Summary
Burada in vitro NKX6-1 + pankreas atalarıdır insan embriyonik kök hücreleri ayırt etmek için 4 aşamalı bir protokol açıklar. Bu protokol, insan pluripotent kök hücre hatları çeşitli uygulanabilir.
Abstract
Pluripotent kök hücreleri, kendine yenilemek ve bunların çalışma ve diyabet gelecekteki tedavisi için kullanılabilir pankreatik progenitör hücrelerinin üretimi için cazip bir kaynak yapma, birden fazla soy ayırt yeteneğine sahiptir. Bu makale, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) pankreas progenitör hücreleri üretmek için tasarlanmış bir dört aşamalı farklılaşma protokolü özetliyor. Bu protokol, insan pluripotent kök hücre (hPSC) hatları, bir dizi uygulanabilir. pankreatik progenitör hücreleri üretmek için alınan yaklaşım doğru pankreas gelişiminin temel aşamaları modellemek için hESC ayırt etmektir. Bu Aktivin A, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve CHIR990210 mevcudiyetinde hücrelerin kültürlenmesi ile elde edilir kesin endoderm, indüksiyonu ile başlar. Fibroblast Büyüme Faktörü 10 (FGF10) ve Dorsomorphin ile daha fazla farklılaşma ve desenlendirme arka foregut benzeyen hücreler üretir. Retin eklenmesioik asit, noggin, SANT-1 ve FGF10 pankreas endoderm karakteristik hücrelerine arka foregut hücreleri ayırır. Son olarak, epidermal büyüme faktörü (EGF) kombinasyonu, nikotinamid ve Noggin PDX1 + / NKX6-1 + hücreleri etkin bir şekilde oluşmasına sebep olur. Akım sitometri pankreas gelişimin temel aşamalarında spesifik belirteçler ifadesini teyit etmek için yapılır. Evre 4 sonunda PDX1 + / NKX6-1 + pankreas progenitörler bağışıklık yetersizliği olan farelere transplantasyonu sırasında olgun β hücreleri üretme yeteneğine sahiptir ve daha fazla in vitro insülin üreten hücreleri üretmek için ayırt edilebilir. Böylece, PDX1 verimli nesil + / NKX6-1 + pankreas ataları, bu protokolde gösterdiği gibi, bu in vitro insan pankreas gelişimini incelemek için bir platform sağlar olarak büyük önem taşımaktadır ve farklılaşma potansiyeli olan hücre kaynağı sağlar EV olabilir β hücrelerientually diyabet tedavisi için kullanılabilir.
Introduction
Diyabet prevalansı artmakta ve Kanada Diyabet Derneği göre, tip 1 diyabet (T1D) 1 olan bu bireylerin% 5-10 ile, Kanada'da 11 milyon kişi diyabet ya da prediyabetik olduğu tahmin edilmektedir. T1D'nin Langerhans adacıklarında içinde bulunan insülin üreten β hücrelerinin yok neden olduğu bir otoimmün hastalıktır. Şu anda, T1D ile yaşayan bireylerin insülin 2 eksojen kaynakları gerektirir. insülin tedavisi gelişmelere rağmen, T1D hastalarının kan şekeri düzenleyen zor bir zaman var ve hipo ve hiperglisemi hem acı çekmeye devam devam ediyor. Bir tedavi umut verici şekilde, tip 1 diyabetin bölgesindeki normogliseminin in vivo ve in vitro 3 hem β hücreleri üretmek insülin sınırsız kaynağı oluşturmak için kullanılabilecek insan embriyonik kök hücreleri (hESC) kullanılmasıdır geri
In vitro hESC insülin üreten hücrelerin üretilmesi en başarılı girişim pankreas gelişimi 4, 5 sırasında meydana gelen embriyonik olayları özetlemek etmektir. Bu doğru gelişen pankreas kilit aşamaları modellemek için farklı sinyal yollarının manipülasyonu içerir. Pankreas gelişimi CXCR4 ve CD117 (c-kit) 8, 9 sentezlenmesi ile karakterize kesin endoderm, indüksiyonu ile başlar. definit kesin düzenlemeive endoderm organizasyonu daha sonra ön-arka ve ventral-dorsal desenlendirme uğrar bağırsak tüpü, oluşumu için gereklidir. Dorsal ve ventral pankreas tomurcukları pankreas gelişimi 10 için gerekli olan pankreas ve duodenum homeobox geni (Pdx1), ifade arka foregut bölgesinden çıkmaktadır. Dorsal ve ventral tomurcukları sigorta ardından geniş epitel biçimlenme ve genişleme 11 uğrar pankreası oluşturmak için. Endokrin ve ekzokrin soy bağlılık ifade eden multipotent progenitör hücreleri (MPCs) üretimi eşlik eder, diğerlerinin yanı sıra, transkripsiyon Pdx1, Nkx6.1 ve Ptf1a 12, 13 faktörleri. Endokrin ve duktal hücreleri olacak MPCs Ptf1a ifadesini düşürürken Nkx6-1 ifade etmeye devam. Bunun aksine, ekzokrin kökenli hücreler expressio kaybedersinizNkx6-1 N ve Ptf1a ifade 12 korur.
Transkripsiyon faktörü Nkx6-1, özellikle hücre kaynaşmasına karşı endokrin progenitör hücrelerin farklılaşması sırasında, pankreas gelişiminde önemli bir rol oynar. Daha önce pankreas gelişimi 14 sırasında β hücrelerinin bozulmuş oluşumuna Nkx6-1 sonuçları, silme açıklandığı gibi,. Bu nedenle, in vitro ve in vivo olarak ensülin üreten β hücrelerin üretilmesi Nkx6-1 etkin indüksiyon gerektirir.
Biz son zamanlarda verimli hPSCs gelen PDX1 + / NKX6-1 + pankreas atalarıdır üretmek için bir protokol geliştirmiştir. Bu hPSC türetilen pankreas ataları bağışıklık yetersizliği olan farelere 3 transplantasyon sırasında olgun β hücreleri oluşturur. 1) kesin endoderm indüksiyon: farklılaşma protokolü 4 ayrılabilir karakteristik aşamaları2) arka foregut desenleme, 3) pankreas şartname ve 4) NKX6-1 indüksiyon. Burada yönettiği farklılaşma her adımı ayrıntılı bir açıklama sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çözümler ve Medya 1. Hazırlık
NOT: steril bir ortamda hücre kültürü için tüm medya hazırlayın. Ortam yapılmış ve hemen kullanılmalıdır. Reaktif bilgilerini malzemeler Tablo l'de verilmiştir.
- farklılaşma Medya
- % 1 glutamin, 2 uM CHIR 99.021, 100 ng / ml Aktivin A, 10 4 M MTG ile RPMI ortamı: Gün 0 Farklılaşma Ortam hazırlayın.
- % 1 glutamin, 100 ng / ml Aktivin A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 ug / ml askorbik asit ile RPMI ortamı: Gün 1-2 Farklılaşma ortamı hazırlayın.
- % 1 glutamin,% 1 B27, 10 4 M MTG, 0.75 uM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10 ile RPMI ortamı: Gün 3-5 Farklılaşma ortamı hazırlayın.
- Gün 6-7 Farklılaşma ortamı hazırlayın: DMEM,% 1 glutamin,% 1 B27, 50 ug / ml askorbik asit, 50 ng / ml FGF10, 0.25 uM SANT-1, 2 uM retinoik asit, 50 ng / ml Noggin ile.
NOT: RetinoikAsit geçen ortama ilave edilmesi gereken ve ortam oksidatif bozunmasını 15 önlemek için ışıktan korunmalıdır. - Günlük 8-12 Farklılaşma ortamı hazırlayın: DMEM,% 1 glutamin,% 1 B27, 50 ug / ml askorbik asit, 50 ng / ml noggin, 100 ng / ml hEGF, 10 mM nikotinamid.
- PBS içinde% 10 FBS, eksi kalsiyum ve magnezyum: FACS tamponu hazırlayın.
2. HESC Farklılaşma
NOT: HESC, çözülmüş geçirildi ve bFGF 16 ile desteklenmiş bir KOSR tabanlı medya varlığında ışınlanmış fare embriyonik fibroblast genişletilir. Hücreler% 80-95 confluency ulaştığında hESC farklılaşma için hazırız. Bu zamanda koloniler tanımlanmış sınırlar ve bir "domelike 'yapısı (Şekil 1A) ile büyük olmalıdır. Tüm hücre kültürü düz tabanlı,% 0.1 jelatin ile kaplanmış doku kültür levhaları muamele gerçekleştirilir. Tipik olarak, hücreler 6 yetiştirilen veyasırası ile, 2 ml veya 1 ml'lik ortam hacminde 12 oyuklu plakalar.
- 0. günde, Gün 0 Farklılaşma Medya ile KOSR tabanlı medya değiştirerek farklılaşma başlar.
- gün 1 ve 2, yavaşça aspire önce tek tabaka herhangi bir ölü hücreleri çıkarmak için plakayı sallayın. Gün 1-2 Farklılaşma Medya ile değiştirin.
- 3 gün, flow sitometri için hasat hücreleri. Hücreler% 90'dan fazla CXCR4 + / CD117 + ifade ederse, 2.4 adıma geçin.
- gün 3 ve 5, nazikçe önce aspire için tek tabaka herhangi bir ölü hücreleri çıkarmak için plakayı sallayın. Gün 3-5 Farklılaşma Medya ile değiştirin.
- gün 6 ve 7, Gün 6-7 Farklılaşma Medya ile değiştirin.
- gün 8, 10 ve 12 üzerinde, Gün 8-12 Farklılaşma Medya ile değiştirin.
- günde 13, akış hasat hücreleri sitometri PDX1 ve NKX6-1 ifadesini belirler.
Sitometrisi Analizi 3. Hasat Hücreleri
- olan hücreleri ayırmaküreticinin protokolü ve 3 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe e göre 1x ticari tripsin çözeltisi.
- 30 ul DNaz I ile 1000 ul FACS Tampon tek hücreleri ticari tripsin çözüm çıkarın ve tekrar süspansiyon
- Bir mikrosantrifüj tüp 35 mikron naylon örgü hücre süzgeç ve transfer kullanarak filtre hücreleri.
- 5 dakika boyunca 455 xg'de Santrifüj hücreleri. Canlı veya sabit boyama için hücreleri hazırlayın.
Akım Sitometrisi 4. Boyama
- Günde 3 canlı boyama hazırlık Akış
- 1000 ul FACS Tampon yeniden süspanse hücreleri. Aktarım 200 ul (her ikisi de lekesiz ve lekeli örnekler için), 96 oyuklu bir plaka, iki kuyulara (yaklaşık 1-3 x 10 5 hücre).
- 2 dakika süreyle 931 xg'de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı.
- APC ve CD117: Primer-konjuge antikor, CXCR4 ile Leke PE 3 için (MALZEMELERİNİN Tablo bakınız)Oda sıcaklığında 0 dak ışıktan korunması.
- 2 dakika süreyle 931 xg'de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı.
- 100 ul FACS Tampon yeniden süspanse örnekleri.
- 2 dakika süreyle 931 xg'de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı.
- 1 ml mikro test tüpleri ya da 5 mL'lik yuvarlak dipli bir tüpler 300-500 ul FACS tampon toplam hacimde her bir örnek ve transfer yeniden süspanse edin.
- 17 akış sitometresinde Run örnekler. Numuneler hemen çalıştırmak mümkün değilse, 4 ° C'de mağaza ışıktan koruyarak.
- Günde 13 sabit boyama hazırlık Akış
- 4 ° C'de 24 saat süre ile, ticari sabitleme / permeabilizasyon çözeltisi içinde hücre pelletini.
- 5 dakika boyunca 455 xg'de santrifüjleyin. 400 ul Perm / Wash çözeltisi içinde süspanse.
- Tw için numune (yaklaşık 0.5-1 x 10 6 hücre) 200 ul aktarın(IgG kontrol ve PDX1 / NKX6-1 boyama için), 96 oyuklu plakanın O kuyu. 2 dakika süreyle 931 xg'de santrifüj.
- Anti-PDX1 ve anti-NKX6-1 birincil veya izotop kontrol antikorları ihtiva eden 100 ul Perm / Wash çözeltisi içinde hücre pelletleri yeniden süspanse edin (Malzeme Tablo). 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir.
- 2 dakika süreyle 931 xg'de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı. 100 ul Perm / Wash çözeltisi içinde süspanse örnekleri.
- 2 dakika süreyle 931 xg'de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı.
- ışıktan korunan, 1 saat boyunca, oda sıcaklığında, ikincil antikorlar ihtiva eden 100 ul Perm / Wash örnekleri yeniden süspanse edin.
- 2 dakika süreyle 931 xg'de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı.
- 100 ul Perm / Yıkama Çözeltisi yeniden süspanse örnekleri.
- 2 dakika süreyle 931 xg'de plaka santrifüj. plakayı ters çevirerek süpernatantı.
- temsilciadım 4.2.9 ve 4.2.10 yemek.
- 1 ml mikro test tüpleri ya da 5 mL'lik yuvarlak dipli bir tüpler 300-500 ul FACS tampon toplam hacimde her bir örnek ve transfer yeniden süspanse edin.
- 17 akış sitometresinde Run örnekler. Numuneler hemen çalıştırmak mümkün değilse, 4 ° C'de mağaza ışıktan koruyarak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A şemada gösterildiği gibi pankreas progenitörlerin verimli üretimi, farklılaşma protokolü esnasında özel sinyal molekülleri tam olarak ilave edildikten sonra farklılaşmamış hücrelerin uygun büyüme ve bakım dayanır. 0. günde, farklılaşmamış hücreler% 80-95 konfluent olmalı ve koloniler tanımlanan kenarları (Şekil 1A) sahip olmalıdır. hücre ölümü bu aşamada oldukça yaygındır beri Aşama 1 sırasında, medya olasılıkla bulutlu görünecektir. Aşama 1 yılı sonu itibariyle, hücreler oranı% 90'ın üzerinde (Şekil 1B) de kesin endoderm işaretlerini, CXCR4 ve CD117, ortak ifade etmelidir.
Hücreler dört aşamalı protokol boyunca ayırt zamanda, bir ince uzun oval benzeri bir görünüm ile ilgili morfoloji değişiklikleri (Evre 1 gözlenmiştir ve 2) daha küçük, yuvarlak hücrelerine (evre 3'te görüldüğü gibi 4) (
Şekil 1: hESC ve destekleyici veri pankreas progenitör farklılaşma şematik. HESC pankreatik progenitör indüksiyonu (A) şematik. farklılaşma Günü, developmentÃl aşaması, baz medya ve her aşamada eklenen sitokinler dahildir. Aşağıda, pankreas farklılaşmanın kilit aşamalarında faz kontrastlı görüntüler gösterilir. Bütün temsilci şekillerde, H1 hücreleri yukarıda tasvir 4 kademeli farklılaşma protokolüne göre farklılaştırılarak belirlenmiştir. Gün 0, farklılaşmamış hESC; Aşama 1, Kesin endoderm; Evre 2, Arka Önbağırsak; Aşama 3, PDX1 + Endoderm; Aşama 4, NKX6-1 + endoderm / pankreas atalarıdır. Ölçek çubuğu = 200 mikron. PE ve CD117: (B) 3. Gün temsilci sitometri CXCR4 için araziler akış APC antikor boyama. Sağ sol, lekeli örnek üzerinde lekesiz örnek. (C) Gün NKX6-1 ve PDX1 ifade evre-4 türetilmiş pankreas progenitör hücreler için 13 temsilci akış sitometri arsa. Sağ sol, lekeli örnek üzerinde IgG kontrol. ; HESC - Aktivin A - İnsan embriyonik kök hücre, bir Yasası bFGF - temel fibroblast büyüme faktörü, FGF10 - fibroblast büyüme faktörü 10, DM - dorsomorphin, NOG - noggin, RA - retinoik asit, EGF - epidermal büyüme faktörü, UA - nikotinamid. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Başarıyla in vitro hPSCs gelen NKX6-1 + pankreas progenitörlerin üreten pankreatik gelişimi sırasında önemli gelişim aşamaları yöneten belirli bir sinyal yollarının doğru düzenlenmesini kapsayan hPSCs yüksek kalitede kültürleri ve yönlendirilmiş farklılaşma kullanımına dayanır. Daha önce aşağıdaki hususlar yapılmalıdır etkin NKX6-1 üretimi sağlamak için, 3 gösterildiği gibi bu protokol hPSC hatlarının çeşitli çapında NKX6-1 sağlam ekspresyonunu indüklemek için kullanılabilir, ancak. Tüm hücre kültürü ve ortam hazırlanması kirlenmesini önlemek için steril bir ortamda gerçekleştirilir önemlidir. HESC koloniler uygun confluency ulaşmış ve önceki farklılaşma gün 0 başlamadan ayırt etmek başlamamış olması önemlidir. Kesin endoderm ve ilerleyen gelişme verimsiz indüksiyon neden olabilir uygun değildir hESC ile farklılaşmayı başlayanal aşamaları. o kesin endoderm verimli indüksiyon sağlamak için flow sitometri günde 3 hücreleri analiz etmek önemlidir nedeni budur. Çift pozitif CXCR4'ün + 3. günde CD117 + hücrelerinin yüzdesi etkin pankreas gelişimi 3% 90 daha büyük olması gerekmektedir. CXCR4 ve CD117 iki ifade eden hücrelerin yüzdesini daha düşük% 90 ise, pankreas progenitörlerin etkin endüksiyon olasılıkla (sonuçlar gösterilmemiştir) tehlikeye atılmış olacaktır. Ayrıca, daha önce yayımlanan aksine, tekniğin bilinen durumundan 1 ortamı 16 besleme RPMI hücreleri yıkamak için gerekli değildir. önceden ortamı aspire plakanın hafifçe çalkalanarak tek tabaka ölü hücreleri çıkarmak için yeterli olacaktır.
2. Aşamadaki dorsomorphin eklenmesi yalnızca belirli hPSC hatları 18 için gerekli olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, di çalışırken dorsomorphin gerekli olup olmadığını belirlemek için önemlidir fferent hPSC hatları. Buna ek olarak, evre 3 süresi monohormonal ya polyhormonal progenitör hücreler ve hücre hattı bağımlı 3 ya belirtmek için kritik olduğu gösterilmiştir. Yeni hPSC hattı ile çalışan şekilde, hücrelerin NKX6-1 indüksiyonu için en uygun şartları belirlemek için Evre 3 ortam kültür gerektiği süresini belirlemek için önemlidir. Bunu belirlemek için, hücreler 1-4 gün süreyle Sahne 3 medyayı kültürlü ve NKX6-1 ifade flow sitometri 5 gün sonra analiz edilmelidir.
Nkx6-1 βcell gelişme 14 için kritik olan verimli bir şekilde NKX6-1 + hücreleri zenginleştirilmiş popülasyonlarını üretilmesi önemlidir. Diğer protokoller gelişmiş olsa da bu NKX6-1 + hücreleri (yaklaşık% 60 H1 türetilmiş NKX6-1 + hücreleri% 55 HUES8 türetilmiş PDX + / NKX6-1 + hücreleri) 4 HESC ayırt edebilir,"xref"> 5, bizim metot sürekli>% 80 H1-türevli PDX1 + / NKX6-1 + hücreler üretir. Ancak, bizim farklılaşma protokolü biz İyi Üretim Uygulamaları yöntemi optimize etmek için henüz olarak, araştırma-sadece kullanımını sınırlar fare embriyonik fibroblastlar kullanımı dayanmaktadır. Bizim sahne-4 türetilmiş PDX1 + / NKX6-1 + hücreler cryopreserve teşebbüs olmasına rağmen, bu yaklaşım başarılı Schulz ve arkadaşları tarafından yapılmıştır. Kim dondurulan pankreas agrega in vivo 19 işlevlerini tutabilen olduğunu gösterdi.
Bu yazıda verimli hPSC hatlarının çeşitli PDX1 + / NKX6-1 + pankreas atalarıdır üretmek için 4 aşamalı bir protokol açıklar. Pankreas gelişme dört temel aşamalardan hPSC ayrıştırarak, bu protokol in vitro insan pankreas gelişimini incelemek için bir model sağlar. FurthPDX1 + / NKX6-1 + hücrelerinin, in vivo ve in vitro olarak, her iki insülin üreten hücreleri üretmek için sahip oldukları potansiyel ermore, 4, 5, HESC türetilmiş PDX1 + / NKX6-1 + pankreas, 3 (veriler gösterilmemiştir) progenitörler diyabet tedavisi için olası bir kaynak sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu yazının Toronto Genel ve Batı Vakfı ve Banting ve En İyi Diyabet Merkezi-Üniversite Sağlık Ağı Lisans Ödülü fon tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2,000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
- Canadian Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.ca/about-diabetes/types-of-diabetes (2016).
- Cogger, K., Nostro, M. C. Recent advances in cell replacement therapies for the treatment of type 1 diabetes. Endocrinology. 156 (1), 8-15 (2015).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of Functional Human Pancreatic beta Cells In Vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2014).
- Kroon, E., et al. Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26 (4), 443-452 (2008).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Gouon-Evans, V., et al. BMP-4 is required for hepatic specification of mouse embryonic stem cell-derived definitive endoderm. Nat Biotechnol. 24 (11), 1402-1411 (2006).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Pan, F. C., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev Dyn. 240 (3), 530-565 (2011).
- Schaffer, A. E., Freude, K. K., Nelson, S. B., Sander, M. Nkx6 transcription factors and Ptf1a function as antagonistic lineage determinants in multipotent pancreatic progenitors. Dev Cell. 18 (6), 1022-1029 (2010).
- Zhou, Q., et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis. Dev Cell. 13 (1), 103-114 (2007).
- Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).
- Sharow, K. A., Temkin, B., Asson-Batres, M. A. Retinoic acid stability in stem cell cultures. Int J Dev Biol. 56 (4), 273-278 (2012).
- Korytnikov, R., Nostro, M. C. Generation of polyhormonal and multipotent pancreatic progenitor lineages from human pluripotent stem cells. Methods. , 56-64 (2016).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Nostro, M. C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Schulz, T. C., et al. A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells. PLoS One. 7 (5), e37004 (2012).
