डेटा पैमाने।
  9. PHASER 26 का उपयोग कर आणविक प्रतिस्थापन के साथ संरचनाओं का समाधान।
  10. कूट 27 के साथ मॉडल को समायोजित करें और REFMAC5 28 के साथ मॉडल को परिष्कृत करें।
  11. PYMOL 29 के साथ चित्रमय अभ्यावेदन तैयार करें।
  12. "संपर्क" की मदद से संपर्कों की गणनाCCP4 पैकेज में कार्यक्रम। वान डर वाल्स संपर्कों के लिए एक 4 एक कट ऑफ और हाइड्रोजन बांड और नमक पुलों के लिए एक 3.4 एक कट ऑफ का प्रयोग करें।
  13. CCP4 पैकेज में "अनुसूचित जाति" प्रोग्राम का उपयोग कर सतह पूरकता की गणना।
  14. , TCR-Phla जटिल के पार कोण की गणना के रूप में 30 में वर्णित है।
    नोट: इस अध्ययन के लिए, प्रतिबिंब डेटा और अंतिम मॉडल निर्देशांक PDB डेटाबेस के साथ जमा किया गया (PMEL17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE -3 ए पी डी बी: ​​5EU4, और A2 -YLE -5 ए पी डी बी: ​​5EU5)।

Representative Results

ऊपर वर्णित विधि का प्रयोग, हम सीडी 8 + टी कोशिकाओं द्वारा gp100 280-288 मान्यता की आणविक विश्लेषण में गहराई से संचालन करने के लिए घुलनशील TCR (1 टेबल) और Phla अणुओं उत्पन्न। एक संशोधित ई कोलाई अभिव्यक्ति प्रणाली दोनों TCRs (α और β चेन) और pHLAs (α श्रृंखला और β2m) में से प्रत्येक अलग श्रृंखला के लिए अघुलनशील IBS उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस विधि अपेक्षाकृत सस्ता और आसान स्थापित करने के लिए होने का फायदा है और प्रोटीन की बड़ी पैदावार (संस्कृति का 100-500 मिलीग्राम / एल) उत्पन्न करता है। इसके अलावा, अघुलनशील प्रोटीन अत्यधिक स्थिर रहे हैं, तो -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। हम तो एक अच्छी तरह से स्थापित refolding और शोधन तकनीक का इस्तेमाल किया कार्यात्मक, सजातीय, घुलनशील प्रोटीन उत्पन्न करते हैं। इस विधि, biophysical संरचनात्मक, और सेलुलर प्रयोगों, साथ ही अभिकर्मकों कि निदान या चिकित्सा विज्ञान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए प्रोटीन पैदा करने के लिए उपयोगी है।

(तालिका 2) का उपयोग कर TCR मूल्यांकन किया है। इस परख का प्रदर्शन किया जो पेप्टाइड में अवशेष TCR बाइंडिंग के लिए सबसे महत्वपूर्ण थे। उच्च संकल्प इस तकनीक का उपयोग बाध्यकारी समानताएं के विश्लेषण के लिए बेहद चिकित्सीय अणु के बंधन आत्मीयता का विश्लेषण करने के लिए, जैविक तंत्र है कि प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर नियंत्रण का निर्धारण करने के लिए उपयोगी है और साथ ही कर रहे हैं।

हम तो परमाणु संकल्प (आंकड़े 1 और 2 और 3 टेबल) पर बाध्यकारी मोड जांच करने के लिए एक संशोधित ट्यूमर व्युत्पन्न Phla (A2-YLE-9 वी) के साथ परिसर में एक मेलेनोमा-विशिष्ट घुलनशील TCR (PMEL17 TCR) सघन। इन प्रयोगों दो अणुओं के बीच बाध्यकारी इंटरफेस के प्रत्यक्ष दृश्य प्रदान करते हैं providinबातचीत के शासी सिद्धांतों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी छ। हम आगे की बातचीत दोनों एसपीआर और आईटीसी का उपयोग करने का एक thermodynamic विश्लेषण किया, ऊर्जावान योगदान है कि (आंकड़े 3) बाध्यकारी सक्षम खुलासा। ये विश्लेषण आगे दो प्रोटीन (चित्रा 4 और तालिका 4) के बीच संपर्क पदचिह्न की एक उच्च संकल्प विवरण द्वारा समर्थित थे।

हम तो unligated Phla अणुओं की संरचनाओं का हल है, पेप्टाइड का उत्परिवर्तित रूपों पेश, खुलासा है कि एक आणविक स्विच समझा सकता है क्यों कुछ उत्परिवर्तन TCR निराकृत बाध्यकारी (आंकड़े 5)।

कुल मिलाकर, इन तकनीकों तंत्र कैसे समझा टी कोशिकाओं एक मेलेनोमा व्युत्पन्न प्रतिजन विरोधी कैंसर चिकित्सा विज्ञान के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है कि पहचान का प्रदर्शन उपन्यास डेटा प्रदान की है। अधिक मोटे तौर पर, इन तकनीकोंवास्तव में किसी भी रिसेप्टर ligand बातचीत की जांच करने, नए जैविक तंत्र है कि उपन्यास चिकित्सीय प्रगति के लिए लक्षित किया जा सकता है को उजागर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: घनत्व साजिश विश्लेषण। बाएँ स्तंभ शो नक्शे में जो मॉडल पेप्टाइड के अभाव में परिष्कृत किया गया न आना। अंतर घनत्व 3.0 सिग्मा पर contoured है, सकारात्मक आकृति हरे रंग में दिखाया गया है, और नकारात्मक आकृति लाल कर रहे हैं। दाएँ हाथ के कॉलम मनाया स्वत: गैर क्रिस्टेलोग्राफिक समरूपता REFMAC5 द्वारा लागू मजबूरी का उपयोग कर बाद में शोधन के बाद 1.0 सिग्मा पर नक्शा (प्रोटीन चेन की छड़ी अभ्यावेदन के चारों ओर एक ग्रे जाल के रूप में दिखाया गया है) से पता चलता है। (ए) TCR CDR3 साथ PMEL17 TCR-A2-YLE-9V के लिए मॉडल रंग नीला (α श्रृंखला) और नारंगी (β चेन) और हरे रंग में पेप्टाइड छोरों। (बी) ए 2-YLE के लिए मॉडल के साथपेप्टाइड गहरे हरे रंग का। (सी) पेप्टाइड रंगीन नारंगी के साथ A2-YLE -3 ए के लिए मॉडल (A2-YLE -3 ए के लिए, वहाँ थे विषम इकाई में 2 अणुओं, लेकिन इन न आना और घनत्व नक्शे के मामले में लगभग समान थे, इसलिए केवल 1 नकल यहाँ दिखाया गया है)। (डी) पेप्टाइड रंग का गुलाबी के साथ A2-YLE -5 ए के लिए मॉडल। संदर्भ 31 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: A2-YLE-9V के साथ परिसर में PMEL17 TCR का अवलोकन। PMEL17 TCR-A2-YLE-9V परिसर के (ए) कार्टून प्रतिनिधित्व। TCR काले रंग का है; गहरे हरे रंग की, CDR2α; TCR सीडीआर छोरों (लाल, CDR1α दिखाए जाते हैं, नीले, CDR3α, पीले, CDR1β, पानी, CDR2 ^6 ;; नारंगी, CDR3β); और एचएलए-ए * 0201 ग्रे में दिखाया गया है। YLE-9V पेप्टाइड हरे रंग की छड़ें का प्रतिनिधित्व करती है। PMEL17 TCR सीडीआर के अवशेषों का (बी) सतह और छड़ी अभ्यावेदन छोरों (ए के रूप में रंग कोडित) है कि A2-YLE सतह से संपर्क करें (A2, ग्रे, YLE-9V, हरे रंग की छड़ें)। काले विकर्ण लाइन YLEPGPVTV पेप्टाइड (46.15 °) की लंबी अक्ष के संबंध में TCR के पार कोण इंगित करता है। (सी) ए 2-YLE-9V सतह पर PMEL17 TCR (A2, ग्रे) के संपर्क पदचिह्न; बैंगनी और हरा (सतह और लाठी) एचएलए-ए * 0201 से संकेत मिलता है और YLE अवशेष, क्रमशः, gp100 TCR से संपर्क किया। कट ऑफ हाइड्रोजन बांड के लिए 3.4 ए और वान डर वाल्स संपर्कों के लिए 4 ए की। संदर्भ 31 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3: PMEL17 TCR-A2-YLE इंटरेक्शन के thermodynamic विश्लेषण। (ए) PMEL17 TCR संतुलन बाध्यकारी 5 पर A2-YLE के लिए प्रतिक्रियाओं, 12, 18, 25, और दस TCR धारावाहिक dilutions के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के पार नौ। एसपीआर कच्चे और फिट डेटा (यह मानते हुए 1: 1 Langmuir बाध्यकारी) प्रत्येक वक्र के इनसेट में दिखाया जाता है और एक वैश्विक फिट एल्गोरिथ्म (BIAevaluation 3.1) के प्रयोग पर और कश्मीर बंद मूल्यों कश्मीर गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया। तालिका संतुलन बाध्यकारी पता चलता है (कश्मीर डी (ई)) और गतिज बाध्यकारी स्थिरांक (कश्मीर डी (कश्मीर) = कश्मीर बंद / कश्मीर पर) प्रत्येक के तापमान पर। संतुलन बाध्यकारी निरंतर (कश्मीर डी, माइक्रोन) के मूल्यों को एक nonlinear फिट का उपयोग कर की गणना की गई (y = (P1x) / (p2 + x))। (ΔG ° = ΔH ° - TΔS °) (बी) thermodynamic पैरामीटर गिब्स-Helmholtz समीकरण के अनुसार गणना की गई। बाध्यकारी मुक्त ऊर्जा, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK डी), तापमान के खिलाफ साजिश रची थे (कश्मीर) एक nonlinear प्रतिगमन का उपयोग कर तीन पैरामीटर समीकरण फिट करने के लिए (y = ΔH ° + ΔCp ° * (एक्स-298) -x * ΔS ° -x * ΔCp ° * एल.एन. (एक्स / 298))। 298 कश्मीर (25 डिग्री सेल्सियस) पर तापीय धारिता (ΔH °) और एन्ट्रापी (TΔS °) किलो कैलोरी / मोल में दिखाया जाता है और तापमान (कश्मीर) के एक गैर रेखीय प्रतिगमन द्वारा गणना की गई है मुक्त ऊर्जा के खिलाफ साजिश रची (ΔG °)। (सी) इज़ोटेर्माल उष्मापन अनुमापन (आईटीसी) PMEL17 TCR-A2-YLE बातचीत के लिए माप। 298 कश्मीर (25 डिग्री सेल्सियस) पर तापीय धारिता (ΔH °) और एन्ट्रापी (TΔS °) किलो कैलोरी / मोल में दिखाया जाता है। संदर्भ 31 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
ओंग> चित्रा 4: पेप्टाइड अवशेष Pro4, Val7, और Thr8 पर PMEL17 सीडीआर लूप्स ध्यान दें। (ए) YLE-9V पेप्टाइड और PMEL17 सीडीआर पाश अवशेषों के बीच संपर्कों की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (2A चित्रा के रूप में कलर-कोडेड)। पैनल के नीचे संख्या TCR और पेप्टाइड के बीच कुल संपर्कों दिखा। (बी) PMEL17 TCR और YLE-9V पेप्टाइड (हरे रंग की छड़ें) वान डर दिखा बीच संपर्कों वाल्स संपर्क (काले धराशायी लाइनों) और हाइड्रोजन बांड (लाल धराशायी लाइनों) TCR CDR3α (नीला) द्वारा किए गए, CDR1β (पीला) , CDR2β (एक्वा), और CDR3β (नारंगी) छोरों। कम पैनल में YLE Pro4, Val7, और Thr8 के बीच संपर्क का एक निकट से देखने क्रमशः है, और TCR सीडीआर पाश अवशेषों (चित्रा 1 ए में के रूप में कोडित रंग चिपक)। कट ऑफ हाइड्रोजन बांड के लिए 3.4 ए और वान डर वाल्स संपर्कों के लिए 4 ए की। संदर्भ 31 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित।rge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: YLE, YLE -3 ए के गठनात्मक तुलना, और A2-YLE -5 ए पेप्टाइड्स एचएलए-ए * 0201 से प्रस्तुत किया। (ए) YLE (गहरे हरे रंग की छड़ें) और YLE -3 ए (नारंगी चिपक) एचएलए-ए का superimposition * 0201 α1 हेलिक्स (ग्रे कार्टून) द्वारा पेप्टाइड संरेखण। बॉक्सिंग के अवशेष एक alanine में Glu3 का उत्परिवर्तन संकेत मिलता है। insets कैसे Glu3Ala प्रतिस्थापन एक A2-YLE संरचना की तुलना में A2-YLE -3 ए संरचना में पड़ोसी अवशेषों Pro4 की स्थिति में बदलाव (काला तीर) का कारण बनता दिखा। (बी) YLE (गहरे हरे रंग की छड़ें) और YLE -5 ए (गुलाबी चिपक) एचएलए-ए * 0201 α1 हेलिक्स (ग्रे कार्टून) के superimposition द्वारा पेप्टाइड संरेखण। बॉक्सिंग के अवशेष एक alanine में ग्लाइसिन 5 का उत्परिवर्तन संकेत मिलता है। संदर्भ से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

TCR CDR1α CDR2α CDR3α CDR1β CDR1β CDR1β
PMEL17 DSAIYN IQSSQRE CAVLSSGGSNYKLTFG SGHTA FQGTGA CASSFIGGTDTQYFG
gp100 TSINN IRSNERE CATDGDTPLVFG LNHDA SQIVND CASSIGGPYEQYFG
KALYS LLKGGEQ CGTETNTGNQFYFG SGHDY FNNNVP CASSLGRYNEQFFG
296 DSASNY IRSNVGE CAASTSGGTSYGKLTFG MNHEY SMNVEV CASSLGSSYEQYFG

तालिका 1: PMEL17 की TCR CDR3 क्षेत्र, gp100, एमपीडी, और 296 gp100 विशेष TCRs के संरेखण। संदर्भ 31 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित।

पेप्टाइड अनुक्रम पेप्टाइड PMEL17 TCR TRAV21 TRBV7-3 आत्मीयता कश्मीर घ gp100 TCR TRAV17 TRBV19 Affiसामुदायिक कश्मीर घ
YLEPGPVTA YLE 7.6 ± 2 माइक्रोन 26.5 ± 2.3 सुक्ष्ममापी
YLEPGPVT वी YLE-9V 6.3 ± 1.2 सुक्ष्ममापी 21.9 ± 2.4 सुक्ष्ममापी
एक LEPGPVTA YLE-1A 15.9 ± 4.1 सुक्ष्ममापी 60.6 ± 5.4 सुक्ष्ममापी
YL एक PGPVTA YLE -3 ए कोई बाध्यकारी कोई बाध्यकारी
YLE एक GPVTA YLE -4 ए 19.7 ± 1.3 सुक्ष्ममापी 144.1 ± 7.8 सुक्ष्ममापी
YLEP एक PVTA YLE -5 ए > 1 मिमी > 1mm
YLEPG एक VTA YLE-6A 11.4 ± 2.7 सुक्ष्ममापी 954.9 ± 97.8 सुक्ष्ममापी YLEPGP एक प्रादेशिक सेना YLE-7A 31.1 ± 4 सुक्ष्ममापी 102.0 ± 9.2 सुक्ष्ममापी
YLEPGPV एक एक YLE-8A 38.1 ± 7.4 सुक्ष्ममापी 121.0 ± 7.5 सुक्ष्ममापी

तालिका 2: आत्मीयता PMEL17 TCR का विश्लेषण (कश्मीर डी) और gp100 TCR 280-288 पेप्टाइड वेरिएंट gp100 करने के लिए। संदर्भ 31 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित।

पैरामीटर्स PMEL17 TCR-A2-YLE-9V ए 2-YLE ए 2-YLE -3 ए ए 2-YLE -5 ए
PDB कोड </ Strong> 5EU6 5EU3 5EU4 5EU5
डेटासेट के आँकड़े
अंतरिक्ष समूह P1 P1 21 1 P1 P1 21 1
इकाई सेल मानकों (एक) एक = 45.52, बी = 54.41, सी = 112.12, एक = 85.0 डिग्री, बी = 81.6 डिग्री, छ = 72.6 ° एक = 52.81, बी = 80.37, सी = 56.06, बी = 112.8 ° एक = 56.08, बी = 57.63, सी = 79.93, एक = 90.0 डिग्री, बी = 89.8 डिग्री, छ = 63.8 ° एक = 56.33, बी = 79.64, सी = 57.74, बी = 116.2 °
विकिरण स्रोत हीरा I03 हीरा I03 हीरा I02 हीरा I02
वेवलेंथ (एक) 0.9763 0.9999 0.9763 0.9763
measuलाल संकल्प रेंज (ए) 51,87 - 2.02 45.25 - 1.97 43.39 - 2.12 43.42 - 1.54
आउटर संकल्प शैल (ए) 2.07 - 2.02 2.02 - 1.97 2.18 - 2.12 1.58 - 154
प्रतिबिंब मनाया 128.191 (8.955) 99.442 (7.056) 99.386 (7.463) 244.577 (17.745)
अनोखा प्रतिबिंब 64.983 (4.785) 30.103 (2.249) 49.667 (3.636) 67.308 (4.962)
संपूर्णता (%) 97.7 (96.7) 98.5 (99.3) 97.4 (96.7) 99.6 (99.9)
बहुलता 2.0 (1.9) 3.3 (3.1) 2.0 (2.1) 3.6 (3.6)
मैं / सिग्मा (आई) 5.5 (1.9) 7.2 (1.9) 6.7 (2.3) 13 (2.3)
Rpim (%) 5.7 (39.8) 8.8 (44.7) 8.7 (41.6) 4.5 (35.4)
आर मर्ज (%) 7.8 (39.6) 9.8 (50.2) 8.7 (41.6) 5.0 (53.2)
शोधन के आँकड़े
संकल्प (एक) 2.02 1.97 2.12 1.54
कोई प्रतिबिंब इस्तेमाल किया 61,688 28557 47,153 63,875
Rfree सेट में कोई प्रतिबिंब 3294 1526 2514 3406
आर cryst (कोई कट ऑफ) (%) 18.1 19.7 17.2 17.0
आर मुक्त 22.2 25.5 21.1 20.1
रूट आदर्श ज्यामिति से वर्ग विचलन मतलब
बंधन लंबाई (एक) 0.018 (0.019) * 0.019 (0.019) * 0.021 (0.019) * 0.018 (0.019) *
बॉन्ड कोण (°) 1.964 (1.939) * 1.961 (1.926) * 2.067 (1.927) * 1.914 (1.936) *
कुल मिलाकर त्रुटि (ए) के समन्वय 0.122 0.153 0.147 0.055
रामचंद्रन सांख्यिकी
सबसे तरजीही 791 (96%) 371 (98%) 749 (99%) 384 (98%)
की अनुमति 32 (4%) 6 (2%) 10 (1%) 5 (1%)
outliers 2 (0%) 3 (1%) 1 (0%) 2 (0%)

तालिका 3: डेटा कमी और शोधन सांख्यिकी (आणविक प्रतिस्थापन)। संदर्भ 31 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। कोष्टकों में दिए गए मान उच्चतम रिजोल्यूशन कवच के लिए हैं।

Tyr1 ओह
एचएलए / पेप्टाइड छाछ TCR छाछ सं VDW (≤4Å) सं एच बांड (≤3.4Å)
Gly62 αGly98 3
αSer99 1
Arg65 αSer99 2
Arg65 हे αAsn100 Nδ2 2 1
Arg65 NH1 βAsp58 Oδ2 1
βSer59 8
Lys66 αGly98 1
αSer99 4
αAsn100 4
Ala69 αAsn100 2
βAla56 2
Gln72 Nε2 βGln51 हे 3 1
βGly54 7
βAla55 1
Thr73 βGln51 1
Val76 βGln51 3
βGly52 2
Lys146 βPhe97 3
βIle98 3
Ala150 βIle98 1
βAsp102 3
Val152 βIle98 1
Glu154 αTyr32 1
Gln155 एन αTyr32 ओह 4 1
Gln155 Oε1 βThr101 एन 10 1
αGly97 हे 1 1
αGly98 1
αSer96 1
Glu3 αTyr101 1
Pro4 αSer96 1
αSer99 1
αAsn100 4
Pro4 हे αTyr101 एन 14 1
Gly5 αTyr101 3
βGly100 2
Val7 βIle98 7
βGly99 2
βGly100 2
Thr8 βThr31 5
βGln51 1
βPhe97 1
Thr8 एन βIle98 हे 6 1

सारणी 4: PMEL17 TCR-A2-YLE-9V संपर्क टेबल। संदर्भ 31 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित।

Discussion

प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित किसी भी मानव रोग के संदर्भ में टी सेल प्रतिक्रिया की आणविक और सेलुलर विच्छेदन के लिए एक रूपरेखा प्रदान करते हैं। हालांकि कैंसर इस अध्ययन का मुख्य फोकस था, हम बहुत समान दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है वायरस 32, 33, 34, 35, टी सेल प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए 36, 37 और autoimmunity 38, 39, 40 के दौरान। इसके अलावा, हम इन तकनीकों का इस्तेमाल किया है और अधिक मोटे तौर पर आणविक सिद्धांत है कि टी सेल प्रतिजन मान्यता 2, 19, 41, 42 पर शासन को समझते हैं। दरअसल, संशोधनों की अप्रत्याशित प्रकृति के अवशेष पेप्टाइड, यहां तक ​​कि उनTCR संपर्क अवशेषों के बाहर के प्रभावों टी सेल मान्यता heteroclitic पेप्टाइड्स के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। इन निष्कर्षों को सीधे बढ़ाया निदान 45, 46, 47 के रूप में उपन्यास टी सेल उपचारों के विकास के लिए योगदान दिया है, पेप्टाइड टीके 6, 43 और कृत्रिम उच्च आत्मीयता TCRs 3, 4, 5, 20, 44 सहित, के रूप में अच्छी तरह से।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
एक अत्यधिक शुद्ध, कार्यात्मक प्रोटीन की पीढ़ी के तरीकों इस पत्र में उल्लिखित सभी के लिए आवश्यक है।

संशोधन और समस्या निवारण
अत्यधिक शुद्ध प्रोटीन पैदा करने में कठिनाइयाँ अक्सर अत्यधिक की अभिव्यक्ति से संबंधित-शुद्ध, ई कोलाई अभिव्यक्ति प्रणाली से अघुलनशील IBS। आमतौर पर, अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल (जैसे, विभिन्न ऑप्टिकल घनत्व में उत्प्रेरण अलग ई कोलाई उपभेदों का उपयोग कर, या विभिन्न मीडिया संरचनाओं का उपयोग) को संशोधित करने के लिए इन मुद्दों को हल करता है।

तकनीक की सीमाएं
इन तकनीकों में घुलनशील प्रोटीन अणुओं (TCR और Phla) है कि सामान्य रूप से कोशिका की सतह पर व्यक्त कर रहे हैं का उपयोग करें। इस प्रकार, यह सुनिश्चित करना है कि संरचनात्मक / biophysical निष्कर्षों सेलुलर दृष्टिकोण जैविक महत्व की पुष्टि करने के साथ संगत कर रहे हैं महत्वपूर्ण है।

मौजूदा / वैकल्पिक तरीकों के संबंध में तकनीक का महत्व
एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और कार्यात्मक विश्लेषण के माध्यम से पुष्टि बायोफिज़िक्स के उपयोग के माध्यम से, हम और दूसरों को दिखा दिया है कि कैंसर epitopes के लिए TCRs विशिष्ट आम तौर पर कम बाध्यकारी समानताएं 48 की विशेषता है। यह कम TCR समानता मदद मिल सकती है क्यों समझा टी कोशिकाओं की गिरफ्तारीई कैंसर समाशोधन पर स्वाभाविक रूप से प्रभावी नहीं। विरोधी कैंसर TCRs और आत्मीय ट्यूमर एंटीजन के बीच परिसरों के उच्च संकल्प परमाणु संरचना इस कमजोर आत्मीयता के लिए आणविक आधार प्रकट करने के लिए शुरू कर रहे हैं। इसके अलावा, इन अध्ययनों तंत्र है कि इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए डिज़ाइन उपचारात्मक उपायों आबाद का निर्धारण करने, भविष्य में सुधार 16 बोने के लिए सहायक होते हैं। इस अध्ययन में, हम एक gp100 एचएलए-ए * 0201-प्रतिबंधित मेलेनोमा मिलान के साथ परिसर में एक स्वाभाविक रूप से होने वाली αβTCR की पहली संरचना की जांच की। संरचना, एक में गहराई से biophysical परीक्षा के साथ संयुक्त, बातचीत का समग्र बंधन मोड का पता चला। हम यह भी एक अप्रत्याशित आणविक स्विच है, जो पेप्टाइड की एक उत्परिवर्तित रूप में हुई, कि TCR निराकृत बंधन और सीडी 8 + टी सेल मान्यता (कार्यात्मक प्रयोगों) (सतह plasmon अनुनाद का उपयोग मूल्यांकन) का पर्दाफाश किया। यह एचएलए प्रतिजन presentati की इस नई व्यवस्था प्रदर्शित करने के लिए ही संभव थावर्णित उच्च संकल्प के तरीकों के प्रयोग पर।

भविष्य अनुप्रयोगों या निर्देश के बाद इस तकनीक के माहिर
कुल मिलाकर, हमारे परिणाम एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और biophysical तरीकों की शक्ति जब मजबूत कार्यात्मक विश्लेषण के साथ संयुक्त प्रदर्शित करता है। इन तरीकों का उपयोग करना, यह सटीक आणविक तंत्र है कि टी सेल प्रतिजन मान्यता शासन काटना संभव है। वास्तव में, यह भी unligated TCRs की संरचना को हल करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए, प्रदर्शन कैसे गठनात्मक परिवर्तन प्रतिजन भेदभाव 49, 50, 51 के दौरान एक भूमिका निभा सकते हैं संभव है। अत्यधिक जटिल और गतिशील स्वभाव है कि underpins TCR-Phla बातचीत का एक बेहतर समझ भी चिकित्सा डिजाइन के लिए स्पष्ट संकेत है। सीधे अणुओं है कि उपचारात्मक को निशाना बनाया जा रहा है, साथ ही प्रभाव संशोधनों प्रतिजन recognitio पर है "देख" सक्षम होने के नातेn, स्पष्ट रूप से आगे जा रही इन दवाओं के विकास में सुधार होगा। इस अध्ययन में, हम बताते हैं कि एक भी पेप्टाइड अवशेषों में परिवर्तन किया गया है कि भारी एक TCR से लगे हुए नहीं उठते एचएलए बाध्य पेप्टाइड, जो, बारी में, नाटकीय रूप से टी सेल मान्यता बदल में अन्य अवशेषों के लिए संरचनात्मक परिवर्तन हस्तांतरित कर सकते हैं। टी सेल प्रतिजन मान्यता के दौरान कार्यरत आणविक तंत्र की एक और पूरी समझ बेहद लाभदायक है जब मानव रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए भविष्य उपचार डिजाइन किया जाएगा।

Acknowledgments

बी.एम. एक कैंसर रिसर्च यूके पीएचडी छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है। एजी एक जीवन विज्ञान अनुसंधान नेटवर्क वेल्स पीएचडी छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है। वीबी एक कैंसर रिसर्च वेल्स पीएचडी छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित है। DKC वेलकम ट्रस्ट रिसर्च कैरियर विकास फेलो (WT095767) है। अक्स वेलकम ट्रस्ट अन्वेषक है। GHM एक संयुक्त लाइफ साइंस रिसर्च नेटवर्क वेल्स और Tenovus कैंसर केयर पीएचडी द्वारा वित्त पोषित है। हम सुविधाओं और सहायता प्रदान करने के लिए डायमंड प्रकाश स्रोत पर कर्मचारियों को धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S.O.C. media Invitrogen
Orbi-Safe New Orbit incubator Sanyo
carbenicillin  Sigma
IPTG  Fisher
Quick Coomassie Stain SafeStain  Generon
Legend RT centrifuge  Sorvall
Tris  Fisher
magnesium chloride  Arcos
NaCl  Fisher
glycerol  Sigma-Aldrich
Sonopuls HD 2070  Bandelin
DNAse  Fisher
Triton Sigma-Aldrich
EDTA  Fisher
guanidine  Fisher
NanoDrop ND1000  Thermo
Peptides Peptide Protein Research
dithiothreitol  Sigma-Aldrich
L-arginine  SAFC
cysteamine  Fisher
cystamine  Fisher
dialysis tubing  Sigma-Aldrich
urea  Sigma-Aldrich
Metricel 0.45 μm membrane filter Pall
POROS 10/100 HQ  Applied biosystems
ÄKTA pure FPLC system  GE Healthcare Life Sciences
10 kDa MWCO Vivaspin 20  Sartorius
10 kDa MWCO Vivaspin 4  Sartorius
Superdex 200 10/300 GL column  GE Healthcare Life Sciences
Phosphate Buffer Saline  Oxoid
BIAcore buffer HBS  GE Healthcare Life Sciences
Biotinylation kit Avidity
BIAcore T200 GE Healthcare Life Sciences
CM5 chip coupling kit GE Healthcare Life Sciences
streptavidin  Sigma-Aldrich
Microcal VP-ITC  GE Healthcare Life Sciences
Hepes  Sigma-Aldrich
Gryphon crystallisation robot Art Robbins Instruments
Intelli-plate  Art Robbins Instruments
Crystallisation screens and reagents Molecular Dimensions
75 cm2 flask  Greiner Bio-One
0.22 μm filters Miller-GP, Millipore
Ultra-Clear ultracentrifuge tube  Beckman Coulter
Optima L-100 XP with SW28 rotor Beckman Coulter
CD8 microbeads  Miltenyi Biotec
anti-CD3/CD28 Dynabeads  Invitrogen
anti-PE microbeads  Miltenyi Biotec
CK medium, PHA Alere Ltd
anti-TCRVβ mAb  BD
dasatinib  Axon
MIP-1β and TNFα ELISA  R&D Systems
 51Cr  PerkinElmer
1450 Microbeta counter PerkinElmer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aleksic, M., Liddy, N., et al. Different affinity windows for virus and cancer-specific T-cell receptors: implications for therapeutic strategies. European journal of immunology. 42 (12), 3174-3179 (2012).
  2. Cole, D. K., Pumphrey, N. J., et al. Human TCR-binding affinity is governed by MHC class restriction. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 178 (9), 5727-5734 (2007).
  3. Cole, D. K., Sami, M., et al. Increased Peptide Contacts Govern High Affinity Binding of a Modified TCR Whilst Maintaining a Native pMHC Docking Mode. Frontiers in immunology. 4 (JUN), 168 (2013).
  4. Raman, M. C. C., Rizkallah, P. J., et al. Direct molecular mimicry enables off-target cardiovascular toxicity by an enhanced affinity TCR designed for cancer immunotherapy. Scientific reports. 6, 18851 (2016).
  5. Liddy, N., Bossi, G., et al. Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nature medicine. 18 (6), 980-987 (2012).
  6. Cole, D. K., Edwards, E. S. J., et al. Modification of MHC anchor residues generates heteroclitic peptides that alter TCR binding and T cell recognition. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 185 (4), 2600-2610 (2010).
  7. Parkhurst, M. R., Salgaller, M. L., et al. Improved induction of melanoma-reactive CTL with peptides from the melanoma antigen gp100 modified at HLA-A*0201-binding residues. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (6), 2539-2548 (1996).
  8. Salgaller, M. L., Marincola, F. M., Cormier, J. N., Rosenberg, S. A. Immunization against epitopes in the human melanoma antigen gp100 following patient immunization with synthetic peptides. Cancer research. 56 (20), 4749-4757 (1996).
  9. Cameron, B. J., Gerry, A. B., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science translational medicine. 5 (197), 197ra103 (2013).
  10. Linette, G. P., Stadtmauer, E. A., et al. Cardiovascular toxicity and titin cross-reactivity of affinity-enhanced T cells in myeloma and melanoma. Blood. 122 (6), 863-871 (2013).
  11. Miles, K. M., Miles, J. J., Madura, F., Sewell, A. K., Cole, D. K. Real time detection of peptide-MHC dissociation reveals that improvement of primary MHC-binding residues can have a minimal, or no, effect on stability. Molecular immunology. 48 (4), 728-732 (2011).
  12. Lesterhuis, W. J., Schreibelt, G., et al. Wild-type and modified gp100 peptide-pulsed dendritic cell vaccination of advanced melanoma patients can lead to long-term clinical responses independent of the peptide used. Cancer immunology, immunotherapy CII. 60 (2), 249-260 (2011).
  13. Speiser, D. E., Baumgaertner, P., et al. Unmodified self antigen triggers human CD8 T cells with stronger tumor reactivity than altered antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (10), 3849-3854 (2008).
  14. Schaft, N., Willemsen, R. A., et al. Peptide fine specificity of anti-glycoprotein 100 CTL is preserved following transfer of engineered TCR alpha beta genes into primary human T lymphocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 170 (4), 2186-2194 (2003).
  15. Schaft, N., Coccoris, M., et al. An Altered gp100 Peptide Ligand with Decreased Binding by TCR and CD8α Dissects T Cell Cytotoxicity from Production of Cytokines and Activation of NFAT. Frontiers in immunology. 4 (SEP), 270 (2013).
  16. Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. Structural basis for ineffective T-cell responses to MHC anchor residue-improved "heteroclitic" peptides. European journal of immunology. 45 (2), 584-591 (2015).
  17. Boulter, J. M., Glick, M., et al. Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein engineering. 16 (9), 707-711 (2003).
  18. Garboczi, D. N., Utz, U., et al. Assembly, specific binding, and crystallization of a human TCR-alphabeta with an antigenic Tax peptide from human T lymphotropic virus type 1 and the class I MHC molecule HLA-A2. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (12), 5403-5410 (1996).
  19. Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. T-cell receptor specificity maintained by altered thermodynamics. Journal of Biological Chemistry. 288 (26), 18766-18775 (2013).
  20. Cole, D. K., Rizkallah, P. J., et al. Computational design and crystal structure of an enhanced affinity mutant human CD8 alphaalpha coreceptor. Proteins: Structure, Function and Genetics. 67 (1), 65-74 (2007).
  21. Benvenuti, M., Mangani, S. Crystallization of soluble proteins in vapor diffusion for x-ray crystallography. Nature protocols. 2 (7), 1633-1651 (2007).
  22. Leslie, A. G. W., Powell, H. R., et al. Automation of the collection and processing of X-ray diffraction data - a generic approach. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (11), 1924-1928 (2002).
  23. Kabsch, W. Xds. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  24. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  25. Bailey, S. N. Collaborative Computational Project, N. 4. The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (5), 760-763 (1994).
  26. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  27. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (12 I), 2126-2132 (2004).
  28. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 53 (3), 240-255 (1997).
  29. DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphics System. Schrödinger LLC. 1, Available from: http://www.pymol.org (2000).
  30. Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How Tcrs Bind Mhcs, Peptides, and Coreceptors. Annual Review of Immunology. 24 (1), 419-466 (2006).
  31. Bianchi, V., Bulek, A., et al. A Molecular Switch Abrogates Glycoprotein 100 (gp100) T-cell Receptor (TCR) Targeting of a Human Melanoma Antigen. Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8951-8959 (2016).
  32. Matthews, P. C., Koyanagi, M., et al. Differential clade-specific HLA-B*3501 association with HIV-1 disease outcome is linked to immunogenicity of a single Gag epitope. Journal of virology. 86 (23), 12643-12654 (2012).
  33. Gostick, E., Cole, D. K., et al. Functional and biophysical characterization of an HLA-A* 6801-restricted HIV-specific T cell receptor. European Journal of Immunology. 37 (2), 479-486 (2007).
  34. Miles, J. J., Bulek, A. M., et al. Genetic and structural basis for selection of a ubiquitous T cell receptor deployed in Epstein-Barr virus infection. PLoS Pathogens. 6 (11), e1001198 (2010).
  35. Holland, C. J., Rizkallah, P. J., et al. Minimal conformational plasticity enables TCR cross-reactivity to different MHC class II heterodimers. Scientific reports. 2, 629 (2012).
  36. Kløverpris, H. N., Cole, D. K., et al. A molecular switch in immunodominant HIV-1-specific CD8 T-cell epitopes shapes differential HLA-restricted escape. Retrovirology. 12, 20 (2015).
  37. Motozono, C., Kuse, N., et al. Molecular Basis of a Dominant T Cell Response to an HIV Reverse Transcriptase 8-mer Epitope Presented by the Protective Allele HLA-B*51:01. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 192 (7), 3428-3434 (2014).
  38. Motozono, C., Pearson, J. A., et al. Distortion of the major histocompatibility complex class i binding groove to accommodate an insulin-derived 10-mer peptide. Journal of Biological Chemistry. 290 (31), 18924-18933 (2015).
  39. Cole, D. K., Bulek, A. M., et al. Hotspot autoimmune T cell receptor binding underlies pathogen and insulin peptide cross-reactivity. The Journal of clinical investigation. , (2016).
  40. Bulek, A. M., Cole, D. K., et al. Structural basis for the killing of human beta cells by CD8(+) T cells in type 1 diabetes. Nature immunology. 13 (3), 283-289 (2012).
  41. Ekeruche-Makinde, J., Clement, M., et al. T-cell receptor-optimized peptide skewing of the T-cell repertoire can enhance antigen targeting. Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37269-37281 (2012).
  42. Cole, D. K., Miles, K. M., et al. T-cell Receptor (TCR)-peptide specificity overrides affinity-enhancing TCR-major histocompatibility complex interactions. Journal of Biological Chemistry. 289 (2), 628-638 (2014).
  43. Cole, D. K., Gallagher, K., et al. Modification of the carboxy-terminal flanking region of a universal influenza epitope alters CD4+ T-cell repertoire selection. Nature communications. 3, 665 (2012).
  44. Varela-Rohena, A., Molloy, P. E., et al. Control of HIV-1 immune escape by CD8 T cells expressing enhanced T-cell receptor. Nature medicine. 14 (12), 1390-1395 (2008).
  45. Holland, C. J., Dolton, G., et al. Enhanced Detection of Antigen-Specific CD4+ T Cells Using Altered Peptide Flanking Residue Peptide-MHC Class II Multimers. The Journal of Immunology. 195 (12), 5827-5836 (2015).
  46. Wooldridge, L., Clement, M., et al. MHC class I molecules with Superenhanced CD8 binding properties bypass the requirement for cognate TCR recognition and nonspecifically activate CTLs. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 184 (7), 3357-3366 (2010).
  47. Laugel, B., Den Berg, H. A. V. an, et al. Different T cell receptor affinity thresholds and CD8 coreceptor dependence govern cytotoxic T lymphocyte activation and tetramer binding properties. Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 23799-23810 (2007).
  48. Bridgeman, J. S., Sewell, A. K., Miles, J. J., Price, D. A., Cole, D. K. Structural and biophysical determinants of αβ T-cell antigen recognition. Immunology. 135 (1), 9-18 (2012).
  49. Willcox, B. E., Gao, G. F., et al. TCR binding to peptide-MHC stabilizes a flexible recognition interface. Immunity. 10 (3), 357-365 (1999).
  50. Borbulevych, O. Y., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational melding permits a conserved binding geometry in TCR recognition of foreign and self molecular mimics. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 186 (5), 2950-2958 (2011).
  51. Armstrong, K. M., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational changes and flexibility in T-cell receptor recognition of peptide-MHC complexes. The Biochemical journal. 415 (2), 183-196 (2008).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 120 सीडी 8 + टी कोशिकाओं टी सेल रिसेप्टर (TCR) पेप्टाइड मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (Phla) सतह plasmon अनुनाद एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी कैंसर gp100 मेलेनोमा heteroclitic पेप्टाइड्स
का उपयोग करते हुए एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, बायोफिजिक्स, और कार्यात्मक assays तंत्र शासी टी-सेल कैंसर प्रतिजनों की रिसेप्टर मान्यता निर्धारित करने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

MacLachlan, B. J.,… More

MacLachlan, B. J., Greenshields-Watson, A., Mason, G. H., Schauenburg, A. J., Bianchi, V., Rizkallah, P. J., Sewell, A. K., Fuller, A., Cole, D. K. Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens. J. Vis. Exp. (120), e54991, doi:10.3791/54991 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter