Introduction
심근 핵 및 세포주기 상태의 정확한 식별은 심근 회전율 및 재생의 판정을위한 매우 중요하다. 이것은 세포주기 활동을 식별하기위한 예컨대 pHH3, 기 - (67) 또는 티미 딘 유사체 핵 마커의 사용에 특히 그러하다. 성인 포유 동물 심근 세포의 증식 능력은 (1), 증식 분석의 결과에 중요한 차이를 만들 수있는 심근 핵의 확산 마커에 대한 긍정적 인 핵의 잘못된 식별 매우 작은 때문이다. 또한, 심근 배수체 및 다핵 세포가 아닌 세포 분열 될 같은 endoreduplication acytokinetic과 같은 유사 분열 세포주기의 변동,되기 쉽다. 이를 위해, 일반적인 세포주기 마커에 대한 항체 염색의 해석은 모든 경우에 결정적인 아니다.
여기, 우리는 직선 forwa을위한 방법을 제시 RD 마우스 심근의 인식과 핵의 명확한 식별하여 출생 후의 성인 단계에서 기본 절연 세포와 두께의 조직 절편에서의 nuclearity. 그 목적을 위해, Myh6 프로모터 (Myh6-H2B-MCH)의 제어하에 인간 히스톤 H2B mCherry과의 융합 단백질의 심근 특이 식 트랜스 제닉 마우스는 2 라인을 사용 하였다. eGFP는-anillin 융합 단백질의 발현이 CMV 인핸서와 유비쿼터스 닭 액틴 프로모터의 제어하에있는 형질 전환 증식 지표 마우스 선이 마우스 라인을 교배 (CAG-eGFP는-anillin)는 허용 세포주기 상태를 결정. 스캐 폴딩 단백질 anillin 특히 활성 셀 3 세포주기에서 발현하고, 세포주기 동안 그 차이 세포 내 지역화 M 위상의 고해상도 실시간 추적 세포주기 진행을 허용EF "> 4. 따라서, 이중 형질 전환 쥐 심근 세포 증식 및 세포주기 변동을 겪는 것과 구별하기 위해 사용될 수있다.이 시험 관내 증식을 유도하는 물질의 스크리닝에 유용 증명한다.
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Protocol
동물을 포함하는이 프로토콜의 모든 절차는 본 대학의 윤리적 기준에 따라되었고 과학적인 목적으로 사용되는 동물의 보호에 관한 지침 2010 유럽 의회 / 63 / EU의 가이드 라인을 준수.
출생 후 심근 세포의 세포주기 활동의 체외 시각화 1.
- 출생 후 심근 해리
- 사전 실험 준비
- 배양 배지 (IMDM, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % 비 필수 아미노산, 0.1 % β 메르 캅토 에탄올)을 준비한다; 매체 (1) : 2 % FCS를 추가; 매체 (2) : 20 % FCS를 추가합니다.
- 코트를 96 웰 배양 접시 (반 성장 면적 : 15mm 2) PBS 용액에서 0.1 % 젤라틴.
- 심장의 해부
- PBS의 15 mL의 페트리 접시를 준비하고 얼음에 보관합니다. 마른 유리 구슬 살균기에서 그들을 넣어 두 족집게와 작은 가위를 소독. 잘린 신생아 형질 전환 마우스 (CAG-eGFP는-anillin / Myh6-H2B-MCH)를 희생. , 흉부를 열고 Ehler 등의 알에 설명 된대로 마음을 해부하다. 2013 년 (J 비스 특급; (79) :. 50154 도이 : 10.3791 / 50,154), 그리고 얼음처럼 차가운 PBS로 전송할 수 있습니다. 다음 마우스로 이동합니다.
- 비 동형 접합 번식 쌍을 사용하는 경우, 형광 현미경으로 형질 전환 마음을 확인합니다. 형광 현미경 PBS의 마음을 넣습니다. eGFP는-anillin 발현 확인 (예 : 488 nm의, 엠 : 509 ㎚) 및 H2B-MCH 표현 (예 : 587 nm의, 엠 : 610 ㎚) 적절한 필터 세트와 함께합니다.
- 심근 분리
- 신생아 심장 분리 키트를 이용하여 상기 선택된 하트 해리. 5 분 동안 37 ℃에서 혼합 한 효소를 인큐베이션. 최종 효소 믹스 1 ㎖를 얻을 효소 믹스 (2) 55 μL에 효소 믹스 (1) 945 μL를 추가합니다.
- 1.5 ML의 연구에 P6 마우스 - 2 P4에서 마음에 P3 마우스 또는 최대 - 4 P1에서 마음까지 이동eaction 효소 혼합 한 용액을 포함하는 튜브와 가위와 작은 조각으로 마음을 잘라. 15 mL의 반응 튜브에 솔루션을 전송합니다.
- 15 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 조직과 효소의 접촉을 극대화하기 위해, 인큐베이터에 거의 수평으로 15 ㎖의 튜브를 넣어. 5 mL를 피펫으로 위 아래로 10 회 - 5 피펫 팅하여 섞는다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
- 효소 반응을 정지 매체 (2) (20 % FCS)의 7.5 mL를 넣고. 70 μm의 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액을 필터. 매체 (2) 3 mL를 셀 스트레이너를 씻어.
- 15 분 동안 300 × g에서 세포 현탁액을 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. 매체 (1) 500 μL에 펠렛을 재현 탁; 적혈구 세포 용해는 또한 실험에 요구되지 않는다. 피펫 10 세포 계수 챔버로 세포 현탁액 μL 세포의 수를 결정한다.
- 씨앗 매체 (1) 120 μL (2 % FCS)가 잘 10,000 세포 : 96 웰 플레이트하십시오. 장소인큐베이터에 세포 (37 ℃, 5 % CO 2) 형질 즉시 진행.
- 사전 실험 준비
- siRNA를 또는의 miRNAs와 신생아 심근 세포의 형질
- RNases을 제거 된 RNase의 오염 제거 용액 함께 벤치를 닦아주십시오. 의 RNase의 오염 제거 용액 다음과 같은 물질을 청소 : 10 μL, 100 μL, 200-μL 피펫과 얼음 상자를. 얼음 해동의 siRNA 재고 씩 (100 μM).
- 감소 된 혈청 배지 (감소 혈청 배지 + 2 μL siRNA를 100 μM 주식의 98 μL)에시 /의 miRNAs의 2 μM 작업 주식을 준비합니다. 작업 주식은 당일 사용되어야한다. 냉동하지 않는 것이 좋습니다.
- (; ~ 57 nm의 140 μL에 최종시 / miRNA의 농도 한 96 웰에 대한 양) 0.5 mL의 반응 관으로 감소 혈청 배지 6 μL에 2 μM 주식의 4 μL를 추가합니다. 특정시 / miRNA의 형질되는 우물의 수에 대한 적절한 볼륨을 선택합니다.
- 트랜 시약의 마스터 믹스를 준비합니다. 10 μL 각 웰에 대한 (형질 전환 시약 감소 된 혈청 배지 + 9.4 μL의 0.6 μL를) (96 우물 총)를 사용합니다.
- 는 SI를 추가 / miRNA의는 형질 전환 시약 믹스에 혼합한다. 얼음에 5 분 동안 품어. 각 웰에 피펫 20 μL. 37 ° C에서 48 시간 5 % CO 2 세포를 배양 한 후 24 시간 이상 후 매체 (1) 120 μL 잘 각 매체를 대체, 고정 및 면역 형광 염색을 진행합니다.
- 고정 및 면역 형광 염색법
- 배지를 제거하고 PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. 20 분간 4 % 포름 알데히드 용액으로 세포를 커버. 포름 알데히드 용액을 벗고 PBS로 한 번 세포를 세척 한 다음 저장을 위해 PBS로를 덮거나 면역 염색을 진행합니다.
- 적어도 2 시간 동안 0.2 % 트리톤-X 5 % 당나귀 혈청 (제조업체의 지침에 따라 농도) 차 항체와 함께 품어.(: 모노클로 날 안티 α-티닌 (400) 희석 1) 밤새 4 ° C에서, 얼룩 α-티닌을 위해 염색하는 경우.
- 차 항체를 제거하고 PBS로 3 회 세척한다. (400) 및 빛으로부터 보호 RT에서 1 시간 동안 배양 : 훽스트 용액 1 차 항체 희석. PBS 3 회 세척, 항체를 제거하고, 4 ℃에서 저장을위한 PBS로 세포를 다룹니다.
- 공 촛점 비디오 현미경
- 이미지 획득을위한 공 초점 현미경을 사용합니다. 이미징 소프트웨어를 엽니 다. "A1plus 설정"을 열고 채널 1, 채널 2 및 채널 3에 대한 확인란을 선택합니다. 풀다운 메뉴를 클릭하여 CY4에 eGFP는, Cy3에에 CH3, 및 4 장에 DAPI, 채널 2에 채널 1을 설정합니다.
- 각 채널에 대해, HV 클릭하고 슬라이더 막대를 사용하여 80로 설정합니다. 슬라이더 막대를 사용하여 오프셋 0으로 설정하고 홈 위치에 핀홀을 설정하는 '홈'버튼을 클릭합니다. 풀다운 메뉴를 클릭하여 1,024 X 1,024의 스캔 크기를 설정합니다.
- 열 최적화를 클릭"XYZ 크기 설정"창. "제안 단계 (Z)"에서 "완벽한 복셀"확인란을 선택합니다. 사진이 노출 부족이나 과다 노출도가 될 때까지 레이저 강도를 높입니다.
참고 : 예를 들어, 채널 1 (DAPI) : 16 %, 채널 2 (eGFP는) : 12 %, 채널 3 (Cy3에) : 100 %, 4 장 (Cy5에) : 1 %. 0 모든 채널에 대한 오프셋을 설정합니다.
- 20 배 목표 (200X 배율)를 사용하여 사진을 촬영합니다. 타일 이미지로 이루어진 큰 이미지를 스캔 (예를 들어, 3 × 3).
- 이미징 소프트웨어에서 "획득"하고 풀다운 메뉴에서 "큰 이미지를 스캔"을 선택로 이동합니다. 에서 "지역,"3 × 3.에 "X 및 Y 필드의 수"풀다운 메뉴에서 "현재 위치는 왼쪽 상단에 있습니다"하고 설정 선택 "스캔."
- 이미지 획득을위한 공 초점 현미경을 사용합니다. 이미징 소프트웨어를 엽니 다. "A1plus 설정"을 열고 채널 1, 채널 2 및 채널 3에 대한 확인란을 선택합니다. 풀다운 메뉴를 클릭하여 CY4에 eGFP는, Cy3에에 CH3, 및 4 장에 DAPI, 채널 2에 채널 1을 설정합니다.
- 이미지 분석
- H2B-CH 신호 α-티닌 신호를 카운트함으로써 심근 세포의 수를 계수함으로써 심근 핵의 수를 정의한다.
- <리> "측정"을 클릭하고 풀다운 메뉴에서 "수동 측정"을 선택합니다. 다음 풀다운 메뉴에서 "카운트"를 선택합니다. 이에 마킹을 계산, H2B-MCH 신호와 핵을 클릭합니다. α-actinin의 양성 세포에 대해 동일한 작업을 수행하는 심근 세포의 수를 얻을 수 있습니다.
- H2B-CH 신호 α-티닌 신호를 카운트함으로써 심근 세포의 수를 계수함으로써 심근 핵의 수를 정의한다.
- 핵 eGFP는-anillin 신호 (eGFP는-anillin + / H2BmCh + 핵)와 S / G2 위상 심근를 계산합니다. "측정"을 클릭하고 풀다운 메뉴에서 "수동 측정"을 선택합니다. 다음 풀다운 메뉴에서 "카운트"를 선택합니다. 그들을 클릭하여 eGFP는-anillin 신호와 H2B-MCH 신호와 마크 핵.
- 이러한 세포질 신호, 수축 링, midbodies 등의 유사 분열 특정 eGFP는-anillin 신호 (예를 들어, 그림 1 층과 G)와 심근를 계산합니다. "측정"을 클릭하고 풀다운 메뉴에서 "수동 측정"을 선택합니다. 다음 PUL에서 "카운트"를 선택ldown 메뉴를 선택합니다. 마크는 그들을 클릭하여 유사 분열 특정 eGFP는-anillin 신호 (예를 들어, 그림 1 층과 G), 세포질 신호, 수축 링, midbodies과 심근.
랑겐 돌프 해리와 두꺼운 조직 섹션에 의해 성인 심근 세포의 핵 2. 결정
- 랑겐 돌프 해리에 의해 성인 심근 세포의 분리
- 심장 절개 전에 준비
- 헤파린 인슐린 주사기 (30 게이지 니들) (20 단위 / g 체중)을 채운다. 목의 목덜미에 의해 마우스를 잡고. 들어 올려 주입을위한 복부를 노출 뒤로 마우스를 켭니다.
- 복강 주사를 수행합니다. 다시 케이지에 헤파린 마우스를 넣고 심장 해부를 시작하기 전에 적어도 15 분을 기다립니다. 헹구고 5로 랑겐 돌프 장치를 환기 - (재관류 버퍼 10 mL를 관류 버퍼 : 135 mM의 NaCl을, 4 밀리미터의 KCl, 1 mM의의 MgCl2, 2.5 mM의 HEPES, 5 mM의 포도당 및 DDH 2 O 25 mM의 BDM은) NaOH로 pH를 7.4로 조정한다.
- 심장의 해부
- 냉장 (4 ℃) PBS로 10 cm 페트리 접시를 준비하고 얼음에 놓습니다. 입력하고 PBS와 캐 뉼러 (20 게이지)에 연결된 1 ML의 주사기를 환기 시키십시오. 페트리 접시의 테두리에 모델링 점토와 캐 뉼러를 수정합니다. 약간 PBS의 표면 아래에 정맥 팁을 놓습니다.
- 자궁 경부 전위로 마우스를 희생. 70 % 에탄올 용액으로 복부를 닦아주십시오. 수술 가위로 흉골 중반 복부에서 절개를합니다. 다이어프램을 제거하고 수술 가위로 양측 흉부를 잘라.
- 리프트와 20 게이지 바늘로 흉골을 수정, 흉강을 열고 조심스럽게 해부 포셉과 마음을 파악. 마음을 들어 올리고 유출 기관의 혈관을 절단하여 폐와 혈관에서 제거합니다.
주 : 대동맥을 식별과 마음을 배치하려면그것의 복부 측면입니다. 이 두 심방 사이의 거리를 감소, 그래서 그 가지와 대동맥은 심방 사이에서 발견 할 수있다. 대동맥의 주요 지점은 아직 충분히 길면 개별 심장 구조에 따라 분기를 제거 할 수있다. - 냉장 PBS를 함유하는 10 cm 페트리 접시에 중심을 전송한다 (단계 2.1.2.1 참조). 조직 손상을 피하기 위해 발진 멀티 툴에 의해 평활화 된 G20x1 ½ 주입 뉼러에 상행 대동맥 당겨 심장 Cannulate. 캐 뉼러에 스레드와 대동맥을 수정합니다. 조심스럽게 주사기 플런저를 눌러 여분의 혈액을 제거하고 PBS로 마음을 씻어. 마음의 약간의 확대는 볼 수 있어야합니다.
- 랑겐 돌프 심장 해리
- 을 Langendorff 관류 장치에서 루어 잠금 어댑터에 신속하게 유관 마음을 연결합니다. 1 방울 / s의 유속으로 5 분 동안 37 ℃에서 산소 관류 완충액 30 ㎖로 심장을 관류. 일즉 유량은 감압 밸브 (0, 200 mbar의 압력 사이의)을 이용하여 랑겐 돌프 장치 내의 O 2 유량을 조절함으로써 구성 될 수있다.
- 6 U 콜라게나 B, 10,000 단위 트립신, 50 μM 염화칼슘 2 관류 버퍼 : 사용하기 전에 즉시 소화 버퍼를 준비합니다. 관류 완충액을 제거하고 (37 ° C) 따뜻한 산소 분해 완충액 30 ㎖를 첨가하여 효소 분해를 시작한다.
주 : 콜라게나 B의 함량은 다른 배치의 활동에 따라 적정 할 필요가있다. - 1 방울 / s의 속도와 흐름을 조정하고 (10)에 대한 마음을 소화 - 13 분. 오염을 방지하기 위해, 다시 유출을 사용하지 마십시오. 소화 버퍼의 5 mL를 10 cm 페트리 접시에 마음을 전송합니다. 포셉 한 쌍의 마음을 잡고 작은 조각으로 마음을 버리고 다른 쌍을 사용하여 집게 수동으로 조직을 해부하다.
주 :이 단계에서, 심방는 소형으로 절단, 분리 될 수있다조각 (홍채 위) 및 절연 심방 세포를 얻기 위해, 37 ℃ 인큐베이터에서 분해 완충액 750 μL에 30 분 동안 분해. 1 ML의 피펫을 사용하여 순수 심방 심근, 피펫 위아래로 몇 번을 얻을 수 있습니다. 정지 용액 750 μL를 첨가하여 효소 반응을 정지. - 정지 용액 5 ㎖ (5 % FBS 및 50 μM와 CaCl2를 관류 완충액)를 첨가하여 분해를 중지. 혈청 학적 피펫을 사용하여, 100 ㎛의 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액을 필터링하고, 50 mL의 원심 분리 튜브에 세포를 수집한다. 실온에서 1 분 동안 80 XG에서 필터링 된 세포 현탁액을 원심 분리기.
- 뜨는을 취소하고 부드럽게 10 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 정지 용액 10 mL에 세포 펠렛을 resuspend. 실온에서 1 분 동안 80 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기.
- 원심 분리에 이어, 상층 액을 버리고 20 % FC와 배지 (IMDM 1 mL에 세포를 재현 탁S, 0.1 mM 비 필수 아미노산, 배양를 50㎍ / ㎖의 페니실린 및 스트렙토 마이신 및 0.1 밀리미터 β 머 캅토 에탄올 각각). 대안 적으로, 세포를 ", 면역 형광 염색법"2.2 단계 및 해결로 진행합니다.
- 적어도 3 시간 동안 37 ℃에서 배양액 500 μL로 24 웰 플레이트에서 24 웰 플레이트 상에 고정 잘 8 μg의 / ㎖ 라미닌 - 코팅 된 커버 슬립에 따라 분리 된 셀 플레이트 만 및 5 % CO 2의 .
- 심장 절개 전에 준비
- 현탁액 랑겐 돌프 - 고립 된 심근 세포에 대한 면역 형광 염색법
- 실온에서 15 분 동안 PBS 중의 4 % PFA 1 ㎖, pH가 7.4을 Langendorff 절연 심근 수정. 실온에서 2 분 동안 800 XG에 세포 현탁액을 원심 고정액을 제거하고 PBS로 두 번 세포를 씻어.
- PBS 1 mL에 고정 된 심근 세포를 재현 탁하고 어느 면역 형광 염색을 진행 또는 당 잘에 PBS 500 μL에 저장4 ℃에서 24 웰 플레이트. 미세 원심 튜브 - (200 ~ 100 μL) 세포 현탁액의 일부를 옮긴다. 실온에서 2 분 동안 800 XG에 세포 현탁액을 원심 분리하고 상층 액을 제거한다.
- Permeabilize 하시려면, 블록 1 희석 차 항체 200㎕를 첨가하여 α-티닌에 대한 일차 항체로 세포를 염색 : 실온에서 1 시간 동안 0.2 % 트리톤 X-100, 5 % 당나귀 혈청 PBS에서 400.
- 실온에서 2 분 동안 800 XG에 원심 분리기와 상층 액을 버린다. 실온에서 2 분 동안 800 XG에 세포 PBS와 펠렛 원심 분리기를 씻으십시오. 1 희석 뜨는을 취소하고 알렉사 - 형석 - 복합 이차 항체의 200 μL (항 - 마우스의 IgG1)에 품어 : 훽스트 (Hoechst) 염료에 400 (솔루션 작업 : 1 μg의 / mL로) 빛으로부터 보호 실온에서 1 시간 동안.
- 실온에서 2 분 동안 800 XG에 원심 분리기와 상층 액을 버린다. 이 단계를 반복합니다. 빛으로부터 샘플을 보호합니다. 아르 자형200 세포를 esuspend - PBS 500 μL, 100 전송 - 현미경 챔버의 웰에 세포 현탁액을 300 μL. 챔버의 뚜껑을 닫고 영상까지 4 ° C에서 세포를 저장합니다. 빛으로부터 보호합니다.
- 랑겐 돌프 절연 심근의 nuclearity 분석
- 250X 확대에 대응하는 25X 목적으로 α-티닌 묻은 심근에서 이미지를 가져 가라. 만 정기적으로 α-티닌으로 얼룩진 전형적인 막대 모양의 형태를 표시하기 때문에 그대로 것으로 가정하는 사람들 심근에 H2B-MCH + 핵의 수를 계산합니다.
- 세 가지 다른 마음에서 적어도 100 심근를 계산합니다. 단핵, 이핵 및 trinuclear 심근의 비율을 계산합니다.
참고 : - trinuclear 세포와 핵의 더 많은 수있는 사람은 랑겐 돌프 절연 심근에서 <1 % (희귀 동안 <, 90 % 일반적으로, 이핵 세포는 약 80를해야한다두꺼운 조각에 3 %). 심방 심근 심실의 심근보다 훨씬 작다. 일반적으로, 단핵 세포는 전체 인구의 90 %를 차지한다.
- 두꺼운 조각에 대한 준비로 분리, 고정, 성인 마음의 냉동 보존
- Heidelberger 연장관 및 제 3 방향 스톱 콕과 3 방향 스톱 콕에 50ml의 주사기를 연결 고정하는 관류 장치를 조립한다. 그 흐름을 통해 중력에 의해 활성화되어있는 방식으로 스탠드에서 주사기를 수정합니다. PBS의 15 mL로 시스템을 채 웁니다.
- 단계 2.1.2.1-2.1.2.4, 따라 "마음의 준비를." 거품없는-PBS 가득한 관류 장치의 루어 잠금 어댑터에 마음으로 G20x1 ½ 주입 정맥을 연결하고 PBS와 함께 관류. 다음 마음을 통해 관류되는 PBS에서 4 % 포름 알데히드의 15 mL를, - 10 시스템을 채 웁니다. 집중 밤새 4 % 포름 알데히드 용액에 마음을 고정합니다.
- 4 % 포름 알데히드를 교체PBS와 솔루션 실온에서 8 시간 동안 150 rpm에서 수평 진탕 기에서 PBS의 마음을 씻는다. 4 ℃에서 밤새 마음을 탈수 20 % 자당 용액으로 PBS를 교환한다.
- 작은 금형에 극저온 포함 매체에 마음을 고정.
- 2- 메틸 부탄 가득 비커를 설정하고 드라이 아이스와 함께 상자에 넣습니다. 이전에 냉동 포함 매체와 반 가득 냉동 금형에 마음을두고 냉동 매체를 포함하여 완전히 커버. 조심스럽게 2- 메틸 부탄과 극저온 포함 매체의 접촉을 방지, 감기 비커에 금형을 배치합니다. 사용할 때까지 -80 ℃에서 냉동 조직을 저장합니다.
- 두꺼운 심장 조각의 준비
- -18 -20 ℃의 물체 온도 -21 -23에 ° C의 챔버 온도, 4 °의 칼 홀더 지우기 각도, 그리고 깃털 R35의 마이크로톰 블레이드 : 다음은 cryotome의 설정을 사용합니다.
- 냉동 보관 O를 가지고냉동 컨테이너에서 rgan 및 빠른 냉동 선반을 사용하여 극저온 포함 매체와 표본 디스크에 고정합니다. 단면의 정점에서 시작하는 방식으로 중심을 위치.
- 더 절단 평면이 달성 장기가 표시되었을 때까지 50 μm의 조각을 얻어 낸다. 느린 속도로와 나이프에 배치 된 안티 - 롤 플레이트 수동 모드에서 cryotome를 사용하여 50 μm의 조직 조각을 잘라. 식염수 처리 된 현미경 슬라이드에 마운트 조각. 조각은 실온에서 30 분 동안 건조 시키 직접 C 또는 얼룩 ° -80에서 슬라이드를 저장합니다.
- 두꺼운 심장 조각의 염색 (핵 및 세포막)
- 37 ° C에서 1 시간 동안 큐벳에 세척 버퍼 (0.5 M 염화나트륨, 0.1 M 트리스의 pH 7.5, 50 mM의 EDTA)에서의 RNAse A (20 μg의 / mL)로 심장 조각을 취급합니다. 실온에서 30 분 동안 세척 완충액에서 0.2 % 트리톤 X의 슬라이스를 부화. A의 큐벳에 세척 버퍼에 5 분마다 두 번 조각을 씻으십시오실온에서 수평 진탕.
- 얼룩 하룻밤 1 μM TO-PRO3오다 이드 (661분의 642) 및 형광 결합 밀 배아 응집소 (WGA, 1 : 100) 4 ° C에서 세척 버퍼입니다. 수평 진탕 기에서 큐벳의 세척 완충액으로 5 분 각각의 조각을 세 번 씻고 방지 퇴색 시약과 유리 커버 슬립과 폴리 비닐 알코올 장착 매체로 커버.
- 이미지 획득
- 이상적으로, 40X / 1.15 NA 물에 침지 목적이 장착 반전 된 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용합니다. 길이 방향으로 줄 지어 심근 세포로 구성되어 슬라이스 내의 영역에 대한 눈으로 검색; 그 목적을 위해, 플루오 레세 WGA 채널 (예 : 488 내지)이 가장 적합하다.
주 : 심근 상하한 나중에 분석을 위해 Z 스택 내의 보여야으로이 단계는 필수적이다. 촬상 깊이가 30 내지 ~에 한정 슬라이스의 두께는 50㎛의하다 같이, 메신저 것은 불가능이러한 세포의 연령 단면 (셀 길이 : ~ 120 μm의). - 이미징 소프트웨어에서 설정을 조정합니다. 이미징 소프트웨어를 엽니 다. 열기 A1plus 설정 채널 2, CH3, 및 4 장에 대한 확인란을 선택합니다. 풀다운 메뉴를 클릭하여 Alx647에, Alx546에 CH3, 및 4 장을 EGFP하는 채널 2를 설정합니다.
- 각 채널에 대해, HV 클릭하고 슬라이더 막대를 사용하여 80로 설정합니다. 설정 슬라이더 막대를 사용하여 0으로 오프셋. 홈 위치로 핀홀을 설정하는 '홈'버튼을 클릭합니다. 풀다운 메뉴를 클릭하여 1,024 X 1,024의 스캔 크기를 설정하고 "XYZ 크기 설정"창을 엽니 최적화를 클릭합니다. "제안 단계 (Z)"에서 "완벽한 복셀"확인란을 선택합니다.
- "라이브 스캔"을 클릭하고 개별 채널의 슬라이더 막대를 클릭하여 레이저 강도를 조절합니다. 은 "ND 취득"창에서 "Z 시리즈"상자를 선택하고 "상단 버튼에 의해 정의 된"상자를 클릭합니다. 상단을 정의하고현미경의 초점을 조절 한 후 해당하는 버튼을 클릭하여, Z 스택의 버튼. 0.5 μm의에 Z-단계 폭을 설정합니다.
주 : Z - 스택의 깊이는 조직과 신호대 잡음비 내의 광 투과에 의해 제한된다. - "A1plus 설정"으로 이동하여 풀다운 메뉴를 클릭하여 2-4로 적분 선 보통 / 설정합니다. 미세 조정 레이저 강도; 핀홀은 초점면의 이미지를 위해 가능한 한 작아야한다.
- 이상적으로, 40X / 1.15 NA 물에 침지 목적이 장착 반전 된 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용합니다. 길이 방향으로 줄 지어 심근 세포로 구성되어 슬라이스 내의 영역에 대한 눈으로 검색; 그 목적을 위해, 플루오 레세 WGA 채널 (예 : 488 내지)이 가장 적합하다.
- 핵의 분석
- 이미지 분석 소프트웨어를 열고 관심의 z 스택을로드합니다.
- 수동 스택 내에 완전히 놓여 셀을 식별하기 위해 스택의 상이한 층을 스크롤하여 Z-스택에서 핵을 결정하고; WGA 염색은 모든 차원에서 볼 때이 경우입니다. 핵의 수를 카운트 (대부분이 이핵 것) 및 소프트웨어의 주석에 의해 분석 된 셀을 표시한다. <리> CM 핵 (H2B-MCH +) 및 단일 채널 (그림 2D)에 대한 3 차원 복원에 (TO-PRO3 +) 총 핵의 수를 결정합니다. 이미징 소프트웨어에서 "진"을 클릭하고 풀다운 메뉴에서 "임계 값 3D 정의"를 선택합니다. 전체 핵의 수에 대한 CM 핵 또는 Alx647의 수에 대한 채널 풀다운 메뉴 중 하나 Alx546에서 선택합니다. 해당 화살표를 클릭하여 프로그램을 "부드러운 배", 청소 1 배를 설정하고, 구멍을 채 웁니다. 은 "크기"상자를 선택하고 슬라이더 막대를 사용하여 5 μm의로 설정합니다. 별도의 객체가 나타날 때까지 슬라이더 막대를 사용하여 임계 값을 설정합니다.
참고 : 분열을 적용한 후, 결과 창은 정량화 된 이벤트와 이미지의 컬러 분열의 테이블을 보여줍니다. 일부 핵이 서로 직접 접촉으로 수동 정확하게 소프트웨어로 구분되지 않을 이중선을위한 자동 측정 결과를 수정한다.
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Representative Results
시험 관내에서 출생 후의 심근 두 번 형질 전환 Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP는-anillin 쥐의 심근 세포의 세포주기 활동에 대한 siRNA를 /의 miRNAs의 효과를 분석하기 위해 출생 후 하루 3 (P3)에 격리하고, 형질 세포주기 활성 유도 miR199 5 P27의 siRNA 및 siRNA를 Fzr1있다. 음성 대조군 (도 1a)와 비교 miR199- (도 1b)와 siRNA를 p27- (도 1C)의 이미지가 심근 세포주기 활성의 유도 표시 형질. Fzr1 억제가 형질 감염된 세포의 핵에서 eGFP는-anillin 융합 단백질의 축적 Fzr1의 손실에 이르게 같이 eGFP는-anillin 마우스 모델에서 Fzr1에 대한 siRNA가이 APC의 억제로 연결, 형질 컨트롤로서 사용될 수있다 Fzr1. Fzr1는 카린에 대한 anillin을 대상으로 anaphase (핵분열 말기) 촉진 복잡한 E3 연결 효소의 보조 인자이다OMAL 저하. 그림 1D는 45 % ~의 형질 전환 효율을 나타내는 삼일 형질 전환 후 siRNA를 Fzr1 형질 심근의 공 초점 개요 그림을 보여줍니다. (P27 6 최저 후, 예를 들어) endoreduplication을 수행 심근 독점적으로 핵 eGFP는-anillin 식 (그림 1E)를 표시하거나 eGFP는-anillin 마이너스 (설명 참조)입니다. endoreduplication는 엔도-S 단계 (eGFP는-anillin 양성)과 엔도-G 단계 (eGFP는-anillin 음성 구성으로 그들은 전형적인 M-위상 현지화 (그림 1 층과 G)에 eGFP는-anillin을 표명하지 아니 ). 엔도 - G 단계에서, APC는 프로 테아 좀에-eGFP는 anillin의 유비퀴틴 열화의 결과 활성화된다.
성인 단계에서 모노 - 및 이핵 심근 부 정량 랜 후, 단일 세포 수준에서 수행 할 수 어느Myh6-H2B-MCH 형질 전환 마음의 또는 유전자 변형 마음의 두께 cryoslices에 gendorff 해리. 랑겐 돌프있어서, 심방 및 심실의 심장 조직의 효소 분해 후에 기계적으로 분리되어 서로 독립적으로 분석 할 수있다. 핵 H2B-MCH 식으로 나타낸 바와 같이도 2a는, 이핵 심근가 높은 랑겐 돌프 분리 후의 비 고정 H2B-MCH 형질 좌심실 심근의 대표 사진을 보여준다. 대조적으로, 심방 심장 근세포의 대다수는 (도 2B) 단핵된다. 효소 소화 100 % 단셀을 초래하지 않으므로, α-티닌 염색 계시 교차 줄무늬 패턴은 이핵 심근 세포 사이의 차별 (크로스 줄무늬의 연속 패턴,도 2C) 및 셀 이중선을 용이하게한다. 도 2d은 이핵에서 심근의 ID의 예를 도시시골뜨기 조각.
성인 Myh6-H2B-MCH 형질 전환 마음의 두꺼운 조각의 3 차원 복원은 조직 내에서 생리적 조건 하에서 심근 핵의 비율을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 촬상 3D 소프트웨어 모듈을 사용하여 핵을 염색 훽스트 및도 2e에 도시 된 바와 같이, MCH-H2B 양성 핵을 자동 검출 및 계산 될 수있다. 최종 결과는 바로이 경우에, 서로 접촉 핵을 의미 이중선 수동으로 수정되어야한다. 두꺼운 조각에서 심근 세포의 핵 인덱스를 분석하기 위해서는 핵 한 Z 평면 내에서 불필요 거짓말을 수동으로 스택을 스크롤 할 필요가있다. WGA 염색은 셀 테두리의 검출이 가능합니다.
그림 1 :에서의 예siRNA를 가진 형질 이후 출생 후 심근 세포의 세포주기 활동의 생체 외 시각화. (AD) α-티닌 (흰색)에 대한 스테인드 eGFP는-anillin / Myh6-H2B-MCH의 마음에서 P3의 심근. 심근 핵은 훽스트 핵 염료 (파란색)에 의해 eGFP는-anillin 신호 (녹색)과 핵에 의해 H2B-MCH 신호 (적색), 세포주기 활동에 의해 식별됩니다. 스크램블 siRNA를 형질 감염 (A)의 심근 P3는 음성 대조군으로 작용한다. 바는 100 μm의입니다. 제어부 (A) 이외의 miRNA-199보다 크게 표시-eGFP는 anillin 신호로 형질 감염 (B) P3의 심근. 바는 100 μm의입니다. (C) endoreduplication을 나타내는 P27의 siRNA를 가진 형질 전환 후 독점적으로 핵 eGFP는-anillin 신호, 예. 바는 80 μm의입니다. 형질 감염 효율에 대한 판정에 대하여 Fzr1의 siRNA와 (D) 형질. eGFP는-anillin 교류로-eGFP는 anillin + 심근 세포의 수는 트랜 스펙 션 효율을 나타내며, 적산. 바는 80 μm의입니다. (EG) 세포주기 동안 심근에 eGFP는-anillin (녹색)의 다른 언어 버전 : 핵 지역화 (E에서 화살표), 수축 링 (F에서 화살표), 및 midbody 지역화 (G 화살표). 바 (F 및 G)에서 20 μm의 (E) 및 10 μm의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : H2B-MCH 마우스에서 심근의 랑겐 돌프 격리에 의해 Multinucleation의 평가 및 두꺼운 조각의 3D 분석하여 예. (A, B)의 심실 (A) 및 심방 (B)에서 성인 H2 하트 심근랑겐 돌프 해리에 의해 분리 한 후 B-MCH 형질 전환 마우스. 막대는 50 μm의 수 있습니다. α-티닌 (녹색)에 대한 스테인드 Myh6-H2B-MCH의 마음에서 (C) 심근. 심근 핵은 H2B-MCH 신호 (적색)로 식별됩니다. 바는 10 μm의입니다. 두꺼운 슬라이스 (화살표)에서 (D) 이핵의 심근. 심근 핵은 H2B-MCH 신호 (적색), ToPro3에 의해 세포 WGA 염색에 의한 경계 (녹색)과 핵 (흰색)로 식별됩니다. 바는 50 μm의입니다. (E) 워크 플로우 두꺼운 조각에 binucleation의 3D 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
심근 세포가 세포주기를 다시 입력 및 손상 후 조직의 항상성 동안 나눌 수 있는지 논란이있다. 심근의 기본 회전율의 값은 1 % (1) 80 % (7) 사이의 범위에 제시되어있다. 40 % - 7 또한 심장 병변 후 세포주기 활성의 유도 및 새로운 심근 세포의 생성은 0.0083 %, 8 및 25 사이의 값과, 경계 존에보고되었다. 이러한 불일치는 부분적 학적 섹션 9 및 세포 분열 중에 매우 도전적인 프로세스를 심장 핵을 식별하기 위해 다른 실험적 방법에 의해 설명 될 수있다. 심근 세포가 세포주기의 변동하는 경향으로는 배수체 및 다핵 세포 이어질 endoreduplication acytokinetic 및 유사 분열에서 세포 분열 확실한 구별하기 매우 중요하다. 에 대한세포 분열의 식별은, 이러한 수축 링 midbodies 같은 세포 분열의 특징을 시각적으로뿐만 아니라 이핵 심근의 비율을 결정할 필요가있다. 우리는 상세히 심근 세포주기 활성을 분석하고, 분리 된 세포 또는 두꺼운 섹션 nuclearity 자신의 정도를 결정하는 기술을 개발했다.
eGFP는-anillin 시스템은 대칭 수축 링 (그림 1 층)와 midbody (그림 1G), 그리고 endoreduplication 및 acytokinetic 유사 분열에 대한 간접 증거의 시각화를 통해, 세포 분열의 직접적인 증거를 제공하는 것이 중요합니다. 전술 한 바와 같이, 수축 링의 일방적 ingression의 발생 binucleation 10의 지표이고, 이는-eGFP는 anillin 시스템을 관찰 할 수있다.
Endoreduplication없이 수축 링 또는 마일만큼 제안dbody는 필수 이러한 현지화를 검출 확률의 계산을 만드는, 관찰된다. 25 h의 세포주기의 기간을 20 분의 수축 링 시야의 평균 기간, 1 시간의 midbody 지속성 가정 eGFP는-anillin 양성 세포 4 midbodies 구획 (100)에서 한 수축 링이 있어야한다. 통계적으로 말하면, 25-eGFP는 anillin 양성 세포의 최소는 세포주기의 변화에서 세포 분열을 구별하기 위해 분석 될 필요가있다. 이 수는 증가하거나 감소한다 (종종 알려지지) 세포주기 시간으로 적절히 변경한다. 이것은 또한 M 상, 비핵 현지화 유일한 상으로서, 단지 약 1 시간 동안 지속-eGFP는 anillin 신호의 대부분이 핵 (도 1E)을 할 것이라는 것을 의미한다.
출생 후 개발하는 동안, binucleation 마우스 마음에 일어나고 심실의 심근에서 90 % (~ 인간의 25 %) (11)을 증가시킨다. FO마음에 중생의 분석을 R, binucleation의 정도를 확인하는 것이 중요합니다. 즉, 랑겐 돌프 해리와 심장 조직의 두꺼운 부분의 창조 : 우리는이 중요한 형태 학적 기능을 해결하기위한 두 가지 방법을 설명합니다. 랑겐 돌프 분리가 쉽고 빠르게하지만, 두꺼운 부분의 형태는 더 많은 시간이 소요뿐만 아니라 더 정확합니다. 흥미롭게도, 우리는 랑겐 돌프 분리가 이핵 심근의 비율을 과대 평가 것으로 나타났습니다. 이것은이 아니라 엄격한 절차를 수행하는 동안 단핵 및 이핵 세포의 다른 생존율로 인해 수 있습니다.
생후 심근 세포의 증식의 유도가 심근의 재생에서 새로운 접근 방식은,이 프로토콜은 두 개의 형질 전환 마우스 선 Myh6-H2BmCh 및 CAG-eGFP는-anillin 조합하여 스크리닝 시스템을 설명한다. 출생 후의 일 P1 마음에서 분리 된 심근 세포 -의 miRNAs와 P6 쉽게 배양 할 수 있고, 형질 전환 또는siRNA의 작은 분자 라이브러리로 처리 하였다. 심근 핵은 수동 또는 자동으로 소프트웨어 알고리즘에 의해 검출 될 수 있고, 잠재적 인 "히트"는 MCH + 핵의 수의 증가에 의해 결정될 수있다. endoreduplication 및 acytokinetic 유사 분열에서 세포 분열의 차별은 eGFP는-anillin 신호의 다른 언어 버전의 정량화하여 수행 할 수 있습니다. 이 시스템은 규제 메커니즘 기본 출생 후 심근 증식에 몇 가지 새로운 빛을 흘렸다해야하며 심장 질환의 치료를위한 새로운 치료제의 발견으로 이어질 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm Petri dish | Sarstedt | 821472 | |
| 100 µm cell strainer | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 352360 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| G20x1 ½ injection cannula, Sterican | Braun, Melsungen | 4657519 | |
| 20 gauge needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | |
| 24-well plates | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 353047 | |
| 2-Methyl-butane | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3927.1 | |
| 37% formaldehyde solution | AppliChem GmbH | A0936,1000 | |
| 3-way stopcock | B. Braun Medical Inc. | 16494C | |
| 50 mL syringe | B. Braun Medical Inc. | 8728810F | |
| 70% ethanol | Otto Fischar GmbH | 27669 | |
| Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-605-205 | |
| Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG | Sigma-Aldrich, Steinheim | A7811 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area | Greiner bio-one | 675986 | |
| Collagenase B | Roche | 11088815001 | |
| confocal microscope Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| cryostat CM 3050S | Leica | ||
| donkey serum | Jackson Immuno Research, Suffolk, GB | 017-000-121 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| fetal calf serum | PromoCell, Heidelberg | ||
| Formaldehyde solution (4%) | PanReac AppliChem | A3697 | |
| Gelatine from porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich, Steinheim | G2500 | |
| glass coverslips | VWR | 631-0146 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Heidelberger extension tube | IMPROMEDIFORM GmbH | MF 1833 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HistoBond microscope slides | Marienfeld | 0810000 | |
| Hoechst 33342 (1 mg/mL) | Sigma Aldrich, Taufkirchen | B2261 | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson GmbH | 300334 | |
| Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 21980-032 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | Corning | 354221 | |
| Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | 13778075 | |
| Mouse IgG Cy5 (donkey) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| microcentrifuge tube | Sarstedt | 72690 | |
| Mini shaker | VWR | 12620-940 | |
| mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4464066 | |
| Biopsy Mold | Sakura Finetek/ VWR | 4565 | |
| M-slide 8-well ibiTreat | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Merck Millipore | 567530 | |
| negative control(scrambled RNA) | Ambion/Thermo Fischer Scientific | AM4611 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach | 130-098-373 | |
| NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Non essential amino acids, NEAA | Gibco/Life Technologies, Darmstad | 11140-035 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco | 51985-026 | |
| P21-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| P27-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Steinheim | 14190-094 | |
| Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading | Sigma-Aldrich | 10981 | |
| RNase A | Qiagen | 1007885 | |
| RNaseZap | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | AM9780 | |
| sample containers | Vitlab | 80731 | |
| Serological pipette | Greiner | 607180 | |
| software NIS Elements | Nikon | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek/ VWR | 25608-930 | |
| ToPro3 iodide (642/661) | Molecular probes/ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X | Fluka | 93418 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93418 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled | Vector Laboratories | VEC-FL-1021-5 | |
| α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Steinheim | M3148 |
References
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- Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33 (2015).
- Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
- Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076 (2012).
- Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
- Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
- Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
