Summary
Her beskriver vi en 4-trins-protokol til at differentiere humane embryonale stamceller til NKX6-1 + bugspytkirtlen forfædre in vitro. Denne protokol kan anvendes på en række humane pluripotente stamcellelinjer.
Abstract
Pluripotente stamceller har evnen til at forny sig selv og differentiere til flere slægter, hvilket gør dem til et attraktivt kilde til generering af pancreasstamfaderceller, der kan anvendes til studiet af og fremtidige behandling af diabetes. Denne artikel beskriver en fire-trins differentiering protokol designet til at generere pancreasstamfaderceller fra humane embryonale stamceller (hESCs). Denne protokol kan anvendes på en række humane pluripotente stamcelle (hPSC) linjer. Den tilgang, til at generere pancreasstamfaderceller er at differentiere hESCs til præcist modellere vigtige stadier i bugspytkirtlen udvikling. Det begynder med induktion af den endelige endoderm, hvilket opnås ved dyrkning af cellerne i nærvær af activin A, basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) og CHIR990210. Yderligere differentiering og mønstret med fibroblast vækstfaktor 10 (FGF10) og Dorsomorphin genererer celler ligner den bageste fortarm. Tilsætningen af Retinsyre, noggin, SANT-1 og FGF10 adskiller bageste fortarm celler i celler karakteristiske af pancreas endoderm. Endelig kombinationen af epidermal vækstfaktor (EGF), Nicotinamid og noggin fører til den effektive generering af PDX1 + / NKX6-1 + -celler. Flowcytometri er udført for at bekræfte ekspressionen af specifikke markører på centrale stadier i bugspytkirtlen udvikling. De Pdx1 + / NKX6-1 + pancreas progenitorer i slutningen af trin 4 er i stand til at generere modne p-celler ved transplantation i immundefekte mus, og kan yderligere differentieres til frembringelse insulinproducerende celler in vitro. Således effektiv generering af PDX1 + / NKX6-1 + pancreas progenitorer, som påvist i denne protokol, er af stor betydning, da det giver en platform til at studere human pancreas udvikling in vitro og tilvejebringer en kilde til celler med potentialet til at differentiere til p-celler, der kunne eventually anvendes til behandling af diabetes.
Introduction
Forekomsten af diabetes er stigende, og i henhold til den canadiske diabetesforening, anslås det, at mere end 11 millioner mennesker i Canada er diabetiker eller prædiabetisk, med 5-10% af disse personer, der har type 1-diabetes (T1D) 1. T1D er en autoimmun sygdom, der er forårsaget af ødelæggelse af de insulinproducerende p-celler, der er placeret inden for de langerhanske øer. I øjeblikket individer lever med T1D kræver udefra kommende kilder af insulin to. Trods fremskridt i insulinbehandling, T1D patienter fortsat have en vanskelig tid at regulere deres blodsukkerniveau og fortsat lider både hypo- og hyperglykæmi. En lovende form for behandling for at genoprette normoglykæmi i T1D er anvendelsen af humane embryonale stamceller (hESCs), som kunne anvendes til at generere en ubegrænset forsyning af insulinproducerende p-celler både in vivo og in vitro 3, 4, 5, 6, 7. Differentiering hESCs til p-lignende celler kunne gøre det muligt at studere diabetes in vitro, hvilket muliggør identifikationen af nye terapeutiske mål for type 2-diabetes og tilvejebringer celler til transplantation i T1D patienter.
Den mest succesfulde forsøg på at generere insulinproducerende celler fra hESCs in vitro er at rekapitulere de embryonale begivenheder, der opstår under pancreasudviklingen 4, 5. Dette indebærer manipulation af distinkte signalveje til præcist at modellere vigtige stadier i udviklingslandene bugspytkirtlen. Pancreasudviklingen begynder med induktion af den endelige endoderm, som er kendetegnet ved ekspressionen af CXCR4 og CD117 (c-KIT) 8, 9. Præcis regulering af Definitive endoderm organisation er nødvendig for dannelsen af tarmen rør, som så gennemgår anterior-til-posterior og ventral-dorsale mønsterdannelse. Den dorsale og ventrale pancreatiske knopper komme ud af området af den bageste fortarm der udtrykker pancreas og duodenal homeobox-genet (Pdx1), som er nødvendig for pancreasudviklingen 10. Den dorsale og ventrale knopper sikringen til at danne bugspytkirtlen, som derefter gennemgår omfattende epitelial remodeling og ekspansion 11. Engagement i endokrine og eksokrine afstamning er ledsaget af den generation af multipotente stamceller (MPCS), der udtrykker, blandt andre, transskription faktorer Pdx1, Nkx6.1 og Ptf1a 12, 13. Middelhavspartnerlandene, der bliver endokrine og duktale celler fortsætter med at udtrykke Nkx6-1 mens faldende Ptf1a udtryk. I modsætning til dette, vil exokrine afstamningsceller miste expression af Nkx6-1 og vedligeholde Ptf1a udtryk 12.
Transkriptionsfaktoren Nkx6-1 har en central rolle i pancreas udvikling, især under differentieringen af endokrine progenitorceller til p-celler. Som tidligere beskrevet, sletning af Nkx6-1 resulterer i nedsat dannelse af p-celler under pancreasudvikling 14. Derfor genererer insulinproducerende p-celler både in vitro og in vivo kræver effektiv induktion af Nkx6-1.
Vi har for nylig udviklet en protokol til effektivt at generere Pdx1 + / NKX6-1 + bugspytkirtlen forfædre fra hPSCs. Disse hPSC-afledte pancreas progenitorer generere modne p-celler ved transplantation i immundefekte mus 3. Differentieringen protokol kan opdeles i 4 faser karakteristisk for: 1) endelig endoderm induktion, 2) posterior fortarm mønsterdannelse, 3) pancreas specifikation og 4) NKX6-1 induktion. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af hvert trin i rettet differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udarbejdelse af løsninger og Medier
BEMÆRK: Forberede alle medier til cellekultur i et sterilt miljø. Medier skal gøres og anvendes straks. Reagens oplysninger findes i Materials tabel.
- Differentiering medier
- Forbered Dag 0 Differentiation Medier: RPMI Medium med 1% glutamin, 2 uM CHIR 99.021, 100 ng / ml activin A, 10 4 M MTG.
- Forbered Day 1-2 Differentiation Medie: RPMI Medium med 1% glutamin, 100 ng / ml activin A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 ug / ml ascorbinsyre.
- Forbered Day 3-5 Differentiation Medier: RPMI Medium med 1% glutamin, 1% B27, 10 4 M MTG, 0,75 pM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10.
- Forbered Day 6-7 Differentiation Media: DMEM med 1% glutamin, 1% B27, 50 ug / ml ascorbinsyre, 50 ng / ml FGF10, 0,25 uM SANT-1, 2 uM retinsyre, 50 ng / ml noggin.
BEMÆRK: RetinoidSyre bør føjes til medierne sidste og medier bør beskyttes mod lys for at forhindre oxidativ nedbrydning 15. - Forbered Dag 8-12 Differentiation Media: DMEM med 1% glutamin, 1% B27, 50 ug / ml ascorbinsyre, 50 ng / ml Noggin, 100 ng / ml hEGF, 10 mM nikotinamid.
- Forbered FACS buffer: 10% FBS i PBS, minus calcium og magnesium.
2. embryonale menneskelige stamceller Differentiering
BEMÆRK: embryonale menneskelige stamceller er optøet, passeres og udvidet på bestrålede mus embryonale fibroblaster i tilstedeværelse af en KOSR-baserede medier suppleret med bFGF 16. HESCs er klar til differentiering, når cellerne når 80-95% konfluens. På dette tidspunkt kolonierne skal være store med definerede grænser og en "domelike 'struktur (figur 1A). Alle cellekulturen udføres i fladbundede, vævskulturbehandlede plader overtrukket med 0,1% gelatine. Typisk dyrkes cellerne i 6 ellerPlader med 12 brønde, i medier volumener 2 ml eller 1 ml.
- På dag 0 begynde differentiering ved at erstatte KOSR-baserede medier med dag 0 Differentiering Media.
- På dag 1 og 2, ryst forsigtigt pladen for at fjerne eventuelle døde celler fra monolaget før opsugning. Udskift med Day 1-2 Differentiering Media.
- På dag 3, høst celler til flowcytometri. Hvis cellerne udtrykker mere end 90% CXCR4 + / CD117 +, gå videre til trin 2.4.
- På dag 3 og 5, ryst forsigtigt pladen for at fjerne eventuelle døde celler fra monolaget før opsugning. Udskift med Day 3-5 Differentiering Media.
- På dag 6 og 7, erstatte med Day 6-7 Differentiering Media.
- På dag 8, 10 og 12, erstatte med Dag 8-12 Differentiering Media.
- På dag 13, høst celler til flowcytometri til at bestemme PDX1 og NKX6-1 udtryk.
3. Høst Celler til flowcytometri analyse
- Dissociér celler med1x kommerciel trypsin opløsning ifølge producentens protokol og inkuberes ved 37 ° C i 3 minutter.
- Fjern kommerciel trypsin opløsning og resuspender enkelte celler i 1.000 pi FACS buffer med 30 pi DNase I.
- Filter celler under anvendelse en 35 um nylon mesh cellefilter og overførsel til et mikrocentrifugerør.
- Centrifuger cellerne ved 455 x g i 5 min. Forbered celler til enten levende eller fast farvning.
4. Farvning for flowcytometri
- Flow forberedelse til levende farvning på dag 3
- Resuspender celler i 1.000 pi FACS buffer. Transfer 200 pi (ca. 1-3 x 10 5 celler) i to brønde i en plade med 96 brønde (til både ufarvede og farvede prøver).
- Centrifugeres pladen ved 931 xg i 2 min. Fjern supernatanten ved at vende pladen.
- Farv med primære-konjugerede antistoffer, CXCR4: APC og CD117: PE (se M aterialer Tabel) til 30 min ved stuetemperatur beskyttet mod lys.
- Centrifugeres pladen ved 931 xg i 2 min. Fjern supernatanten ved at vende pladen.
- Resuspender prøver i 100 pi FACS buffer.
- Centrifugeres pladen ved 931 xg i 2 min. Fjern supernatanten ved at vende pladen.
- Resuspender hver prøve og overførsel i et samlet volumen på 300-500 pi FACS buffer til 1 ml mikroreagensglas eller 5 ml rundbundet rør.
- Kør prøver på flowcytometeret 17. Hvis prøverne ikke kan køres med det samme, opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys.
- Flow forberedelse til fast farvning på dag 13
- Resuspender cellepelleten i kommerciel fiksering / permeabilisering opløsning i 24 timer ved 4 ° C.
- Centrifugeres prøven ved 455 xg i 5 min. Resuspender i 400 pi Perm / Wash løsning.
- Overfør 200 ul af prøven (ca. 0,5-1 x 10 6 celler) til two brønde i en plade med 96 brønde (for IgG kontrol og PDX1 / NKX6-1 farvning). Centrifuger ved 931 xg i 2 min.
- Resuspender cellepellets i 100 pi Perm / Wash opløsning indeholdende anti-PDX1 og anti-NKX6-1 primær eller isotypekontrolantistoffer (se Materialer tabel). Inkuber natten over ved 4 ° C.
- Centrifugeres pladen ved 931 xg i 2 min. Fjern supernatanten ved at vende pladen. Resuspender prøver i 100 pi Perm / Wash løsning.
- Centrifugeres pladen ved 931 xg i 2 min. Fjern supernatanten ved at vende pladen.
- Resuspendere prøverne i 100 pi Perm / Wash indeholdende sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 1 time beskyttet mod lys.
- Centrifugeres pladen ved 931 xg i 2 min. Fjern supernatanten ved at vende pladen.
- Resuspender prøver i 100 pi Perm / Wash Solution.
- Centrifugeres pladen ved 931 xg i 2 min. Fjern supernatanten ved at vende pladen.
- Repspiser trin 4.2.9 og 4.2.10.
- Resuspender hver prøve og overførsel i et samlet volumen på 300-500 pi FACS buffer til 1 ml mikroreagensglas eller 5 ml rundbundet rør.
- Kør prøver på flowcytometeret 17. Hvis prøverne ikke kan køres med det samme, opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiv generation af pancreas progenitorer er afhængig af korrekt vækst og vedligeholdelse af udifferentierede celler efterfulgt af den præcise tilsætning af specifikke signaleringsmolekyler under differentieringen protokol, som illustreret i diagrammet i figur 1A. På dag 0 bør udifferentierede celler være 80-95% sammenflydende og kolonier bør have definerede kanter (figur 1A). Under fase 1, vil medierne sandsynligvis vises overskyet da celledød er helt almindeligt på dette tidspunkt. Ved udgangen af fase 1, bør celler co-udtrykker endelige endoderm markører, CXCR4 og CD117, ved en andel større end 90% (figur 1B).
Som celler differentierer i hele fire-trins protokol, deres morfologi ændres fra en aflang, oval-lignende udseende (observeret ved fase 1 og 2) til mindre, rundere celler (som set ved Stages 3 og 4) (
Figur 1: Skematisk af pancreas stamfader differentiering fra hESCs og baggrundsdata. (A) Skematisk af induktionen af pancreas progenitor fra hESCs. Dag differentiering, developmental fase, base-medier, og de cytokiner tilføjet på alle trin er inkluderet. Nedenfor er fase kontrast billeder på de vigtigste stadier i bugspytkirtlen differentiering vist. I alle repræsentative tal, blev H1 celler differentieret efter 4-trins differentiering protokol afbildet ovenfor. Dag 0, udifferentierede hESCs; Trin 1, Definitive endoderm; Etape 2, Posterior fortarm; Trin 3, PDX1 + endoderm; Stage 4, NKX6-1 + endoderm / bugspytkirtlen forfædre. Scale bar = 200 um. (B) Dag 3 repræsentant flowcytometri grunde til CXCR4: PE og CD117: APC antistof farvning. Uplettet prøve på venstre, farvede prøve på højre. (C) Dag 13 repræsentative flowcytometri plot for fase-4 afledt pancreasstamfaderceller udtrykker NKX6-1 og PDX1. IgG kontrol på venstre, farvede prøve på højre. hESC - humane embryonale stamceller, Act A - Activin A; bFGF - grundlæggende fibroblast vækstfaktor, FGF10 - fibroblast vækstfaktor 10, DM - dorsomorphin, NOG - noggin, RA - retinsyre, EGF - epidermal vækstfaktor, NA - nicotinamid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Succesfuld generere NKX6-1 + bugspytkirtlen forfædre fra hPSCs in vitro bygger på anvendelsen af høj kvalitet kulturer af hPSCs og dirigeret differentiering involverer præcis regulering af specifikke signalveje, der styrer vigtige udviklingsstadier i bugspytkirtlen udvikling. Selv om denne protokol kan bruges til at fremkalde robust udtryk for NKX6-1 tværs af en række hPSC linjer som tidligere vist 3, at sikre en effektiv NKX6-1 generation følgende overvejelser bør gøres. Det er vigtigt, at alle celle kultur og medier forberedelse udføres i et sterilt miljø for at forhindre forurening. Det er vigtigt, at hESC kolonier har nået passende konfluens og har ikke begyndt at differentiere før de påbegynder dag 0 af differentiering. Start af differentiering med hESCs, der ikke er optimale, kan resultere i ineffektiv induktion af den endelige endoderm og fortsætter udviklingal stadier. Det er derfor, det er afgørende at analysere celler på dag 3 ved flowcytometri at sikre en effektiv induktion af endelig endoderm. Procentdelen af dobbelt positive CXCR4 + CD117 + celler på dag 3 bør være større end 90% for en effektiv pancreasudviklingen 3. Hvis procentdelen af celler, der udtrykker både CXCR4 og CD117 er lavere end 90%, vil effektiv induktion til pancreas progenitorer sandsynligvis blive kompromitteret (resultater ikke vist). I modsætning til hvad der tidligere er offentliggjort, er det ikke nødvendigt at vaske celler med RPMI før fodring med stadium 1 media 16. Forsigtig omrystning af pladen før opsugning mediet er tilstrækkelig til at fjerne døde celler fra monolaget.
Tilsætningen af dorsomorphin i trin 2 er blevet vist at kun er påkrævede specifikke hPSC ledningerne 18. Således er det vigtigt at bestemme, om dorsomorphin er nødvendigt, når der arbejdes med di fferent hPSC linjer. Desuden har varigheden af trin 3 blevet vist at være kritisk for at specificere enten monohormonal eller polyhormonal progenitorceller og er cellelinie-afhængige 3. Således når man arbejder med en ny hPSC linje er det vigtigt at bestemme varigheden, at cellerne skal dyrkes i trin 3 medier for at bestemme de optimale betingelser for NKX6-1 induktion. For at afgøre dette, skal cellerne dyrkes i Stage 3 medier for 1-4 dage og analyseret 5 dage senere ved flowcytometri for NKX6-1 udtryk.
Effektiv generere populationer beriget med NKX6-1 + celler er vigtig, da Nkx6-1 er kritisk for βcell udvikling 14. Mens andre har udviklet protokoller, der kan differentiere hESC til NKX6-1 + -celler (ca. 60% H1-afledte NKX6-1 + -celler og 55% HUES8-afledt PDX + / NKX6-1 + -celler) 4,"xref"> 5, vores metode konsekvent frembringer> 80% H1-afledt Pdx1 + / NKX6-1 + -celler. Men vores differentiering protokol bygger på anvendelsen af muse embryonale fibroblaster, som begrænser brugen til forskning kun, da vi har endnu til at optimere metoden i Good Manufacturing Practices. Selvom vi ikke har forsøgt at kryopræservere vores scene-4 afledt Pdx1 + / NKX6-1 + celler, er denne tilgang blevet udført af Schulz et al. , Der viste, at cryopræserverede pancreas aggregater var stand til at bevare deres funktion in vivo 19.
I denne artikel beskriver vi en 4-trins protokol til effektivt at generere Pdx1 + / NKX6-1 + pancreas progenitorer fra en række hPSC linjer. Ved at differentiere hPSC gennem fire vigtige stadier i bugspytkirtlen udvikling, denne protokol giver en model til at studere udviklingen af den menneskelige bugspytkirtlen in vitro. Furthermore, eftersom Pdx1 + / NKX6-1 + -celler har potentiale til at generere insulinproducerende celler både in vivo og in vitro (data ikke vist) 3, 4, 5, den embryonale-afledte PDX1 + / NKX6-1 + pancreas progenitorer tilvejebringe en mulig kilde til behandling af diabetes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette håndskrift blev støttet af midler fra Toronto General og vestlige Foundation og Banting & bedste Diabetes Center-University Health Network Graduate Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2,000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
- Canadian Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes (2016).
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
- Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
- Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
- Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
- Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004 (2012).
