Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Визуализация клеточного цикла вариаций и определение нуклеации в послеродовом кардиомиоцитов

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/55204
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institute of Physiology I, University of Bonn
* These authors contributed equally

Introduction

Правильная идентификация ядер кардиомиоцитов и состояния клеточного цикла имеет решающее значение для определения сердечного оборота мышц и регенерации. Это особенно верно для использования ядерных маркеров, таких как pHH3, Ki-67, или аналоги тимидина, для идентификации клеточного цикла активности. По мере того как пролиферативную способность взрослых кардиомиоцитов млекопитающих очень мала 1, ложная идентификация ядра положительного для маркера пролиферации ядра кардиомиоцитов может внести существенное различие в результатах анализе пролиферации. Кроме того, кардиомиоциты склонны к изменениям клеточного цикла, такие как эндоредупликации и acytokinetic митоза, которые приводят к полиплоидных и многоядерные клетки, а не в делении клеток. С этой целью, интерпретация меченых антител против маркеров общего клеточного цикла не является окончательным во всех случаях.

Здесь мы представляем методы прямой-forwa й признание кардиомиоцитов мышей и их ядерность в родных изолированных клеток и участков толстой ткани на послеродовом и взрослых этапах путем однозначной идентификации их ядер. Для этой цели, трансгенной линии мышей с кардиомиоциты экспрессией слитого белка , состоящего из Н2В человеческого гистона и mCherry под контролем промотора Myh6 (Myh6-Н2В-MCH) использовали 2. Скрещивание этой мыши линии с трансгенной индикатором пролиферации линии мыши, в которой экспрессия слитого белка EGFP-anillin находится под контролем повсеместной курица актина с CMV энхансер (CAG-EGFP-anillin), допускает определение статуса клеточного цикла. Подмости белок anillin специфически экспрессируется в клеточном цикле активных клеток 3, а его дифференциал субклеточном локализации во время клеточного цикла позволяет прогрессии клеточного цикла живого слежения с высоким разрешением M-фазыЭФ "> 4. Таким образом, двойной трансгенные мыши могут быть использованы для различения между пролиферирующих кардиомиоцитов и те , которые претерпевают изменения клеточного цикла. Это доказывает , особенно полезным при скрининге пролиферации индуцирующих веществ в пробирке.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры этого протокола с участием животных в соответствии с этическими нормами Боннского университета и соответствовали руководящим принципам из Директивы 2010/63 / ЕС Европейского парламента по защите животных, используемых для научных целей.

1. Экстракорпоральное Визуализация клеточного цикла активность в послеродовом кардиомиоцитов

  1. Послеродовая кардиомиоциты диссоциации
    1. Предварительно экспериментальные препараты
      1. Подготовка культуральной среды (IMDM, 1% пенициллина / стрептомицина, 1% заменимых аминокислот, 0,1% β-меркаптоэтанол); среда 1: добавить FCS до 2%; среда 2: добавить FCS до 20%.
      2. Шерсть 96-луночного блюдо культуры (площадь половинной рост: 15 мм 2) с 0,1% желатина в растворе PBS.
    2. Сердце рассечение
      1. Приготовьте чашку Петри с 15 мл PBS и хранить его на льду. Стерилизовать два пинцета и маленькие ножницы, помещая их в сухое стекло шарика стерилизатор. Жертвоприношение неонатальной трансгенных мышей (CAG-EGFP-anillin / Myh6-Н2В-MCH) путем обезглавливания. Откройте грудную клетку, рассекают сердце, как описано в Ehler и др. 2013 (J Exp Vis .; (79):. 50154 DOI: 10,3791 / 50154), и передать его на ледяной PBS. Переход к следующей мыши.
      2. При использовании не-гомозиготные гнездящихся пар, выявить трансгенные сердца с флуоресцентным микроскопом. Положите сердца в PBS под флуоресцентным микроскопом. Проверьте выражение EGFP-anillin (Напр .: 488 нм; Em .: 509 нм) и экспрессию H2B-МЧ (напр .: 587 нм, Em .: 610 нм) с соответствующими наборами фильтров.
    3. изоляция кардиомиоцитов
      1. Диссоциируют выбранные сердца с помощью неонатального набора сердца диссоциации. Выдержите смеси ферментов 1 при 37 ° С в течение 5 мин. Для получения 1 мл конечного ферментной смеси, добавляют 945 мкл смеси ферментов 1 до 55 мкл смеси ферментов 2.
      2. Трансфер до 4 сердца от P1 - P3 мышей или до 2-х сердец от P4 - P6 мышей к 1,5 мл гeaction пробирку, содержащую 1 мл смеси ферментов и вырезать сердце на мелкие кусочки ножницами. Переносят раствор в 15 мл реакционных труб.
      3. Инкубируют при 37 ° С в течение 15 мин. Для того, чтобы максимально увеличить контакт между тканью и ферментами, положить трубку объемом 15 мл почти горизонтально в инкубаторе. Смешайте с помощью пипетки 5 - 10 раз вверх и вниз с помощью пипетки 5 мл. Повторите этот шаг три раза.
      4. Добавить 7,5 мл среды 2 (20% FCS), чтобы остановить реакцию фермента. Фильтр суспензии клеток через клеточный фильтр 70 мкм. Промыть фильтр грубой очистки клеток 3 мл среды 2.
      5. Центрифуга клеточной суспензии при 300 × г в течение 15 мин и отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок в 500 мкл среды 1; красных клеток крови лизис не требуется для дальнейших экспериментов. Пипеткой 10 мкл суспензии клеток в счетной камере и клеток определяют количество клеток.
      6. Для 96-луночного планшета: семян 10000 клеток на лунку в 120 мкл среды 1 (2% FCS). Местоклетки в инкубатор (37 ° С и 5% СО 2) и сразу же приступить к трансфекции.
  2. Трансфекция неонатальных кардиомиоцитов с миРНК или микроРНК
    1. Протрите скамью с обеззараживающим раствором РНКазы, чтобы удалить РНКазы. Очистите следующий материал с обеззараживающим раствором РНКазы: 10-мкл, 100 мкл, и 200-мкл пипетки и коробку льда. Оттепель миРНК акции аликвоты (100 мкМ) на льду.
    2. Приготовьте 2 мкм рабочие запасы Si / микроРНК в уменьшенном сыворотки среде (98 мкл восстановленного сыворотки среды + 2 мкл миРНК 100 мкМ акций). Рабочий запас должен быть использован в тот же день. Замораживание не рекомендуется.
    3. Добавить 4 мкл 2 мкМ запаса до 6 мкл восстановленного сыворотки среды в реакционную пробирку 0,5 мл (количество для одного 96-луночного, окончательная концентрация Si / микроРНК в 140 мкл: ~ ​​57 нм). Выберите подходящий объем для количества скважин, предназначенных для трансфекции с определенным отношением Si / микроРНК.
    4. Подготовка мастер смеси реагента для трансфекции. Используйте 10 мкл (0,6 мкл реагента для трансфекции + 9,4 мкл восстановленного сыворотки среды) для каждой лунки (всего 96 лунок).
    5. Добавьте си / микроРНК смешивания в смесь трансфекция реагента. Инкубировать в течение 5 минут на льду. Пипеткой 20 мкл в каждую лунку. Инкубируйте клетки в течение 48 часов при температуре 37 ° С и 5% СО 2 , а затем заменить среду в каждую лунку с 120 мкл среды 1. Через 24 ч или более, перейти к фиксации и иммунофлуоресцентного окрашивания.
  3. Фиксация и иммунофлюоресценции окрашивание
    1. Удалите среду и промыть клетки один раз PBS. Накройте клетки с 4% -ным раствором формальдегида в течение 20 мин. Снимают раствор формальдегида и промыть клетки один раз PBS, а затем покрывают их PBS для хранения или перейти к иммунным окрашиванием.
    2. Инкубируйте с первичным антителом (концентрация в соответствии с инструкциями изготовителя) в 0,2% Triton-X и 5% осла сыворотки в течение не менее 2 ч.Если окрашивание на альфа-актинин (разбавление 1: 400; моноклональное анти-α-актинины), пятно в течение ночи при температуре 4 ° С.
    3. Удалить первичное антитело и промыть 3 раза PBS. Разведите вторичные антитела в Hoechst растворе 1: 400 и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте. Удалить антитело, промывают PBS, 3 раза, и покрывают клетки с PBS для хранения при 4 ° С.
  4. Конфокальной микроскопии видео
    1. С помощью конфокальной микроскопии для получения изображения. Откройте программу обработки изображений. Откройте "Настройки A1plus" и установите флажки для CH1, CH2 и СН3. Установите СН1 DAPI, СН2- к EGFP, Ch3 к Cy3 и СН4 к Cy4, нажав на выпадающее меню.
      1. Для каждого канала, нажмите на HV и установить его на 80 с помощью ползунка. Установите Смещение 0, используя ползунки, и нажмите на кнопку "Home", чтобы установить крошечное отверстие в исходное положение. Установите размер сканирования 1,024 х 1,024, нажав на выпадающее меню.
      2. Нажмите Оптимизировать, чтобы открытьОкно "XYZ Размер установки". Флажок "Perfect Voxel" в разделе "Шаг (предложил г)". Увеличение интенсивности лазерного излучения, пока изображение не является ни недоэкспонирован, ни передержано.
        Примечание: Например; Ch1 (DAPI): 16%, СН2- (EGFP): 12%, СН3 (Су3): 100%, СН4 (Cy5): 1%. Задать смещение для всех каналов до 0.
    2. Делайте снимки с использованием объектива 20X (200-кратное увеличение). Сканирование большое изображение , состоящее из плитки изображений (например, 3 х 3).
      1. В программном обеспечении визуализации, перейдите в раздел "Приобретите" и выберите "Сканировать большое изображение" из выпадающего меню. Под "Площадь", выберите "текущая позиция находится в верхнем левом углу" из выпадающего меню и установите "Количество полей в X и Y" до 3 х 3. Нажмите кнопку "Сканировать".
  5. анализ изображений
    1. Определить количество ядер кардиомиоцитов путем подсчета Н2В-Ch сигналов и количество кардиомиоцитов путем подсчета α-актинин сигналы.
        <li> Нажмите на кнопку "Мера" и выберите "Ручное измерение" из выпадающего меню. Выберите "Графы" из следующего выпадающего меню. Нажмите на ядрах с сигналами Н2В-МЧ, таким образом, маркировки и подсчета их. Сделайте то же самое для α-актинин-позитивных клеток, чтобы получить число кардиомиоцитов.
    2. Граф G2 фазы кардиомиоциты S / с сигналами ядерных EGFP-anillin (EGFP-anillin + / + H2BmCh ядер). Нажмите на кнопку "Мера" и выберите "Ручное измерение" из выпадающего меню. Выберите "Графы" из следующего выпадающего меню. Все ядра с EGFP-anillin сигналов и сигналов Н2В-МЧ, нажав на них.
    3. Граф кардиомиоциты с митозом конкретным EGFP-anillin сигналов (например, рис 1F и G), таких как цитоплазматических сигналов, сократительных кольца и midbodies. Нажмите на кнопку "Мера" и выберите "Ручное измерение" из выпадающего меню. Выберите "Графы" со следующего импldown меню. Марк кардиомиоцитов с митоза конкретным EGFP-anillin сигналов (например, рис 1F и G), цитоплазматических сигналов, сократительных колец и midbodies, нажав на них.

2. Определение нуклеации у взрослых кардиомиоцитов по Лангендорфа Диссоциация и Толстые тканевых секций

  1. Выделение взрослых кардиомиоцитов путем Лангендорфа диссоциации
    1. Подготовка перед рассечением сердца
      1. Заполните инсулиновый шприц (30-го калибра иглы) с гепарином (20 ед / г массы тела). Захватите мышью на загривок. Поднимите и поверните мышь назад, чтобы обнажить живот для инъекций.
      2. Выполните внутрибрюшинную инъекцию. Поместите гепарином мышь обратно в клетку и ждать по крайней мере за 15 минут до начала сердца рассечение. Промыть и проветрить аппарат Лангендорфа с 5 - 10 мл перфузионного буфера (перфузии буфер: 135 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 2,5 мМ HEPES, 5 мМ глюкозы, и 25 мМ БДМ в DDH 2 O, доведения рН до 7,4 с помощью NaOH).
    2. Сердце рассечение
      1. Подготовьте 10 см чашку Петри с охлажденной (4 ° С) PBS и поместить его на льду. Заполнить и проветривать 1-мл шприц, соединенный с канюлей (20 калибра) с PBS. Закрепите канюлю с пластилином на границе чашки Петри. Поместите кончик полой иглы чуть ниже поверхности PBS.
      2. Жертвоприношение мышь путем смещения шейных позвонков. Протрите живота с 70% -ным раствором этанола. Сделайте надрез от середины живота к грудине с хирургическими ножницами. Снимите диафрагму и разрезать грудную клетку на двусторонней основе с хирургическими ножницами.
      3. Поднимите и закрепите грудины с 20-го калибра иглы, откройте грудную полость, и осторожно возьмитесь за сердце с анатомическими щипцов. Поднимите сердце и удалить его из легких и сосудистую систему, сокращая сосуды тракта оттока.
        Примечание: Для того, чтобы определить аорту, расположите сердцеего вентральной стороной вверх. Это уменьшает расстояние между обоими предсердиями, поэтому аорта с ее ветвей можно найти между предсердиями. В зависимости от индивидуальных особенностей архитектуры сердца, ветви могут быть удалены, если главная ветвь аорты все еще достаточно долго.
      4. Передача сердце в 10-см чашки Петри, содержащей охлажденным PBS (смотри стадию 2.1.2.1). Сердце иглу, потянув за восходящую аорту на инъекционной канюлей G20x1 ½, который был тупого колеблющимся многофункциональный инструмент, чтобы избежать повреждения тканей. Закрепите аорту с резьбой на канюлю. Осторожно промыть сердце PBS, чтобы удалить лишнюю кровь, нажав на поршень шприца. Небольшое расширение сердца должно быть видно.
    3. Langendorff сердце диссоциации
      1. Подключите каннюлирован сердце быстро к адаптеру замка Luer в перфузионной аппарате Лангендорфа. Заливать сердца с 30 мл насыщенной кислородом буфера перфузионного при 37 ° С в течение 5 мин со скоростью потока 1 капли / с. ThСкорость потока д может быть адаптирован путем регулирования потока O 2 в устройстве Лангендорфа с использованием редукционного клапана (давление в диапазоне от 0 до 200 мбар).
      2. Подготовка пищеварения буфера непосредственно перед использованием: перфузионной буфера с 6 U коллагеназы B, 10000 единиц трипсин, и 50 мкМ CaCl 2. Удалить буфер перфузию и начать ферментативного расщепления путем добавления 30 мл теплого (37 ° С) и насыщенным кислородом буфера пищеварения.
        Примечание: Количество коллагеназы B должно быть титруют в зависимости от активности различных партий.
      3. Отрегулируйте поток в размере 1 капля / с и переварить сердце в течение 10 - 13 мин. Во избежание загрязнения, не используйте оттоку снова. Перенести сердце к 10-см чашки Петри с 5 мл буфера пищеварения. Рассеките ткани вручную с помощью щипцов, удерживая сердце с одной парой щипцов и с помощью другой пары, чтобы разорвать сердце на мелкие кусочки.
        Примечание: На этом шаге предсердия могут быть разделены, разрезают на небольшиештук (с радужной оболочки глаза ножницами), и переваривают в течение 30 мин в 750 мкл буфера для переваривания в инкубаторе при 37 ° С, чтобы получить изолированные предсердных клеток. Для того, чтобы получить чистые предсердные кардиомиоциты, пипетку вверх и вниз несколько раз с использованием 1-мл пипетки. Остановить ферментативную реакцию путем добавления 750 мкл стоп-раствора.
      4. Остановить пищеварение путем добавления 5 мл останавливающего раствора (перфузионное буфер с 5% FBS и 50 мкМ CaCl 2). С помощью серологической пипетки, фильтровать суспензии клеток через клеточный фильтр 100 мкм и собирают клетки в центрифужную пробирку на 50 мл. Центрифуга отфильтрованной клеточной суспензии при 80 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре.
      5. Жидкость над осадком сливают и осторожно ресуспендируют осадок клеток в 10 мл останавливающего раствора с помощью серологической пипетки на 10 мл. Центрифуга клеточной суспензии при 80 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре.
      6. После центрифугирования, отбросить супернатант и клетки вновь суспендируют в 1 мл культуральной среды (IMDM с 20% FCS, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 50 мкг / мл каждого из пенициллина и стрептомицина и 0,1 мМ бета-меркаптоэтанола) с последующим культивированием. С другой стороны, перейдите к шагу 2.2, "иммунофлюоресценции окрашивание" и зафиксировать клетки.
      7. Для фиксации на 24-луночные планшеты, пластины 10000 изолированных клеток на лунку на 8 мкг / мл ламинин покрытием покровные в 24-луночные планшеты с 500 мкл культуральной среды при 37 ° С и 5% СО 2 в течение по меньшей мере 3 ч ,
  2. Иммунофлуоресценции окрашивание на Langendorff-изолированных кардиомиоцитов в суспензии
    1. Закрепить Лангендорфа-изолированные кардиомиоцитов в 1 мл 4% PFA в PBS, рН 7,4, в течение 15 мин при комнатной температуре. Центрифуга клеточной суспензии при 800 х г в течение 2 мин при комнатной температуре, удалите закрепитель, и промыть клетки дважды PBS.
    2. Ресуспендируют фиксированные кардиомиоцитов в 1 мл PBS и либо продолжить иммунофлюоресценции окрашиванием или хранить их в 500 мкл PBS на лунку на24-луночный планшет при температуре 4 ° С. Перенести часть клеточной суспензии (~ 100 - 200 мкл) в микроцентрифужных трубки. Центрифуга клеточной суспензии при 800 х г в течение 2 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант.
    3. Проницаемыми, блок, и окрашивать клетки с первичными антителами против альфа-актинин путем добавления 200 мкл первичного антитела, разбавленного 1: 400 в PBS с 0,2% тритона Х-100 и 5% ослиной сыворотки в течение 1 ч при комнатной температуре.
    4. Центрифуга при 800 х г в течение 2 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант. Промывают осадок клеток ПБС, а затем центрифугируют при 800 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают и инкубировать в 200 мкл Alexa-Fluor-конъюгированного вторичного антитела (анти-мышиного IgG1), разведенным 1: 400 в Hoechst красителя (рабочий раствор: 1 мкг / мл) в течение 1 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте.
    5. Центрифуга при 800 х г в течение 2 мин при комнатной температуре и отбросить супернатант. Повторите этот шаг. Защита образца от света. рesuspend клеток в 200 - 500 мкл PBS и переносят 100 - 300 мкл суспензии клеток в лунку микроскопии камеры. Закройте крышку камеры и не хранить клетки при 4 ° С до обработки изображений. Защита от света.
  3. Анализ нуклеарностью Langendorff-изолированных кардиомиоцитов
    1. Возьмем изображения с α-актинины окрашенных кардиомиоцитов с целью 25X, что соответствует увеличении 250х. Подсчитайте количество ядер Н2В-MCH + только в тех кардиомиоцитов, которые регулярно окрашивали альфа-актинин и показывают типичные стержнеобразные морфологии и поэтому считаются неповрежденными.
    2. Граф, по крайней мере 100 кардиомиоцитов из трех разных сердец. Вычислить процент одноядерных, биядерных и трехъядерных кардиомиоцитов.
      Примечание: Как правило, двуядерные клетки должны составлять около 80 - 90%, в то время как трехъядерные клетки и те, с большим числом ядер встречаются редко (<1% в Langendorff-изолированные кардиомиоцитов, <3% в толстых ломтиков). Предсердные кардиомиоциты значительно меньше, чем желудочковых кардиомиоцитов. Как правило, одноядерные клетки составляют 90% от общей численности населения.
  4. Изоляция, фиксация и криоконсервация взрослых сердец как подготовка к толстых ломтиков
    1. Собирают перфузионное устройство для фиксации посредством соединения 50-мл шприц с 3-ходовым запорным краном с удлинительной трубкой Heidelberger и второй 3-ходовым запорным краном. Закрепить шприц в подставке таким образом, что проточный включена под действием силы тяжести. Заполните систему с 15 мл PBS.
    2. Выполните шаги 2.1.2.1-2.1.2.4, «Подготовка сердца." Подключите инъекции канюлю G20x1 ½ с сердцем блокировки адаптера Luer пузырьковой освобождающего PBS заполненный перфузионного устройства и заливать его с PBS. Заполните систему с 10 - 15 мл 4% -ного формальдегида в PBS, который затем увлажненную через сердце. Погружение исправить сердце в 4% растворе формальдегида в течение ночи.
    3. Заменить 4% формальдегидараствора ПБС, а затем моют сердце в PBS на горизонтальном шейкере со скоростью 150 оборотов в минуту в течение 8 часов при комнатной температуре. Заменить PBS с 20% -ным раствором сахарозы к обезвоживанию сердца в течение ночи при температуре 4 ° С.
    4. Замораживание сердце в крио-вложение среды в небольшой пресс-форме.
      1. Настроенный химический стакан, заполненный 2-метилбутана и поместить его в коробку с сухим льдом. Положите сердце в морозильную формы ранее наполовину заполненной с крио вложением среды и покрыть его полностью с крио вложение среды. Осторожно поместите форму в холодный химический стакан, предотвращая контакт крио-вложение среды с 2-метилбутана. Хранить замороженные ткани при -80 ° С до использования.
  5. Получение толстых срезов сердца
    1. Используйте следующую установку в замораживающий микротом: температура объекта от -18 до -20 ° С, температура в камере от -21 до -23 ° С, угол клиринговую на держателе ножа 4 °, и микротомных лезвия Перо R35.
    2. Возьмите КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ Organ из морозильного контейнера и закрепить его на образец диска с крио-вложение среды с использованием быстрого замораживания шельфа. Поместите сердце таким образом, что секционирование начинается в вершине.
    3. Отрезать 50-мкм срезы, пока еще секущую плоскость не будет достигнута и орган становится видимым. Вырезать 50 мкм срезы тканей, используя замораживающий микротом в ручном режиме с малой скоростью и с противодействующего крену пластины, расположенной на ноже. Маунт ломтики на обработанных солевым раствором микроскопа. Пусть кусочки высохнуть в течение 30 мин при комнатной температуре и хранить слайды при температуре -80 ° С или пятна непосредственно.
  6. Окрашивание толстые ломтики сердца (ядра и клеточные мембраны)
    1. Застойная сердечная ломтиков РНКазой А (20 мкг / мл) в буфере для промывки (0,5 М NaCl, 0,1 М Трис, рН 7,5, и 50 мМ ЭДТА) в кювете в течение 1 ч при 37 ° С. Инкубируйте ломтики в 0,2% Triton-X в промывочном буфере в течение 30 мин при комнатной температуре. Промыть ломтики дважды в течение 5 минут каждый в буфере для промывки в кювете нагоризонтальном шейкере при комнатной температуре.
    2. Пятно на ночь с 1 мкМ до-Pro3 йодида (642/661) и флуоресцеин-связанных агглютинина зародышей пшеницы (WGA, 1: 100) в буфере для промывки при температуре 4 ° С. Промыть Срезы три раза в течение 5 мин каждый с промывочным буфером в кюветах на горизонтальном шейкере и покрывают их поливинилового спирта монтажной среды с анти-выцветания реагента и покровным стеклом.
  7. получение изображений
    1. В идеале, используйте перевернутую конфокальной лазерной сканирующей микроскопа, оборудованного с целью NA воды Погружение 40X / 1.15. Поиск по глазом для области в срезе, который состоит из продольно выровненных кардиомиоцитов; для этой цели, канал флуоресцеин-WGA (напр .: 488 нм) лучше всего подходит.
      Примечание: Этот шаг имеет важное значение, поскольку верхний и нижний пределы кардиомиоциты должны быть видны в пределах Z-стека для последующих анализов. По мере того как глубина изображения ограничивается ~ 30 нм, а толщина среза составляет 50 мкм, не представляется возможным, чтобы имПоперечные возраст сечения этих клеток (длина ячейки: ~ 120 мкм).
    2. Отрегулируйте настройки в программном обеспечении визуализации. Откройте программу обработки изображений. Открыть A1plus Настройки и установите флажки для CH2, CH3 и СН4. Набор для EGFP Ch2, ch3 к Alx546 и СН4 к Alx647, нажав на выпадающее меню.
      1. Для каждого канала, нажмите на HV и установить его на 80 с помощью ползунка. Установите смещение 0, используя ползунки. Нажмите на кнопку "Home", чтобы установить крошечное отверстие в исходное положение. Установите размер сканирования 1,024 х 1,024, нажав на выпадающее меню и нажмите кнопку оптимизации, чтобы открыть окно "XYZ Size Setup". Установите флажок "Perfect Voxel" в разделе "Шаг (предложил г)".
    3. Нажмите на "живом" сканирования и настройки интенсивности лазерного излучения, нажав на ползунков на отдельных каналах. Установите флажок "Z Series" на окне "ND" Приобретение и нажмите на "определенную верхнюю кнопку" окно. Определить верхнюю иКнопка Z-стека, нажав на соответствующие кнопки после регулировки фокуса на микроскопе. Установите ширину Z-шага до 0,5 мкм.
      Примечание: Глубина Z-стека ограничен оптическим проникновением в ткани и отношением сигнал-шум.
    4. Перейти в раздел "Настройки A1plus" и установите Line Average / Integral 2-4, нажав на выпадающее меню. Тонкая настройка интенсивности лазерного излучения; пинхола должно быть как можно меньше, чтобы изображения в фокальной плоскости.
  8. Анализ нуклеации
    1. Откройте программное обеспечение для анализа изображений и загрузить Z-стек интерес.
    2. Вручную определить зарождение в Z-стеков путем прокрутки через различные уровни стека для того, чтобы идентифицировать клетки, которые лежат полностью в пределах стека; это тот случай, когда окрашивание РГА видна во всех измерениях. Подсчитайте число ядер (большинство из них будет двухядерный) и отметьте анализируемую ячейку аннотацией в программном обеспечении.
      3. <li> Определить количество ядер CM (H2B-MCH +) и суммарных ядер (TO-Pro3 +) в 3D - реконструкций для отдельных каналов (рис 2D). В программном обеспечении формирования изображения, нажмите на кнопку "Binary" и выберите "Определение пороговых значений 3D" из выпадающего меню. Выберите из меню канала выпадающего меню либо Alx546 для числа ядер см или Alx647 для подсчета общего числа ядер. При нажатии на соответствующие стрелки, установите программу на "Smooth 4x", чистый 1x, и заполнить отверстия ON. Проверьте "Размер" окна и установить его на 5 мкм с помощью ползунка. Установите порог, используя ползунок, пока не появятся отдельные объекты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После применения фрагментации, окно результатов показывает таблицу количественных событий и цветной фрагментации изображения. Поскольку некоторые ядра непосредственно контактируют друг с другом, вручную корректировать автоматический результат измерения дублетов, которые не могут быть корректно разделены программным обеспечением.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для того чтобы проанализировать влияние миРНК / микроРНК на активность клеточного цикла послеродовых кардиомиоцитов в пробирке, кардиомиоцитов двойных трансгенных мышей Myh6-Н2В-МЧ / CAG-EGFP-anillin были выделены на постнатальный день 3 (P3) и трансфицировали клеточный цикл активности индуцирующего miR199 5, миРНК p27 и миРНК Fzr1. По сравнению с отрицательным контролем (рисунок 1А), картины miR199- (Фиг.1В) и миРНК p27- (фиг.1С) трансфицировали кардиомиоциты показывают индукцию активности клеточного цикла. В мышиной модели EGFP-anillin, миРНК против Fzr1 могут быть использованы в качестве контроля трансфекции, так как ингибирование Fzr1 приводит к накоплению EGFP-anillin слитого белка в ядрах трансфецированных клеток и потерей Fzr1 приводит к ингибированию APC Fzr1. Fzr1 является кофактором из-продвижения анафазы комплекса E3 лигазы, которая ориентирована на anillin для протеиOMAL деградация. Рисунок 1D показывает конфокальной обзор картину миРНК Fzr1-трансфецированных кардиомиоцитов через 3 дня после трансфекции, что указывает на эффективность трансфекции ~ 45%. Кардиомиоциты , которые выполняют эндоредупликацию (например, после нокдауна p27 6) показывают выражение исключительно ядерной EGFP-anillin (рис 1E) или EGFP-anillin отрицательный (обсуждение см). Они не выражают EGFP-anillin в М-фазе типичны локализаций (рис 1F и G), а эндоредупликация состоит только из фазы эндо-S (EGFP-anillin-положительных) и фазы эндо-G (EGFP-anillin-отрицательных ). На этапе эндо-G, АРС является активным, что приводит к убихитинизация и деградации EGFP-anillin в протеасомы.

Количественное моно- и двуядерных участков кардиомиоцитов на стадии взрослого может быть выполнена либо на уровне одной клетки после Langendorff диссоциации Myh6-Н2В-МЧ трансгенных сердца или в толстых cryoslices трансгенных сердец. После ферментативного расщепления сердечной ткани на аппарате Лангендорфа, предсердий и желудочков могут быть механически разделены и проанализированы независимо друг от друга. На фиг.2А показана репрезентативная картина нефиксированным Н2В-MCH трансгенный желудочковых кардиомиоцитов после Лангендорфа изоляции с высокой степенью двуядерных кардиомиоцитов, как указано выражением ядерного Н2В-МЧ. В противоположность этому , большинство предсердных кардиомиоцитов Мононуклеированные (Фигура 2В). По мере того как ферментативное расщепление не приводит к 100% одиночных клеток, картина перекрестного страты выявленной α-актинин окрашивания способствует дискриминации между двуядерных кардиомиоцитов (непрерывный узор перекрестной штриховки, рис 2C) и клеточные дублеты. На рисунке 2D показан пример идентификации двуядерных кардиомиоцитов в надеревенщина срез.

3D реконструкций толстых ломтиков взрослых Myh6-Н2В-MCH трансгенных сердца могут быть использованы для определения доли ядер кардиомиоцитов в физиологических условиях в ткани. Использование 3D - модуль для обработки изображений, Hoechst-окрашенных ядер и Н2В-MCH-положительных ядер могут быть обнаружены и подсчитаны автоматически, как это показано на рисунке 2Е. Окончательный результат должен быть скорректирован вручную для дублетов, то есть ядра, которые непосредственно соприкасаются друг с другом, и в этом случае. Для анализа индекса нуклеации кардиомиоцитов в толстых ломтиков, необходимо вручную прокручивать стека, поскольку ядра не необходимой лежат в пределах одной плоскости г. РГА окрашивание позволяет для обнаружения границ ячеек.

Рисунок 1
Рисунок 1: Примеры InVitro Визуализация клеточного цикла активности в послеродовом кардиомиоцитов после трансфекции миРНК. (AD) P3 кардиомиоциты от EGFP-anillin / сердца Myh6-Н2В-МЧ окрашивали для альфа-актинин (белый). ядер кардиомиоцитов определяются с помощью сигнала Н2В-МЧ (красный), активности клеточного цикла с помощью EGFP-anillin сигналов (зеленый) и ядер Hoechst ядерного красителя (синий). (A) P3 кардиомиоцитах , трансфицированных скремблирования миРНК служить в качестве отрицательного контроля. Бар 100 мкм. (B) P3 кардиомиоциты , трансфицированные микроРНК-199 дисплей значительно более EGFP-anillin сигналов , чем контроль (A). Бар 100 мкм. (C) Пример сигналов исключительно ядерных EGFP-anillin после трансфекции с p27 миРНК, что указывает на эндоредупликацию. Бар 80 мкм. (D) Трансфекция киРНК против Fzr1 для определения эффективности трансфекции. Как EGFP-anillin переменного токааккумулирует, число EGFP-anillin + кардиомиоцитов указывает на эффективность трансфекции. Бар 80 мкм. (EG) Различные локализациями EGFP-anillin (зеленый) в кардиомиоциты во время клеточного цикла: ядерная локализация (стрелка Е), сократительная кольцо (стрелки в F), и локализации посредине тела (стрелка G). Бар в 20 мкм (E) и 10 мкм (F и G). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Примеры для оценки по многоядерных изоляции Langendorff кардиомиоцитов из Н2В-МЧ мышей и по 3D - анализа толстыми ломтиками. (А, В) желудочков (А) и предсердной (В) кардиомиоцитов из сердца от взрослого H2B-МЧ трансгенных мышей после выделения путем Лангендорфа диссоциации. Стержни 50 мкм. (C) кардиомиоцитов из Myh6-Н2В-МЧ сердца окрашивали для альфа-актинин (зеленый). ядер кардиомиоцитов определяются с помощью сигнала Н2В-МЧ (красный). Бар 10 мкм. (D) двуядерных кардиомиоцитов в толстый ломтик (стрелки). ядер кардиомиоцитов определяются с помощью сигнала Н2В-МЧ (красный), клеточные границы путем WGA окрашивания (зеленый), и ядер ToPro3 (белый). Бар 50 мкм. (E) Рабочий процесс для 3D анализа binucleation в толстых ломтиков. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Существует спор по поводу того, кардиомиоциты способны повторно клеточный цикл и разделить после травмы и в течение гомеостаза тканей. Значения для основного оборота кардиомиоцитов были даны в диапазоне от 1% до 1 и 80% 7. Кроме того, после повреждения сердца, индукция активности клеточного цикла и генерацию новых кардиомиоцитов сообщили в пограничной зоне, со значениями между 0,0083% 8 и 25 - 40% 7. Эти расхождения отчасти можно объяснить различными экспериментальными подходами для выявления сердечных ядер, процесс , который является весьма сложной задачей на гистологических срезах 9 и во время клеточного деления. Как кардиомиоциты склонны к изменениям клеточного цикла, это имеет решающее значение, чтобы отличить подлинный деление клеток от эндоредупликации и acytokinetic митоза, которые приводят к полиплоидных и многоядерные клетки. Дляопределение клеточного деления, необходимо визуализировать признаки клеточного деления, такие как сократительных колец и midbodies, а также, чтобы определить процент двуядерных кардиомиоцитов. Мы разработали методы для анализа активности клеточного цикла кардиомиоцитов в деталях и определить их степень нуклеарностью в изолированных клетках или в толстых участках.

Важно отметить , что система EGFP-anillin обеспечивает прямое доказательство деления клеток, с помощью визуализации симметричного сократительного кольца (рис 1F) и середины тела (рис 1G), а также косвенные доказательства для эндоредупликации и acytokinetic митоза. Как было описано выше, возникновение одностороннего попаданию сократительного кольца является индикатором binucleation 10, и это можно наблюдать с системой EGFP-anillin.

Эндоредупликация предлагается пока не сократительного кольца или инфаркта миокардаdbody наблюдаются, что делает расчеты вероятностей обнаружения этих локализаций обязательно. Предполагая длительность клеточного цикла 25 ч, средняя продолжительность сократительной кольцевой видимости 20 мин и средины тела сохранение 1 ч, должно быть 1 сократительной кольцо 100 деления EGFP-anillin-положительных клеток и 4 midbodies. Статистически говоря, минимум 25 EGFP-anillin-позитивных клеток должны быть проанализированы, чтобы отличить деление клеток от вариаций клеточного цикла. Это число изменяется соответствующим образом, как длительность клеточного цикла (который часто неизвестен) увеличивается или уменьшается. Это также подразумевает , что большинство EGFP-anillin сигналов будет ядерной (фиг.1Е), в качестве М-фазы, единственной фазы с неядерной локализаций, длится всего около 1 часа.

Во время постнатального развития, binucleation происходит в сердцах мышей и увеличивает до 90% в желудочковых кардиомиоцитов (~ 25% у людей) 11. Foг анализ регенерации в сердце, важно определить степень binucleation. Мы опишем два способа решения этой важной морфологическая особенность, а именно: Лангендорфа диссоциации и создание толстых участков сердечной ткани. В то время как Langendorff изоляция проще и быстрее, морфология толстых секций отнимает больше времени, но и более точным. Интересно, что мы обнаружили, что Лангендорфа изоляция завышенную процент двуядерных кардиомиоцитов. Это может быть связано с различными скоростями выживания одноядерных и двуядерных клеток во время этой процедуры довольно жесткой.

По мере того как индукция пролиферации в послеродовых кардиомиоцитов является новым подходом в регенерации сердца, этот протокол описывает систему скрининга путем объединения двух трансгенных линий мыши, Myh6-H2BmCh и CAG-EGFP-anillin. Кардиомиоциты, выделенные из сердца на послеродовом дней P1 - P6 может быть легко культивировать и трансфицированные микроРНК илимиРНК или обрабатывают с библиотеками малых молекул. ядер кардиомиоцитов может быть вручную или автоматически обнаруживает программные алгоритмы, и потенциальные «удары» могут быть определены путем увеличения числа MCH + ядер. Различение деления клеток из эндоредупликации и acytokinetic митоза может быть сделано путем количественной оценки различных локализациях EGFP-anillin сигналов. Эта система должна пролить новый свет на регуляторные механизмы, лежащие в послеродовом пролиферации кардиомиоцитов и может привести к открытию новых терапевтических средств для лечения заболеваний сердца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Petri dish Sarstedt 821472
100 µm cell strainer Becton Dickinson GmbH/Falcon 352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753
G20x1 ½ injection cannula, Sterican Braun, Melsungen 4657519
20 gauge needle Becton Dickinson GmbH 301300
24-well plates Becton Dickinson GmbH/Falcon 353047
2-Methyl-butane Carl Roth GmbH + Co. KG 3927.1
37% formaldehyde solution AppliChem GmbH  A0936,1000
3-way stopcock B. Braun Medical Inc. 16494C
50 mL syringe B. Braun Medical Inc. 8728810F
70% ethanol Otto Fischar GmbH 27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody Jackson ImmunoResearch 115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG Sigma-Aldrich, Steinheim A7811
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area Greiner bio-one 675986
Collagenase B Roche 11088815001
confocal microscope Eclipse Ti-E Nikon
cryostat CM 3050S Leica
donkey serum Jackson Immuno Research, Suffolk, GB 017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
EDTA Sigma-Aldrich E4884
fetal calf serum PromoCell, Heidelberg
Formaldehyde solution (4%) PanReac AppliChem A3697
Gelatine from porcine skin, Type A Sigma-Aldrich, Steinheim G2500
glass coverslips VWR 631-0146
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Heidelberger extension tube IMPROMEDIFORM GmbH MF 1833
Heparin-Natrium Ratiopharm 5394.02.00
HEPES Sigma-Aldrich H3375
HistoBond microscope slides Marienfeld 0810000
Hoechst 33342 (1 mg/mL) Sigma Aldrich, Taufkirchen B2261
Insulin syringe Becton Dickinson GmbH 300334
Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) Gibco/Life Technologies, Darmstadt 21980-032
KCl Sigma-Aldrich P9333
Laminin Corning 354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti Nikoninstruments, Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt 13778075
Mouse IgG Cy5 (donkey) Jackson ImmunoResearch 715-175-151
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
microcentrifuge tube Sarstedt 72690
Mini shaker VWR 12620-940
mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p Ambion/Thermo Fischer Scientific 4464066
Biopsy Mold Sakura Finetek/ VWR 4565
M-slide 8-well ibiTreat ibidi 80826
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Merck Millipore 567530
negative control(scrambled RNA) Ambion/Thermo Fischer Scientific AM4611
Neonatal Heart Dissociation Kit Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach 130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit Nikoninstruments, Düsseldorf
Non essential amino acids, NEAA Gibco/Life Technologies, Darmstad 11140-035
Opti-MEM, Reduced Serum Medium Gibco 51985-026
P21-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
P27-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies, Darmstadt 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Steinheim 14190-094
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading Sigma-Aldrich 10981
RNase A Qiagen 1007885
RNaseZap Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt AM9780
sample containers Vitlab 80731
Serological pipette Greiner 607180
software NIS Elements Nikon
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek/ VWR 25608-930
ToPro3 iodide (642/661) Molecular probes/ThermoFisher Scientific T3605
Tris Sigma-Aldrich T1503
Triton X Fluka 93418
Triton X-100 Fluka 93418
Trypsin Sigma-Aldrich T1426
Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled Vector Laboratories VEC-FL-1021-5
α-actinin antibody Sigma-Aldrich A7811
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Steinheim M3148

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33 (2015).
  3. Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
  4. Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076 (2012).
  5. Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
  6. Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
  7. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
  8. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
  9. Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
  10. Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
  11. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).

Tags

Биология развития выпуск 120 Инфаркт биология кардиомиоцитов пролиферации генетически измененные мышей кардиального развития клеточной биологии клеточной культуры
Визуализация клеточного цикла вариаций и определение нуклеации в послеродовом кардиомиоцитов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raulf, A., Voeltz, N., Korzus, D.,… More

Raulf, A., Voeltz, N., Korzus, D., Fleischmann, B. K., Hesse, M. Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (120), e55204, doi:10.3791/55204 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter