Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Med användning av röntgenkristallografi, Biophysics, och Funktionella analyser för att bestämma de mekanismer som styr T-cellsreceptorigenkänning of Cancer Antigens

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/54991
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1,2,3, 1, 1, 1, 1
1Division of Infection and Immunity and Systems Immunity Research Institute, Cardiff University, 2Department of Oncology, University Hospital of Lausanne (CHUV), 3Ludwig Insitutue for Cancer Research, Lausanne Branch, University of Lausanne
* These authors contributed equally

Introduction

Röntgenkristallografi har varit, och kommer att fortsätta att vara en extremt kraftfull teknik för att förstå vilken typ av ligand-receptorinteraktioner. Genom att visualisera dessa interaktioner i atom detalj, är det inte bara möjligt att avslöja de molekylära mekanismer som styr många biologiska processer, men det är också möjligt att direkt ändra kontaktytor för terapeutisk fördel. Tillsammans med tekniker såsom ytplasmonresonans och isotermisk titrering kalorimetri (för att bara nämna ett par), kan sådana ändringar sedan analyseras biofysiskt att bedöma de direkta effekterna på bindningsaffinitet, interaktions kinetik och termodynamik. Slutligen, genom att utföra funktionella experiment på relevanta celltyper, en detaljerad bild av den molekylära och funktionella effekterna av ändringar receptor-ligandinteraktioner kan härledas, ger mycket specifik mekanistisk information. Sammantaget dessa typer av metoder ger en atomär upplösning bild som gör det möjligt avskräcka ställandet av hur biologiska system fungerar, med åtföljande konsekvenser för diagnostiska och terapeutiska framsteg.

Vårt laboratorium rutinmässigt använder dessa tekniker för att studera de receptorer som medierar human T-cell immunitet mot patogener och cancer, i autoimmunitet, och under transplantation. Här fokuserar vi på den mänskliga CD8 + T-cellssvar mot cancer, medierad av en interaktion mellan T-cellreceptorn (TCR) och HLA-antigen (HLA) -restricted tumör härledda peptider (pHLA). Detta är viktigt eftersom, även CD8 + T-celler kan rikta cancerceller, har vi och andra tidigare visat att anti-cancer TCR suboptimalt binda till deras besläktade pHLA 1, 2. Sålunda har många laboratorier försökt att förändra antingen TCR 3, 4, 5 eller peptidliganden 6,class = "xref"> 7, 8 för att öka immunogenicitet och bättre mål cancerceller. Men dessa metoder är inte alltid effektiva och kan ha allvarliga biverkningar, inklusive off-target toxicitet 4, 9, 10. Ytterligare forskning undersöker de molekylära mekanismer som styr T-celligenkänning av cancerantigener kommer att vara avgörande för att övervinna dessa brister.

I den aktuella studien har vi fokuserat på svaren mot autologa melanomceller av CD8 + T-celler specifika för ett fragment av differentiering melanocytantalet antigen glykoprotein 100 (gp100), gp100 280-288, presenteras av HLA-A * 0201 (den vanligaste -expressed humant pHLA klass I). Detta antigen har varit en allmänt studerade mål för melanom immunoterapi och har utvecklats som ett så kallat "heteroclitic" peptid i vilken en valin ersätter alaninankar position 9 för att förbättra pHLA stabilitet 11. Detta tillvägagångssätt användes för att öka induktionen av melanom-reaktiva CTL in vitro och har med framgång använts i kliniska prövningar 12. Däremot kan ändringar av peptidrester har oförutsägbara effekter på T-cellspecificitet, framgår av den dåliga effekten av de flesta heterolitic peptider på kliniken 6, 13. I själva verket, en annan heteroclitic form av gp100 280-288, i vilken peptidrest Glu3 ersattes Ala upphävde erkännande av en polyklonal population av gp100 280-288-specifika T-celler 14, 15. Vi har tidigare visat att även små förändringar i peptidförankringsrester väsentligt kan ändra T-celligenkänning på oförutsägbara sätt 6, 16. Således fokuserade studien på building en mer detaljerad bild av hur CD8 + T-celler känner igen gp100 och hur ändringar av samspelet mellan TCR och pHLA kan påverka den här funktionen.

Här, vi genererat mycket rena, lösliga former av två TCR specifika för gp100 280-288 presenteras av HLA-A * 0201 (A2-YLE), samt naturliga och förändrade former av pHLA. Dessa reagens användes för att generera proteinkristaller för att lösa den ternära atomära strukturen av en human TCR i komplex med heteroclitic form av A2-YLE, liksom två av de mutanta pHLAs i oligerat form. Vi använde sedan en peptid scanning metod för att påvisa effekten av peptid substitutioner på TCR genom att utföra en fördjupad biofysiska experiment. Slutligen, vi genererade en genetiskt modifierad CD8 + T-cellinje, omprogrammerad för att uttrycka en av de A2-YLE specifika TCR, för att utföra funktionella experiment för att testa den biologiska effekten av de olika peptidmodifieringar. Dessa data visar att även moditioner att peptidrester som ligger utanför den TCR-bindande motivet kan ha oförutsägbara följdeffekter på intilliggande peptidrester som upphäver TCR-bindning och T-celligenkänning. Våra resultat representerar det första exemplet på de strukturella mekanismer som ligger bakom T-celligenkänning av detta viktiga terapeutiska mål för melanom.

Protocol

1. Protein Expression

  1. Göra genkonstruktioner för generering av lösliga TCR och pHLAs, såsom beskrivs i detalj tidigare 17, 18. Utforma varje konstrukt med en 5 'BamH1 och en 3' EcoR1 restriktionsställe för insättning i pGMT7-vektor.
  2. Transformera E. coli Rosetta (DE3) pLysS med en pGMT7-härledd plasmid vektor som innehåller den sekvens som kodar för proteinet av intresse genom att inkubera en mikroliter av 50 till 200 ng / | il plasmid med 5 mikroliter av E. coli under 5 minuter vid 4 ° C , 2 min vid 42 ° C och 5 min vid 4 ° C, och plattan ut över natten vid 37 ° C på en LB-agarplatta som kompletterats med 50 mg / L carbenicillin.
  3. Plocka individuella kolonier och växa vid 37 ° C och 220 rpm i 30 ml TYP-media (16 g / L trypton, 16 g / L jästextrakt, och 5 g / L HK 2 O 4) kompletterat med 100 | iM karbenicillin tills suspensionen når en optisk density (OD 600) av mellan 0,4 och 0,6.
  4. Inducera proteinproduktion i en 5 ml alikvot genom att införa 0,5 mM isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) under 3 timmar. Hålla 20 mikroliter av suspensionen med och utan induktion för natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) analys och fläcka gelén.
  5. Lägg startkulturer till en L av TYP kompletterat med 100 ^ M karbenicillin och växa celler såsom beskrivits ovan i steg 1,3 tills suspensionen når ett OD 600 mellan 0,4 och 0,6.
  6. Inducera proteinexpression under 3 h med 0,5 mM IPTG. Centrifugera cellerna under 20 min vid 3000 x g och häll bort supernatanten försiktigt.
  7. Upplösa pelleten i 40 ml lyseringsbuffert (10 mM Tris, pH 8,1; 10 mM magnesiumklorid, MgCl2; 150 mM NaCl; och 10% glycerol), Sonikera på is under 30 min vid 60% effekt under användning av en 2 s intervall och inkubera vid rumstemperatur (RT) under 30 min med 0,1 g / L DNas.
  8. Behandla suspensionen innehållande proteinerna i form av inklusionskroppar (IB) med 100 ml tvättbuffert (0,5% Triton X-100; 50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCl; och 10 mM EDTA).
  9. Centrifugera provet under 20 min vid 4 ° C och 8000 x g och häll bort supernatanten försiktigt. Återsuspendera pelleten i 100 ml återsuspensionsbuffert (50 mM Tris, pH 8,1; 100 mM NaCl; och 10 mM EDTA, pH 8,1), centrifugera som förut vid 8000 xg, och häll bort supernatanten försiktigt.
  10. Slutligen upplösa pelleten i 10 ml guanidinbuffert (6 M guanidin, 50 mM Tris, pH 8,1; 2 mM EDTA, pH 8,1; och 100 mM NaCl) och mäta proteinkoncentrationen vid 280 nm med användning av en spektrofotometer.

2. pHLA och TCR Återveckning

  1. För pHLA refolds, blanda 30 mg av HLA-A2 (eller HLA-A2 med en biotin tag) IB, 30 mg p2m IB, och 4 mg peptid under 30 min vid 37 ° C i ett vattenbad i en slutlig volym av 6 ml guanidinbuffert kompletterat med 10 mM ditiotreitol(DTT).
  2. Initiera proteinåterveckning genom att späda den föregående blandningen i 1 L av en pre-kyld HLA återveckning-buffert (50 mM Tris, pH 8,1; 400 mM L-arginin; 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteamin, och 4 mM cystamin).
  3. Lämnar HLA refold omröring vid 4 ° C under 3 h och sedan överföra den till en kDa MWCO 12,4 (molekylviktsgräns) dialysrör och dialysera två gånger under 24 h mot 20 liter 10 mM Tris, pH 8,1.
  4. För TCR refolds, blanda 30 mg av TCR α-kedjan IBS och 30 mg TCR β-kedjan IB i 30 min vid 37 ° C i ett vattenbad i 6 ml guanidin buffert kompletterad med 10 mM DTT.
  5. Initiera proteinåterveckning genom att späda den denaturerade TCR-blandningen i ett L av en pre-kyld TCR återveckning-buffert (50 mM Tris, pH 8,1; 2,5 M urea; 2 mM EDTA, pH 8,1; 6 mM cysteamin, och 4 mM cystamin) för tre h.
  6. Överföra återveckning in i en 12,4-kDa MWCO dialysrör och dialysera två gånger under 24 h mot 20 liter 10 mM Tris, pH 8,1.
  7. Filtrera både pHLA eller TCR refåringar som använder en 0,45-um membranfilter för reningsstegen.

3. Rening genom snabb protein vätskekromatografi (FPLC)

  1. Ladda den filtrerade återveckn beredningen (antingen pHLA eller TCR) på en 7,9 ml, um anjonbytarkolonn 50 förekvilibrerats med 20 ml 10 mM Tris, pH 8,1 på en flexibel och intuitiv kromatografisystem.
  2. Eluera proteinet vid 5 ml / min med en saltgradient (0-500 mM NaCl i 10 mM Tris, pH 8,1, över 8 kolonnvolymer) och samla en-ml fraktioner.
  3. Analysera fraktioner motsvarande proteinet av intresse med hjälp av SDS-PAGE, pool de fraktioner som innehåller proteinet av intresse tillsammans, och koncentrera dem ner till 500 mikroliter med 10-kDa MWCO 20 eller 10 kDa MWCO 4 genom centrifugering under 20 min vid 4000 xg och kasta genomströmning.
  4. Ladda de koncentrerade proteinberedningar i en 2 ml injektionsslinga på en 24 ml storleksuteslutande kromatografi-kolonn som förekvilibrerats med appenropriate elueringsbuffert: fosfatbuffrad saltlösning (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7,4; 150 mM NaCl; 3,4 mM EDTA; och 0,005% ytaktivt medel), eller kristall-buffert (10 mM Tris, pH 8,1, och 10 mM NaCl ).
  5. Eluera proteiner vid en flödeshastighet på 0,5 ml / min under en kolonnvolym; samla in 1 ml fraktioner innehållande proteinet av intresse verifieras genom SDS-PAGE.
    OBS! Dessa metoder användes för att generera lösliga Pmel 17 TCR och gp100 TCR, liksom alla de pHLAs användes i denna studie: HLA-A * 0201 med YLEPGPVTA (A2-YLE), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1A), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- 7A), eller YLEPGPVAA (A2-YLE-8A).

4. Surface Plasmon Resonance (SPR) Analys

  1. Utför jämviktsbindande analys eller termodynamisk analys med hjälp av en molekylär interaktion analyssystem utrustat med en CM5-sensorchip 19.
  2. Aktivera CM5-chip av fjande en 1: 1 blandning av 100 mM N-hydroxisuccinimid (NHS) och 400 mM 1-etyl-3- (3-dimetylpropyl) -carboiimide (EDC) under 10 min vid en flödeshastighet av 10 | il / min och vid 25 ° C.
  3. Belastning ca 5000 responsenheter (RU) av streptavidin (110 | il av 200 | ig / ml i 10 mM acetat, pH 4,5) genom kovalent länkade till spånytan i alla fyra flödesceller och använda 100 | il av 1 M etanolamin-hydroklorid för att deaktivera eventuella kvarvarande reaktiva grupper.
  4. Par cirka 500-600 RU i pHLA vid ~ 1 ^ M i kommersiell buffert (tillhandahålls av tillverkaren), till CM5 sensorchip i långsam flödeshastighet av 10 ml / min för att säkerställa jämn fördelning på chipytan.
  5. Mätta spånytan med 1 mM biotin i kommersiell buffert (tillhandahålls av tillverkaren) i 60 s.
  6. Injicera tio serieutspädningar av lösliga TCR över de relevanta flödesceller vid en hög flödeshastighet av 30 | il / min vid 25 ° C.
  7. Beräkna jämvikts-bindningskonstanten(K D (E)) värden med en icke-linjär kurvanpassning (y = (P1X) / (P2 + x)) 20.
    OBS: y = svarsenheter, x = analytiker koncentration, P1 = r max, P2 = Kd.
  8. Utför kinetik analys antar en 1: 1 Langmuir bindande och montera data med hjälp av en global passningsalgoritm i programpaketet 2.
  9. Utföra termodynamik experiment genom att upprepa detta förfarande vid följande temperaturer: 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C, och 30 ° C 19.
  10. Använd K D-värden bestämda av SPR vid olika temperaturer för att beräkna AG ° med hjälp av standardtermodynamiska ekvationen (AG ° = -RTlnK D) 19.
    OBS: R = gaskonstanten, T = temperaturen i K, ln = naturliga logaritmen.
  11. Beräkna termodynamiska parametrar enligt Gibbs-Helmholtz ekvation (AG ° = AH - TΔS °) 19. Plotta de bindande fria energier, AG ° (AG ° = -RTlnK D), mot temperatur (K) med användning av en icke-linjär regression för att passa tre-parameterekvation (y = AH + ACp * (x-298) -x * ΔS- x * ACp * ln (x / 298)) 19.
    OBS: y = temperaturen i K, x = AG °.

5. Isotermiska Titrering Calorimetry (ITC)

  1. Utför ITC experiment med användning av en isotermisk titrering kalori. Injicera 30 ^ M pHLA i kalori cellen och lasten 210 iM löslig TCR i sprutan. Använd följande buffertbetingelser: 20 mM HEPES (pH 7,4) innehållande 150 mM NaCl.
  2. Utför 20 TCR injektioner, var och en av en 2 mikroliter volym. Beräkna AH och K D medelst analytisk mjukvara.

6. Kristallisering, diffraktion datainsamling, och modell Förädling

  1. Utför kristallisering prövningar med hjälp av en kristallisationsrobot.
  2. Växa kristaller av VAPeller diffusion vid 18 ° C via sittande droppe teknik i en 96-brunnsplatta med en reservoar innehållande 60 mikroliter av kristallisationsbuffert (moderlut) 21.
  3. Koncentrera den lösliga pHLA till cirka 10 mg / ml (0,2 mM) i kristall buffert genom spinning vid 3000 x g i en 10-kDa molekylviktsgräns centrifugalkoncentrator.
  4. För de samverkande komplexa strukturer, blanda TCR och pHLA vid ett 1: 1 molärt förhållande för att erhålla en proteinlösning vid ungefär 10 mg / ml (0,1 mM).
  5. Lägg 200 nL av pHLA ensam, eller 1: 1 molförhållande blandning av TCR och pHLA, till 200 nL av varje reservoarlösningen från kristallisationsskärmen med användning av en kristallisationsrobot och göra mål för kristaller under ett mikroskop efter 24 h, 48 h, 72 h, och sedan en gång i veckan.
  6. Harvest enkristaller genom att manuellt montera dem i Cryo-slingor under ett mikroskop och Cryo-kyl dem genom att sänka ned och lagra dem i flytande kväve (100 K).
    OBS: Laddar kristaller tar lite PracTice, och beslutar vilka kristaller är tillräckligt bra för datainsamling kommer med erfarenhet. Som en tumregel, desto större och mer regelbunden kristallen, desto bättre.
  7. Samla in data i en ström av kvävgas vid 100 K.
    OBS: Dessa data förvärvades i Diamond Light Source (DLS) nationell synkrotronljus vetenskap anläggning i Storbritannien.
  8. Analysera data genom att uppskatta reflektionsintensitet med xia2 med både MOSFLM 22 och XDS paket 23, och sedan skala data med SCALA eller UTAN MÅL 24 och CCP4 paketet 25.
  9. Lös strukturer med molekylär ersättning använder PHASER 26.
  10. Justera modellen med Sothöna 27 och förfina modellen med REFMAC5 28.
  11. Förbered grafiska representationer med PyMOL 29.
  12. Beräkna kontakterna genom att använda "kontakt"program i CCP4-paketet. Använd en 4 en cut-off för van der Waals-kontakter och en 3,4 Å cut-off för vätebindningar och saltbryggor.
  13. Beräkna yta komplementaritet med "SC" program i CCP4 paketet.
  14. Beräkna korsningsvinkeln av TCR-pHLA komplex, som beskrivits 30.
    OBS: För denna studie var de reflektionsdata och slutliga modellkoordinater deponerats hos databasen PDB (Pmel 17 TCR-A2-YLE-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-YLE-3A PDB: 5EU4, och A2 -YLE-5A PDB: 5EU5).

Representative Results

Med användning av de ovan beskrivna metoderna, genererade vi löslig TCR (tabell 1) och pHLA molekyler till genomföra en fördjupad molekylära analyser av gp100 280-288 igenkänning av CD8 + T-celler. En modifierad E. coli-expressionssystemet användes för att generera olösligt IB för varje separat kedja av både TCR (a- och p-kedjor) och pHLAs (α kedjan och p2m). Denna metod har fördelen av att vara relativt billig och lätt att ställa upp och genererar stora utbyten av protein (100-500 mg / L kultur). Också, de olösliga proteinerna är mycket stabila vid förvaring vid -80 ° C. Vi använde sedan en väletablerad återveckning och rening teknik för att generera funktionella, homogena, lösliga proteiner. Denna metod är användbar för att generera proteiner för biofysiska, strukturella och cellulära experiment, liksom reagens som kan användas för diagnos eller terapi.

(tabell 2). Denna analys visade vilka rester i peptiden var viktigast för TCR-bindning. Hög upplösning analys av bindningsaffiniteter som använder denna teknik är mycket användbara för att bestämma biologiska mekanismer som styr protein-proteininteraktioner, liksom för att analysera bindningsaffiniteten för terapeutiska molekyler.

Vi kristalliserades sedan en melanom-specifik löslig TCR (Pmel 17 TCR) i komplex med en modifierad tumörhärledd pHLA (A2-YLE-9V) för att undersöka bindningen läge på atomär upplösning (figurerna 1 och 2 och tabell 3). Dessa experiment ger direkt visualisering av bindningsgränsytan mellan två molekyler, providing viktig information om de bakomliggande principerna för interaktion. Vi genomförde ytterligare en termodynamisk analys av interaktionen med både SPR och ITC, avslöjar energiska insatser som möjlig bindning (figur 3). Dessa analyser ytterligare stöd av en högupplöst beskrivning av kontaktavtrycket mellan de två proteinerna (Figur 4 och Tabell 4).

Vi löste då strukturerna för oligerade pHLA molekyler, presenterar muterade former av peptiden, avslöjar att en molekylär omkopplare kan förklara varför vissa mutationer upphävda TCR-bindning (figur 5).

Sammantaget dessa tekniker tillhandahålls nya data som visar den mekanism som förklarar hur T-celler känner igen en melanom-härledd antigen som är ett viktigt mål för anti-cancerterapi. Mer allmänt, dessa teknikerkan användas för att undersöka praktiskt taget alla receptor-ligand-interaktion, avslöja nya biologiska mekanismer som kan målsökas för nya terapeutiska framsteg.

Figur 1
Figur 1: Densitet Plot Analys. Den vänstra kolumnen visar utelämna kartor där modellen förfinades i frånvaro av peptiden. Densitetsskillnaden är formad på 3,0 sigma är positiva konturer visas i grönt, och negativa konturer är röda. Den högra kolumnen visar den observerade karta på 1,0 sigma (visas som en grå nät runt stick representationer av proteinkedjor) efter efterföljande förfining med automatiska begränsningar icke-kristallografiska symmetri som tillämpas av REFMAC5. (A) Modellen för Pmel 17 TCR-A2-YLE-9V med TCR CDR3 loopar färgad blå (α-kedja) och orange (β-kedjan) och peptiden i grönt. (B) Modellen för A2-YLE medpeptiden färgade mörkgrön. (C) Modellen för A2-YLE-3A med färgade peptid apelsin (för A2-YLE-3A, fanns 2 molekyler i asymmetrisk enhet, men dessa var i stort sett identiska med avseende på utelämna och densitetskartor, så bara kopiera en visas här). (D) Modellen för A2-YLE-5A med peptiden rosafärgad. Återgivet med tillstånd från 31 referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Översikt över Pmel 17 TCR i komplex med A2-YLE-9V. (A) tecknad representation av Pmel 17 TCR-A2-YLE-9V-komplexet. TCR är färgad svart; TCR CDR öglor visas (röd, CDR1α, mörkgrön, CDR2α, blå, CDR3α, gul, CDR1β, aqua, CDR2 ^6 ;; orange, CDR3β); och HLA-A * 0201 är avbildad i grått. YLE-9V peptid representeras av gröna pinnar. (B) Surface och hålla representationer av rester av Pmel 17 TCR CDR-slingor (färgkodade som i A) som kontaktar A2-YLE ytan (A2, grå, YLE-9V, gröna pinnar). Den svarta diagonal linje indikerar korsningsvinkeln hos TCR med avseende på den långa axeln av YLEPGPVTV peptiden (46,15 °). (C) Kontakta fotavtryck i Pmel 17 TCR på A2-YLE-9V yta (A2, grå); lila och grönt (yta och pinnar) visar HLA-A * 0201 och YLE rester respektive kontaktade av gp100 TCR. Cut-off av 3,4 Å för vätebindningar och 4 Å för van der Waals-kontakter. Återgivet med tillstånd från referens 31. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

"Bild Figur 3: Termodynamisk analys av Pmel 17 TCR-A2-YLE Interaction. (A) Pmel 17 TCR jämviktsbindande svar på A2-YLE på 5, 12, 18, 25, och 37 ° C över nio till tio TCR serieutspädningar. SPR råa och inbyggda uppgifter (förutsatt att 1: 1 Langmuir bindning) visas i infällda varje kurva och användes för att beräkna K på och Koff-värden med hjälp av en global passningsalgoritm (BIAevaluation 3,1). Tabellen visar jämviktsbindande (K D (E)) och kinetiska bindande konstanter (K D (K) = Koff / K på) vid varje temperatur. Jämviktsbindningskonstanten (K D, pm) värden beräknas med hjälp av en icke-linjär passning (y = (P1X) / (P2 + x)). (B) De termodynamiska parametrar beräknades enligt Gibbs-Helmholtz ekvation (AG ° = AH ° - TΔS °). Bindningsfria energi, AG ° (AG ° = -RTlnK D), plottades mot temperatur (K) med användning av en icke-linjär regression för att passa tre-parameterekvation (y = AH ° + ACp ° * (x-298) -x * AS ° -x * ACp ° * ln (x / 298)). Entalpi (AH °) och entropi (TΔS °) vid 298 K (25 ° C) visas i kcal / mol och beräknades genom icke-linjär regression av temperatur (K) avsatt mot den fria energin (AG °). (C) Isotermiska kalorimetrisk titrering (ITC) mätningar för Pmel 17 TCR-A2-YLE interaktion. Entalpi (AH °) och entropi (TΔS °) vid 298 K (25 ° C) visas i kcal / mol. Återgivet med tillstånd från 31 referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
ong> Figur 4: Pmel 17 CDR-loopar Fokus på peptidrester Pro4, Val7 och Thr8. (A) Schematisk bild av kontakterna mellan YLE-9V-peptid och Pmel 17 CDR slingrester (färgkodade som i figur 2A). Numren på botten av panelen visar totala kontakter mellan TCR och peptiden. (B) Kontakterna mellan Pmel 17 TCR och YLE-9V peptid (gröna pinnar) visar van der Waals-kontakter (svart streckade linjer) och vätebindningar (röda streckade linjer) som gjorts av TCR CDR3α (blå), CDR1β (gul) , CDR2β (aqua), och CDR3β (orange) loopar. I den nedre panelen är en nära bild av kontakterna mellan YLE Pro4, Val7 och Thr8, respektive, och TCR CDR slingrester (sticks färgkodade som i figur 1A). Cut-off av 3,4 Å för vätebindningar och 4 Å för van der Waals-kontakter. Återgivet med tillstånd från 31 referens.rge.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Conformational Jämförelse av YLE, YLE-3A, och A2-YLE-5A peptider som presenteras av HLA-A * 0201. (A) YLE (mörkgröna käppar) och YLE-3A (Orange pinnar) peptid uppriktning genom överlagring av HLA-A * 0201 α1 helix (grå tecknad film). Boxed rester indikerar mutationen av Glu3 till en alanin. Inläggningar visar hur Glu3Ala substitutionen orsakar en förskjutning i position (svart pil) till nästan rest Pro4 i A2-YLE-3A struktur jämfört med A2-YLE struktur. (B) YLE (mörkgröna pinnar) och YLE-5A (rosa pinnar) peptid uppriktning genom överlagring av HLA-A * 0201 α1 helix (grå tecknad film). De inramade resterna indikerar mutationen glycin 5 till en alanin. Återgivet med tillstånd från referens Klicka här för att se en större version av denna siffra.

TCR CDR1α CDR2α CDR3α CDR1β CDR1β CDR1β
Pmel 17 DSAIYN IQSSQRE CAVLSSGGSNYKLTFG SGHTA FQGTGA CASSFIGGTDTQYFG
gp100 TSINN IRSNERE CATDGDTPLVFG LNHDA SQIVND CASSIGGPYEQYFG
KALYS LLKGGEQ CGTETNTGNQFYFG SGHDY FNNNVP CASSLGRYNEQFFG
296 DSASNY IRSNVGE CAASTSGGTSYGKLTFG MNHEY SMNVEV CASSLGSSYEQYFG

Tabell 1: Anpassning av TCR CDR3 Regioner Pmel 17, gp100, MPD och 296 gp100 specifika TCR. Återgivet med tillstånd från 31 referens.

peptidsekvens peptid Pmel 17 TCR TRAV21 TRBV7-3 Affinity K D gp100 TCR TRAV17 TRBV19 Affiskaps K D
YLEPGPVTA YLE 7,6 ± 2 ^ M 26,5 ± 2,3 pM
YLEPGPVT V YLE-9V 6,3 ± 1,2 ^ M 21,9 ± 2,4 pM
En LEPGPVTA YLE-1A 15,9 ± 4,1 pM 60,6 ± 5,4 pM
YL A PGPVTA YLE-3A Ingen bindning Ingen bindning
YLE A GPVTA YLE-4A 19,7 ± 1,3 pM 144.1 ± 7,8 ^ M
YLEP A PVTA YLE-5A > 1 mM > 1 mM
YLEPG A VTA YLE-6A 11,4 ± 2,7 pM 954,9 ± 97,8 ^ M YLEPGP A TA YLE-7A 31,1 ± 4 | iM 102,0 ± 9,2 ^ M
YLEPGPV A A YLE-8A 38,1 ± 7,4 pM 121,0 ± 7,5 ^ M

Tabell 2: Affinity Analysis (Kd) av Pmel 17 TCR och gp100 TCR till gp100 280-288 peptidvarianter. Återgivet med tillstånd från 31 referens.

parametrar Pmel 17 TCR-A2-YLE-9V A2-YLE A2-YLE-3A A2-YLE-5A
PDB kod </ Strong> 5EU6 5EU3 5EU4 5EU5
datamängds statistik
rymdgrupp P1 P1 21 1 P1 P1 21 1
Enhetscellparametrar (Å) a = 45,52, b = 54,41, c = 112,12, a = 85,0 °, b = 81,6 °, g = 72,6 ° a = 52,81, b = 80,37, c = 56,06, b = 112,8 ° a = 56,08, b = 57,63, c = 79,93, a = 90,0 °, b = 89,8 °, g = 63,8 ° a = 56,33, b = 79,64, c = 57,74, b = 116,2 °
En strålningskälla DIAMOND I03 DIAMOND I03 DIAMOND I02 DIAMOND I02
Våglängd (Å) 0,9763 0,9999 0,9763 0,9763
Measuröd upplösningsområde (Å) 51,87-2,02 45,25 till 1,97 43,39-2,12 43,42-1,54
Yttre resolution Shell (Å) 2,07-2,02 2,02-1,97 2,18-2,12 1,58-154
reflektion observeras 128191 (8955) 99442 (7056) 99386 (7463) 244577 (17745)
unika reflektioner 64983 (4785) 30103 (2249) 49667 (3636) 67308 (4962)
Fullständighet (%) 97,7 (96,7) 98,5 (99,3) 97,4 (96,7) 99,6 (99,9)
Mångfald 2,0 (1,9) 3,3 (3,1) 2,0 (2,1) 3,6 (3,6)
I / Sigma (I) 5,5 (1,9) 7,2 (1,9) 6,7 (20,3) 13 (2,3)
Rpim (%) 5,7 (39,8) 8,8 (44,7) 8,7 (41,6) 4,5 (35,4)
R merge (%) 7,8 (39,6) 9,8 (50,2) 8,7 (41,6) 5,0 (53,2)
förfining statistik
Upplösning (Å) 2,02 1,97 2,12 1,54
Inga reflexer som används 61688 28557 47153 63875
Ingen reflektion i Rfree set 3294 1526 2514 3406
R krist (ingen cut-off) (%) 18,1 19,7 17,2 17,0
R gratis 22,2 25,5 210,1 20,1
Rms avvikelse från ideal geometri
Bindningslängder (Å) 0,018 (0,019) * 0,019 (0,019) * 0,021 (0,019) * 0,018 (0,019) *
Bindningsvinklar (°) 1,964 (1,939) * 1,961 (1,926) * 2,067 (1,927) * 1,914 (1,936) *
Totalt samordna fel (Å) 0,122 0,153 0,147 0,055
Ramachandran Statistik
mest gynnad 791 (96%) 371 (98%) 749 (99%) 384 (98%)
Tillåten 32 (4%) 6 (2%) 10 (1%) 5 (1%)
Extremvärden 2 (0%) 3 (1%) 1 (0%) 2 (0%)

Tabell 3: Data begränsning och förbättring statistik (molekylär ersättning). Återgivet med tillstånd från 31 referens. Värden inom parentes är för den högsta upplösningen skal.

Tyr1 OH
HLA / peptidrest TCR rest No. VDW (≤4Å) Nej H-obligationer (≤3.4Å)
Gly62 αGly98 3
αSer99 1
Arg65 αSer99 2
Arg65 O αAsn100 Nδ2 2 1
Arg65 NH1 βAsp58 Oδ2 1
βSer59 8
Lys66 αGly98 1
αSer99 4
αAsn100 4
Ala69 αAsn100 2
βAla56 2
Gln72 Nε2 βGln51 O 3 1
βGly54 7
βAla55 1
Thr73 βGln51 1
Val76 βGln51 3
βGly52 2
Lys146 βPhe97 3
βIle98 3
Ala150 βIle98 1
βAsp102 3
Val152 βIle98 1
Glu154 αTyr32 1
Gln155 N αTyr32 OH 4 1
Gln155 Oε1 βThr101 N 10 1
αGly97 O 1 1
αGly98 1
αSer96 1
Glu3 αTyr101 1
Pro4 αSer96 1
αSer99 1
αAsn100 4
Pro4 O αTyr101 N 14 1
Gly5 αTyr101 3
βGly100 2
Val7 βIle98 7
βGly99 2
βGly100 2
Thr8 βThr31 5
βGln51 1
βPhe97 1
Thr8 N βIle98 O 6 1

Tabell 4: Pmel 17 TCR-A2-YLE-9V Kontakt tabell. Återgivet med tillstånd från 31 referens.

Discussion

Protokollen som beskrivs här ger en ram för molekylära och cellulära dissektion av T-cellsvar i samband med någon mänsklig sjukdom. Även cancer var i fokus för denna studie har vi använt mycket likartade metoder för att undersöka T-cellsvar mot virus 32, 33, 34, 35, 36, 37 och under autoimmunitet 38, 39, 40. Dessutom har vi använt dessa tekniker mer allmänt att förstå de molekylära principer som styr T-cellsantigenigenkänning 2, 19, 41, 42. Faktum är att det oförutsägbara ändringar peptidrester, även deutanför av TCR kontaktrester, har effekter T-celligenkänning viktiga implikationer för utformningen av heteroclitic peptider. Dessa upptäckter har direkt bidragit till utvecklingen av nya T-cellterapi, inklusive peptidvacciner 6, 43 och artificiella hög affinitet TCR 3, 4, 5, 20, 44, samt förbättrade diagnostik 45, 46, 47.

Kritiska steg i protokollet
Genereringen av en i hög grad ren, funktionellt protein är väsentlig för alla de metoder som beskrivs i detta dokument.

Ändringar och felsökning
Svårigheter att generera mycket rent protein ofta avser uttryck för starkt-Pure, olösligt IB från E. coli-expressionssystem. Vanligtvis modifiering av uttrycket protokoll (t.ex. inducera vid olika optiska tätheter, med olika E. coli-stammar, eller med hjälp av olika medier formationer) löser dessa frågor.

Begränsningar av tekniken
Dessa tekniker använder lösliga proteinmolekyler (TCR och pHLA) som normalt uttrycks på cellytan. Därför är det viktigt att se till att de strukturella / biofysiska resultat överensstämmer med cellulära metoder för att bekräfta biologisk betydelse.

Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Genom att använda röntgenkristallografi och biofysik underbyggda genom funktionell analys, har vi och andra har visat att TCR specifik för cancer epitoper i allmänhet kännetecknas av låga bindningsaffiniteter 48. Denna låga TCR affinitet kan hjälpa till att förklara varför T-celler are inte naturligt effektiv på att rensa cancer. Högupplösta atom strukturer av komplex mellan anti-cancer TCR och besläktade tumörantigener börjar att avslöja den molekylära grunden för denna svaga affinitet. Dessutom är dessa studier är användbara för att bestämma de mekanismer som ligger bakom de terapeutiska ingripanden som utformats för att lösa detta problem, sådd framtida förbättringar 16. I denna studie undersökte vi den första strukturen av en naturligt förekommande αβTCR i komplex med en gp100 HLA-A * 0201-begränsade melanom epitop. Strukturen i kombination med en fördjupad biofysikalisk undersökning visade den totala bindningsläget för interaktion. Vi avslöjade också en oväntad molekylbrytare, som inträffade i en muterad form av peptiden, som upphävde TCR bindning (bedömas med hjälp av ytplasmonresonans) och CD8 + T-celligenkänning (funktionella experiment). Det var endast möjligt att demonstrera den nya mekanismen för HLA-antigen presentatipå att använda de högupplösta beskrivna metoderna.

Framtida tillämpningar eller riktningar efter att behärska denna teknik
Sammantaget våra resultat visar kraften i röntgenkristallografi och biofysikaliska metoder i kombination med robusta funktionella analyser. Med användning av dessa metoder är det möjligt att dissekera ut exakta molekylära mekanismer som reglerar T-cellantigenigenkänning. I själva verket är det också möjligt att använda denna metod för att lösa strukturen av oligerat TCR, visar hur konformationsförändringar kan spela en roll under antigen diskriminering 49, 50, 51. En bättre förståelse av den mycket komplicerade och dynamiska karaktär som ligger till grund TCR-pHLA interaktioner har också uppenbara konsekvenser för terapi design. Att kunna direkt "se" de molekyler som håller på att terapeutiskt riktade, liksom effekten att modifikationer har på antigen recognition, helt klart kommer att förbättra utvecklingen av dessa läkemedel framöver. I denna studie visar vi att till och med förändringar i ett enda peptidrest som inte är kraftigt anlitas av en TCR oförutsägbart kan överföra strukturella ändringar av andra rester i HLA-bunden peptid, vilket i sin tur förändrar dramatiskt T-celligenkänning. En mer fullständig förståelse av de molekylära mekanismer som under T-cellsantigenigenkänning blir enormt fördelaktigt när man utformar framtida terapier för ett brett spektrum av mänskliga sjukdomar.

Acknowledgments

BM stöds av en cancerforskning UK doktorand. AG stöds av ett Life Science Research Network Wales doktorand. VB stöds av en Cancer Research Wales doktorand. DKC är en Wellcome Trust Research karriärutvecklings Fellow (WT095767). AKS är en Wellcome Trust Investigator. GHM finansieras av en gemensam Life Science Research Network Wales och Tenovus Cancer Care doktorand. Vi tackar personalen på Diamond Light Source för tillhandahållande av anläggningar och stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S.O.C. media Invitrogen
Orbi-Safe New Orbit incubator Sanyo
carbenicillin  Sigma
IPTG  Fisher
Quick Coomassie Stain SafeStain  Generon
Legend RT centrifuge  Sorvall
Tris  Fisher
magnesium chloride  Arcos
NaCl  Fisher
glycerol  Sigma-Aldrich
Sonopuls HD 2070  Bandelin
DNAse  Fisher
Triton Sigma-Aldrich
EDTA  Fisher
guanidine  Fisher
NanoDrop ND1000  Thermo
Peptides Peptide Protein Research
dithiothreitol  Sigma-Aldrich
L-arginine  SAFC
cysteamine  Fisher
cystamine  Fisher
dialysis tubing  Sigma-Aldrich
urea  Sigma-Aldrich
Metricel 0.45 μm membrane filter Pall
POROS 10/100 HQ  Applied biosystems
ÄKTA pure FPLC system  GE Healthcare Life Sciences
10 kDa MWCO Vivaspin 20  Sartorius
10 kDa MWCO Vivaspin 4  Sartorius
Superdex 200 10/300 GL column  GE Healthcare Life Sciences
Phosphate Buffer Saline  Oxoid
BIAcore buffer HBS  GE Healthcare Life Sciences
Biotinylation kit Avidity
BIAcore T200 GE Healthcare Life Sciences
CM5 chip coupling kit GE Healthcare Life Sciences
streptavidin  Sigma-Aldrich
Microcal VP-ITC  GE Healthcare Life Sciences
Hepes  Sigma-Aldrich
Gryphon crystallisation robot Art Robbins Instruments
Intelli-plate  Art Robbins Instruments
Crystallisation screens and reagents Molecular Dimensions
75 cm2 flask  Greiner Bio-One
0.22 μm filters Miller-GP, Millipore
Ultra-Clear ultracentrifuge tube  Beckman Coulter
Optima L-100 XP with SW28 rotor Beckman Coulter
CD8 microbeads  Miltenyi Biotec
anti-CD3/CD28 Dynabeads  Invitrogen
anti-PE microbeads  Miltenyi Biotec
CK medium, PHA Alere Ltd
anti-TCRVβ mAb  BD
dasatinib  Axon
MIP-1β and TNFα ELISA  R&D Systems
 51Cr  PerkinElmer
1450 Microbeta counter PerkinElmer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aleksic, M., Liddy, N., et al. Different affinity windows for virus and cancer-specific T-cell receptors: implications for therapeutic strategies. European journal of immunology. 42 (12), 3174-3179 (2012).
  2. Cole, D. K., Pumphrey, N. J., et al. Human TCR-binding affinity is governed by MHC class restriction. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 178 (9), 5727-5734 (2007).
  3. Cole, D. K., Sami, M., et al. Increased Peptide Contacts Govern High Affinity Binding of a Modified TCR Whilst Maintaining a Native pMHC Docking Mode. Frontiers in immunology. 4 (JUN), 168 (2013).
  4. Raman, M. C. C., Rizkallah, P. J., et al. Direct molecular mimicry enables off-target cardiovascular toxicity by an enhanced affinity TCR designed for cancer immunotherapy. Scientific reports. 6, 18851 (2016).
  5. Liddy, N., Bossi, G., et al. Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nature medicine. 18 (6), 980-987 (2012).
  6. Cole, D. K., Edwards, E. S. J., et al. Modification of MHC anchor residues generates heteroclitic peptides that alter TCR binding and T cell recognition. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 185 (4), 2600-2610 (2010).
  7. Parkhurst, M. R., Salgaller, M. L., et al. Improved induction of melanoma-reactive CTL with peptides from the melanoma antigen gp100 modified at HLA-A*0201-binding residues. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (6), 2539-2548 (1996).
  8. Salgaller, M. L., Marincola, F. M., Cormier, J. N., Rosenberg, S. A. Immunization against epitopes in the human melanoma antigen gp100 following patient immunization with synthetic peptides. Cancer research. 56 (20), 4749-4757 (1996).
  9. Cameron, B. J., Gerry, A. B., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science translational medicine. 5 (197), 197ra103 (2013).
  10. Linette, G. P., Stadtmauer, E. A., et al. Cardiovascular toxicity and titin cross-reactivity of affinity-enhanced T cells in myeloma and melanoma. Blood. 122 (6), 863-871 (2013).
  11. Miles, K. M., Miles, J. J., Madura, F., Sewell, A. K., Cole, D. K. Real time detection of peptide-MHC dissociation reveals that improvement of primary MHC-binding residues can have a minimal, or no, effect on stability. Molecular immunology. 48 (4), 728-732 (2011).
  12. Lesterhuis, W. J., Schreibelt, G., et al. Wild-type and modified gp100 peptide-pulsed dendritic cell vaccination of advanced melanoma patients can lead to long-term clinical responses independent of the peptide used. Cancer immunology, immunotherapy CII. 60 (2), 249-260 (2011).
  13. Speiser, D. E., Baumgaertner, P., et al. Unmodified self antigen triggers human CD8 T cells with stronger tumor reactivity than altered antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (10), 3849-3854 (2008).
  14. Schaft, N., Willemsen, R. A., et al. Peptide fine specificity of anti-glycoprotein 100 CTL is preserved following transfer of engineered TCR alpha beta genes into primary human T lymphocytes. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 170 (4), 2186-2194 (2003).
  15. Schaft, N., Coccoris, M., et al. An Altered gp100 Peptide Ligand with Decreased Binding by TCR and CD8α Dissects T Cell Cytotoxicity from Production of Cytokines and Activation of NFAT. Frontiers in immunology. 4 (SEP), 270 (2013).
  16. Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. Structural basis for ineffective T-cell responses to MHC anchor residue-improved "heteroclitic" peptides. European journal of immunology. 45 (2), 584-591 (2015).
  17. Boulter, J. M., Glick, M., et al. Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics. Protein engineering. 16 (9), 707-711 (2003).
  18. Garboczi, D. N., Utz, U., et al. Assembly, specific binding, and crystallization of a human TCR-alphabeta with an antigenic Tax peptide from human T lymphotropic virus type 1 and the class I MHC molecule HLA-A2. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 157 (12), 5403-5410 (1996).
  19. Madura, F., Rizkallah, P. J., et al. T-cell receptor specificity maintained by altered thermodynamics. Journal of Biological Chemistry. 288 (26), 18766-18775 (2013).
  20. Cole, D. K., Rizkallah, P. J., et al. Computational design and crystal structure of an enhanced affinity mutant human CD8 alphaalpha coreceptor. Proteins: Structure, Function and Genetics. 67 (1), 65-74 (2007).
  21. Benvenuti, M., Mangani, S. Crystallization of soluble proteins in vapor diffusion for x-ray crystallography. Nature protocols. 2 (7), 1633-1651 (2007).
  22. Leslie, A. G. W., Powell, H. R., et al. Automation of the collection and processing of X-ray diffraction data - a generic approach. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (11), 1924-1928 (2002).
  23. Kabsch, W. Xds. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  24. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  25. Bailey, S. N. Collaborative Computational Project, N. 4. The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (5), 760-763 (1994).
  26. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  27. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (12 I), 2126-2132 (2004).
  28. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 53 (3), 240-255 (1997).
  29. DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphics System. Schrödinger LLC. 1, Available from: http://www.pymol.org (2000).
  30. Rudolph, M. G., Stanfield, R. L., Wilson, I. A. How Tcrs Bind Mhcs, Peptides, and Coreceptors. Annual Review of Immunology. 24 (1), 419-466 (2006).
  31. Bianchi, V., Bulek, A., et al. A Molecular Switch Abrogates Glycoprotein 100 (gp100) T-cell Receptor (TCR) Targeting of a Human Melanoma Antigen. Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8951-8959 (2016).
  32. Matthews, P. C., Koyanagi, M., et al. Differential clade-specific HLA-B*3501 association with HIV-1 disease outcome is linked to immunogenicity of a single Gag epitope. Journal of virology. 86 (23), 12643-12654 (2012).
  33. Gostick, E., Cole, D. K., et al. Functional and biophysical characterization of an HLA-A* 6801-restricted HIV-specific T cell receptor. European Journal of Immunology. 37 (2), 479-486 (2007).
  34. Miles, J. J., Bulek, A. M., et al. Genetic and structural basis for selection of a ubiquitous T cell receptor deployed in Epstein-Barr virus infection. PLoS Pathogens. 6 (11), e1001198 (2010).
  35. Holland, C. J., Rizkallah, P. J., et al. Minimal conformational plasticity enables TCR cross-reactivity to different MHC class II heterodimers. Scientific reports. 2, 629 (2012).
  36. Kløverpris, H. N., Cole, D. K., et al. A molecular switch in immunodominant HIV-1-specific CD8 T-cell epitopes shapes differential HLA-restricted escape. Retrovirology. 12, 20 (2015).
  37. Motozono, C., Kuse, N., et al. Molecular Basis of a Dominant T Cell Response to an HIV Reverse Transcriptase 8-mer Epitope Presented by the Protective Allele HLA-B*51:01. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 192 (7), 3428-3434 (2014).
  38. Motozono, C., Pearson, J. A., et al. Distortion of the major histocompatibility complex class i binding groove to accommodate an insulin-derived 10-mer peptide. Journal of Biological Chemistry. 290 (31), 18924-18933 (2015).
  39. Cole, D. K., Bulek, A. M., et al. Hotspot autoimmune T cell receptor binding underlies pathogen and insulin peptide cross-reactivity. The Journal of clinical investigation. , (2016).
  40. Bulek, A. M., Cole, D. K., et al. Structural basis for the killing of human beta cells by CD8(+) T cells in type 1 diabetes. Nature immunology. 13 (3), 283-289 (2012).
  41. Ekeruche-Makinde, J., Clement, M., et al. T-cell receptor-optimized peptide skewing of the T-cell repertoire can enhance antigen targeting. Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37269-37281 (2012).
  42. Cole, D. K., Miles, K. M., et al. T-cell Receptor (TCR)-peptide specificity overrides affinity-enhancing TCR-major histocompatibility complex interactions. Journal of Biological Chemistry. 289 (2), 628-638 (2014).
  43. Cole, D. K., Gallagher, K., et al. Modification of the carboxy-terminal flanking region of a universal influenza epitope alters CD4+ T-cell repertoire selection. Nature communications. 3, 665 (2012).
  44. Varela-Rohena, A., Molloy, P. E., et al. Control of HIV-1 immune escape by CD8 T cells expressing enhanced T-cell receptor. Nature medicine. 14 (12), 1390-1395 (2008).
  45. Holland, C. J., Dolton, G., et al. Enhanced Detection of Antigen-Specific CD4+ T Cells Using Altered Peptide Flanking Residue Peptide-MHC Class II Multimers. The Journal of Immunology. 195 (12), 5827-5836 (2015).
  46. Wooldridge, L., Clement, M., et al. MHC class I molecules with Superenhanced CD8 binding properties bypass the requirement for cognate TCR recognition and nonspecifically activate CTLs. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 184 (7), 3357-3366 (2010).
  47. Laugel, B., Den Berg, H. A. V. an, et al. Different T cell receptor affinity thresholds and CD8 coreceptor dependence govern cytotoxic T lymphocyte activation and tetramer binding properties. Journal of Biological Chemistry. 282 (33), 23799-23810 (2007).
  48. Bridgeman, J. S., Sewell, A. K., Miles, J. J., Price, D. A., Cole, D. K. Structural and biophysical determinants of αβ T-cell antigen recognition. Immunology. 135 (1), 9-18 (2012).
  49. Willcox, B. E., Gao, G. F., et al. TCR binding to peptide-MHC stabilizes a flexible recognition interface. Immunity. 10 (3), 357-365 (1999).
  50. Borbulevych, O. Y., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational melding permits a conserved binding geometry in TCR recognition of foreign and self molecular mimics. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 186 (5), 2950-2958 (2011).
  51. Armstrong, K. M., Piepenbrink, K. H., Baker, B. M. Conformational changes and flexibility in T-cell receptor recognition of peptide-MHC complexes. The Biochemical journal. 415 (2), 183-196 (2008).

Tags

Immunologi CD8 + T-celler T-cellreceptor (TCR) peptid-HLA-antigen (pHLA) ytplasmonresonans röntgenkristallografi cancer gp100 melanom heteroclitic peptider
Med användning av röntgenkristallografi, Biophysics, och Funktionella analyser för att bestämma de mekanismer som styr T-cellsreceptorigenkänning of Cancer Antigens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

MacLachlan, B. J.,… More

MacLachlan, B. J., Greenshields-Watson, A., Mason, G. H., Schauenburg, A. J., Bianchi, V., Rizkallah, P. J., Sewell, A. K., Fuller, A., Cole, D. K. Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens. J. Vis. Exp. (120), e54991, doi:10.3791/54991 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter