Summary
Hier beschreiben wir eine 4-Stufen - Protokoll an humanen embryonalen Stammzellen zu NKX6-1 + Pankreas - Vorläufern in vitro zu differenzieren. Dieses Protokoll kann auf einer Vielzahl von menschlichen pluripotenten Stammzelllinien angewendet werden.
Abstract
Pluripotente Stammzellen haben die Fähigkeit, sich selbst in mehrere Linien erneuern und zu differenzieren, so dass sie eine attraktive Quelle für die Erzeugung von Pankreas-Vorläuferzellen zu machen, die für die Untersuchung von und zukünftige Behandlung von Diabetes verwendet werden kann. Dieser Artikel beschreibt einen vierstufigen Differenzierung Protokoll von menschlichen Pankreas-Vorläuferzellen zu erzeugen entworfen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen). Dieses Protokoll kann auf eine Anzahl von menschlichen pluripotenten Stammzellen (HPSC) Leitungen angelegt werden. Der Ansatz zu Pankreas-Vorläuferzellen erzeugen, ist hESCs zu unterscheiden, genau zu wichtigen Phasen der Pankreasentwicklung modellieren. Dies beginnt mit der Induktion der endgültigen Endoderm, die durch Kultivieren der Zellen in Anwesenheit von Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) und CHIR990210 erreicht wird. Eine weitere Differenzierung und Strukturierung mit Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) und Dorsomorphin erzeugt Zellen ähnlich dem hinteren foregut. Die Zugabe von Retinoicsäure-, NOGGIN, SANT-1 und FGF10 unterscheidet hinteren foregut Zellen in Zellen charakteristisch für Pankreas-endoderm. Schließlich führt die Kombination aus Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamid und NOGGIN zur effizienten Erzeugung von PDX1 + / NKX6-1 + Zellen. Durchflusszytometrie durchgeführt wird, die Expression von spezifischen Markern in wichtigen Phasen der Pankreasentwicklung zu bestätigen. Die PDX1 + / + NKX6-1 pankreatischen Progenitoren am Ende der Stufe 4 sind in der Lage zur Erzeugung von reifen β - Zellen nach Transplantation in immundefizienten Mäusen und kann weiter unterschieden werden Insulin-produzierenden Zellen in vitro zu erzeugen. Somit + die effiziente Erzeugung von PDX1 / NKX6-1 + pankreatischen Vorläufern, wie in diesem Protokoll gezeigt, ist von großer Bedeutung , da sie eine Plattform stellt humane Pankreas - Entwicklung in vitro zu studieren und stellt eine Quelle von Zellen mit dem Potential zur Differenzierung zu β-Zellen, die ev konnteentually zur Behandlung von Diabetes verwendet werden.
Introduction
Die Prävalenz von Diabetes nimmt und nach dem kanadischen Diabetes Association, wird geschätzt , dass mehr als 11 Millionen Menschen in Kanada sind Diabetiker oder prediabetic, mit 5-10% dieser Personen Typ - 1 - Diabetes (T1D) 1 mit. T1D ist eine Autoimmunerkrankung, die durch die Zerstörung der insulinproduzierenden β-Zellen verursacht wird, die in den Langerhans-Inseln befinden. Derzeit Personen mit T1D benötigen Insulin exogenen Quellen von 2 leben. Trotz der Fortschritte in der Insulintherapie, weiterhin T1D Patienten eine schwierige Zeit haben, ihren Blutzuckerspiegel zu regulieren und auch weiterhin sowohl Hypo- und Hyperglykämie leiden. Eine vielversprechende Behandlungsform wiederherzustellen normoglycemia in T1D die Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) ist, die verwendet werden könnte , eine unbegrenzte Zufuhr von insulinproduzierenden β - Zellen sowohl in vivo und in vitro 3 zu erzeugen , 4, 5, 6, 7. HESCs zu ß-ähnlichen Zellen differenzier könnte es ermöglichen , Diabetes in vitro zu untersuchen, so dass für die Identifizierung neuer therapeutischer Targets für Typ - 2 - Diabetes und Zellen zur Transplantation in T1D Patienten.
Der erfolgreichste Versuch, Insulin zu erzeugen Zellen aus hES - Zellen in vitro , ist die embryonale Ereignisse zu rekapitulieren , die 4 während des Pankreasentwicklung auftreten, 5. Dabei geht es um die Manipulation von unterschiedlichen Signalwege genau entscheidenden Phasen der Entwicklung der Bauchspeicheldrüse modellieren. Bauchspeicheldrüsenentwicklung beginnt mit der Induktion des definitiven Endoderms, die durch die Expression von CXCR4 und CD117 (c-KIT) 8, 9 gekennzeichnet ist. Präzise Regelung von definitive Endoderm Organisation für die Bildung des Darmrohr, erforderlich, die dann anterior-zu-posterior und ventral-dorsal Musterung unterzogen wird. Die dorsalen und ventralen Pankreas Knospen ergeben sich aus der Gegend des hinteren foregut, die die Pankreas- und Duodenal - Homeobox - Gen (Pdx1) zum Ausdruck bringt, die für Pankreas - Entwicklung 10 notwendig ist. Die dorsalen und ventralen Knospen Sicherung der Bauchspeicheldrüse zu bilden, die dann 11 umfangreiche epithelialen Umbau und Erweiterung erfährt. Engagement für die endokrine und exokrine Linie wird durch die Erzeugung von multipotenten Vorläuferzellen (MPL) begleitet , die zum Ausdruck bringen, unter anderem Faktoren die Transkription Pdx1, Nkx6.1 und PTF1A 12, 13. MPL , die endokrinen und duktalen Zellen werden weiterhin Nkx6-1 zum Ausdruck bringen , während PTF1A Ausdruck abnimmt. Im Gegensatz dazu verlieren exokrinen Linie Zellen expression von Nkx6-1 und PTF1A Ausdruck 12 erhalten.
Der Transkriptionsfaktor Nkx6-1 hat eine Schlüsselrolle in der Bauchspeicheldrüse Entwicklung, vor allem während der Differenzierung von endokrinen Vorläuferzellen Zellen zu ß. Wie zuvor beschrieben, Deletion Nkx6-1 zu einer Beeinträchtigung der Bildung von β - Zellen während der Pankreas - Entwicklung 14. Daher sind sowohl in vitro als auch in vivo insulinproduzierenden β - Zellen zu erzeugen erfordert die effiziente Induktion von Nkx6-1.
Kürzlich entwickelten wir ein Protokoll zur effizienten PDX1 + / NKX6-1 + Pankreas - Vorläufern aus hPSCs erzeugen. Diese HPSC abgeleiteten Pankreas - Vorläufern erzeugen reifen β - Zellen nach Transplantation in immundefizienten Mäusen 3. Die Differenzierung Protokoll kann in 4 unterteilt werden Stufen charakteristisch: 1) endgültige Endoderm Induktion, 2) hinteren foregut Musterung, 3) Pankreas-Spezifikation und 4) NKX6-1 Induktion. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte des gerichteten Differenzierung.
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Protocol
1. Herstellung von Lösungen und Medien
HINWEIS: Bereiten Sie alle Medien für die Zellkultur in einer sterilen Umgebung. Medien muss sofort hergestellt und verwendet werden. Reagenz Details sind in der Werkstoff - Tabelle zur Verfügung gestellt.
- Differenzierung Medien
- Bereiten Sie Tag 0 Differenzierung Medium: RPMI Medium mit 1% Glutamin, 2 uM CHIR 99021, 100 ng / ml Activin A, 10 4 M MTG.
- Bereiten Sie Tag 1-2 Differenzierung Medium: RPMI Medium mit 1% Glutamin, 100 ng / ml Activin A, 10 4 M MTG, 5 ng / ml bFGF, 50 ug / ml Ascorbinsäure.
- Bereiten Sie Tag 3-5 Differenzierung Medium: RPMI Medium mit 1% Glutamin, 1% B27, 10 4 M MTG, 0,75 uM Dorsomorphin, 50 ng / ml FGF10.
- Vorbereitung Tag 6-7 Differenzierungsmedium: DMEM mit 1% Glutamin, 1% B27, 50 ug / ml Ascorbinsäure, 50 ng / ml FGF10, 0,25 uM SANT-1, 2 uM Retinsäure, 50 ng / ml NOGGIN.
HINWEIS: RetinoicSäure sollte zuletzt zu den Medien hinzugefügt werden und Medien sollten vor Licht geschützt werden oxidativen Abbau 15 zu verhindern. - Bereiten Sie Tag 8-12 Differenzierung Medium: DMEM mit 1% Glutamin, 1% B27, 50 ug / ml Ascorbinsäure, 50 ng / ml NOGGIN, 100 ng / ml hEGF, 10 mM Nicotinamid.
- Bereiten FACS-Puffer: 10% FBS in PBS, minus Calcium und Magnesium.
2. HESC Differenzierung
HINWEIS: HESC werden aufgetaut, passagiert und erweitert auf bestrahlte embryonalen Maus - Fibroblasten in Gegenwart eines KOSR basierte Medien , ergänzt mit 16 bFGF. HESCs sind bereit für die Differenzierung, wenn die Zellen 80-95% Konfluenz erreichen. Zu diesem Zeitpunkt sollten die Kolonien groß sein , mit definierten Grenzen und einer "kuppelartigen" Struktur (1A). Alle Zellkultur wird in Flachboden-Gewebekultur behandelten Platten, beschichtet mit 0,1% Gelatine durchgeführt. Typischerweise werden die Zellen in 6 angebaut oderPlatten mit 12 Vertiefungen, in Medienvolumen von 2 ml oder 1 ml.
- Am Tag 0 beginnen Differenzierung durch die KOSR basierte Medien mit Tag 0 Differenzierungsmedium ersetzt.
- An den Tagen 1 und 2, sanft die Platte schütteln alle toten Zellen aus der Monoschicht zu entfernen, bevor Absaugen. Ersetzen Sie mit Tag 1-2 Differenzierung Medien.
- Am Tag 3 Ernte Zellen für die Durchflusszytometrie. Wenn die Zellen mehr als 90% CXCR4 + / CD117 + ausdrücken, gehen 2.4 zu treten.
- An den Tagen 3 und 5, vorsichtig auf die Platte schütteln alle toten Zellen von der einschichtigen vor dem Absaugen zu entfernen. Ersetzen Sie mit Tag 3-5 Differenzierung Medien.
- An den Tagen, 6 und 7, mit Tag 6-7 Differenzierung Medien ersetzen.
- An den Tagen 8, 10 und 12, ersetzen mit Tag 8-12 Differenzierung Medien.
- Am Tag 13, für die Durchfluss Ernte Zellen Zytometrie PDX1 und NKX6-1 Ausdruck zu bestimmen.
3. Ernte Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse
- Distanzieren Zellen mit1x Handels Trypsinlösung nach dem Protokoll des Herstellers und inkubieren bei 37 ° C für 3 min.
- Entfernen Sie kommerzielle Trypsin-Lösung und resuspendieren einzelne Zellen in 1000 ul FACS-Puffer mit 30 ul DNase I.
- Filterzellen unter Verwendung einer 35 & mgr; m Nylon-Mesh-Zelle Sieb und in ein Reaktionsgefäß.
- Zentrifuge Zellen bei 455 xg für 5 min. Vorbereitung der Zellen für entweder live oder feste Färbung.
4. Die Färbung für die Durchflusszytometrie
- Ablauf Vorbereitung für Live - Färbung am Tag 3
- Die Zellen in 1000 ul FACS-Puffer. Transfer 200 ul (ungefähr 1-3 x 10 5 Zellen) in zwei Vertiefungen einer 96-Well - Platte (für beide ungefärbten und gefärbten Proben).
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte.
- Fleck mit primär-konjugierte Antikörper, CXCR4: APC und CD117: PE (siehe M aterialien Tabelle) für 30 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte.
- Resuspendieren Proben in 100 & mgr; l FACS-Puffer.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte.
- Resuspendieren jede Probe werden in einem Gesamtvolumen von 300 bis 500 & mgr; l FACS-Puffer auf 1 ml Mikroröhrchen oder 5-ml-Rundbodenröhrchen.
- Führen Proben auf dem Durchflusszytometer 17. Wenn Proben nicht sofort ausgeführt werden, lagern bei 4 ° C vor Licht geschützt.
- Ablauf Vorbereitung für feste Färbung am Tag 13
- Resuspendieren des Zellpellets in kommerziellen Fixierung / Permeabilisierung Lösung 24 h bei 4 ° C.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 455 g für 5 min. Resuspendieren in 400 ul Perm / Wash-Lösung.
- Übertragung von 200 & mgr; l der Probe (etwa 0,5-1 × 10 6 Zellen) zu two Vertiefungen einer 96-Well-Platte (für IgG-Steuerung und PDX1 / NKX6-1 Färbung). Zentrifuge bei 931 × g für 2 min.
- Resuspendieren der Zellpellets in 100 & mgr; l Perm / Wash - Lösung Anti-PDX1 und anti-NKX6-1 primären oder Isotyp - Kontrolle - Antikörper (siehe Materialien Tabelle) enthält. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte. Resuspendieren Proben in 100 ul Perm / Wash-Lösung.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte.
- Resuspendieren der Proben in 100 ul Perm / Wash enthaltenden lichtgeschützt Sekundärantikörper bei Raumtemperatur für 1 Std.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte.
- Resuspendieren Proben in 100 ul Perm / Waschlösung.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 931 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen der Platte.
- Vertreteressen Schritt 4.2.9 und 4.2.10.
- Resuspendieren jede Probe werden in einem Gesamtvolumen von 300 bis 500 & mgr; l FACS-Puffer auf 1 ml Mikroröhrchen oder 5-ml-Rundbodenröhrchen.
- Führen Proben auf dem Durchflusszytometer 17. Wenn Proben nicht sofort ausgeführt werden, lagern bei 4 ° C vor Licht geschützt.
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Representative Results
Effiziente Erzeugung von Pankreas - Vorläufern beruht auf dem Wachstum und Aufrechterhaltung des undifferenzierten durch die genaue Zugabe spezifischer Signalmoleküle während der Differenzierung Protokoll gefolgt Zellen, wie in der schematischen Darstellung in Figur 1A veranschaulicht. Am Tag 0 sollte undifferenzierten Zellen 80-95% konfluent sein und Kolonien sollten definierten Kanten (1A) aufweisen. Während der Stufe 1 wird die Medien erscheinen wahrscheinlich bewölkt seit Zelltod in dieser Phase durchaus üblich ist. Bis zum Ende der Stufe 1, Zellen sollten die endgültigen endoderm Marker, CXCR4 und CD117, mit einem Anteil von mehr als 90% (Abbildung 1B) zusammen auszudrücken.
Als Zellen im ganzen vierstufigen Protokoll, ihre Morphologie ändert sich von einem langgestreckten, ovalähnliche Aussehen (beobachtet in den Stufen 1 und 2) zu kleineren, runderen Zellen (wie in den Stufen 3 und 4 ersichtlich) zu differenzieren (
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Pankreas - Vorläufer Differenzierung von hES - Zellen und unterstützenden Daten. (A) Schematische Darstellung der Induktion von Pankreas - Vorläufer von hES - Zellen. Tag der Differenzierung, developmental Bühne, Basismedien, und die in jeder Phase hinzugefügt Zytokine sind enthalten. Im Folgenden werden die Bilder Phasenkontrast zu den wichtigsten Phasen der pankreatischen Differenzierung gezeigt. In allen repräsentativen Zahlen wurden H1 Zellen nach dem oben dargestellten 4-stufige Differenzierungsprotokoll unterschieden. Tag 0, undifferenzierte hES; Stufe 1, Definitive Endoderm; Stufe 2, posteriore Vorderdarm; Stufe 3, PDX1 + Endoderm; Stufe 4, NKX6-1 + endoderm / Pankreas - Vorläufern. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m. (B) Tag 3 repräsentative Durchflusszytometrie - Plots für CXCR4: PE und CD117: APC - Antikörper - Färbung. Ungefärbten Probe auf der linken Seite, gefärbte Probe auf der rechten Seite. (C) Tag 13 repräsentative Durchflusszytometrie Plot für die Stufe-4 - abgeleiteten Zellen Pankreas - Vorläufer exprimieren NKX6-1 und PDX1. IgG-Kontrolle auf der linken Seite, gefärbte Probe auf der rechten Seite. hESC - mit menschlichen embryonalen Stammzellen, Act A - Activin A; bFGF - basischen Fibroblasten - Wachstumsfaktor, FGF10 - Fibroblasten - Wachstumsfaktor 10, DM - Dorsomorphin, NOG - NOGGIN, RA - Retinsäure, EGF - epidermaler Wachstumsfaktor, NA - Nicotinamid. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Erfolgreich Erzeugung NKX6-1 + Pankreas - Vorläufern aus hPSCs in vitro beruht auf der Verwendung von hochwertigen Kulturen von hPSCs und gerichtet Differenzierung , die genaue Regelung spezifischer Signalwege beteiligt , die wichtige Entwicklungsstadien während der Pankreasentwicklung bestimmen. Obwohl dieses Protokoll kann verwendet werden , robuste Expression NKX6-1 in einer Vielzahl von HPSC Linien zu induzieren , wie zuvor 3 gezeigt, effiziente NKX6-1 Erzeugung die folgenden Überlegungen vorgenommen werden sollten , um sicherzustellen. Es ist wichtig, dass alle Zellkultur und Medienherstellung in einer sterilen Umgebung, um eine Kontamination zu verhindern, durchgeführt wird. Es ist wichtig, dass die HES-Kolonien entsprechenden Konfluenz erreicht haben und noch nicht zu Beginn Tag 0 der Differenzierung zu unterscheiden, bevor begonnen. Beginnend Differenzierung mit hES, die nicht optimal sind, in ineffizienten Induktion des endgültigen endoderm und Verfahren Entwicklung führen kannal Stufen. Deshalb ist es kritisch ist, Zellen am Tag 3 durch Durchflusszytometrie analysiert effiziente Induktion der endgültigen Endoderm zu gewährleisten. Der prozentuale Anteil der Doppel positive CXCR4 + CD117 + Zellen am Tag 3 sollte 3 für eine effiziente Bauchspeicheldrüsenentwicklung von mehr als 90% betragen. Wenn der Prozentsatz der Zellen, die sowohl CXCR4 und CD117 ist niedriger als 90%, effiziente Induktion pankreatischen Progenitoren exprimiert wird wahrscheinlich beeinträchtigt werden (Ergebnisse nicht gezeigt). Außerdem, im Gegensatz zu dem, was bisher veröffentlicht wurde, ist es nicht notwendig , Zellen mit RPMI vor dem Verfüttern mit Stufe 1 Medien 16 zu waschen. Vorsichtigem Schütteln der Platte vor, die Medien zu Ansaugen ist ausreichend, um die toten Zellen aus der Monoschicht zu entfernen.
Die Zugabe von Dorsomorphin in Stufe 2 wurde nur für spezifische HPSC Leitungen 18 erforderlich , angezeigt werden. Somit ist es wichtig, zu bestimmen, ob Dorsomorphin notwendig ist, wenn mit di Arbeits fferent HPSC Linien. Zusätzlich hat die Dauer der Stufe 3 wurden zum Spezifizieren entweder monohormonal oder polyhormonal Progenitorzellen und ist Zellinie abhängig 3 als kritisch gezeigt. Somit wird, wenn mit einem neuen HPSC Linie arbeiten, ist es wichtig, die Dauer zu bestimmen, dass die Zellen sollten in Stufe 3 Medien kultiviert werden, um die optimalen Bedingungen für die Induktion NKX6-1 zu bestimmen. Um dies zu ermitteln, Zellen sollten in Stufe 3 Medien für 1-4 Tage kultiviert werden und analysierte 5 Tage später mittels Durchflusszytometrie für NKX6-1 Ausdruck.
Rationell Populationen in + Zellen angereichert NKX6-1 erzeugen ist wichtig, da Nkx6-1 für βcell Entwicklung 14 kritisch ist. Während andere Protokolle entwickelt haben , die hESC zu NKX6-1 + Zellen (ca. 60% H1-derived NKX6-1 + Zellen und 55% HUES8 abgeleitete PDX + / NKX6-1 + Zellen) unterscheiden können 4,"xref"> 5, unsere Methode erzeugt konsequent> 80% H1-derived PDX1 + / NKX6-1 + Zellen. Allerdings stützt sich unsere Differenzierung Protokoll über die Verwendung von embryonalen Maus-Fibroblasten, die seine Verwendung zu Forschungs nur begrenzt, da wir noch haben die Methode in Good Manufacturing Practices zu optimieren. Obwohl wir unsere Stufe-4 abgeleitet PDX1 + / NKX6-1 + Zellen nicht versucht haben, kryokonserviert werden , ist dieser Ansatz wurde von Schulz et al erfolgreich durchgeführt. Nachwiesen, dass kryokonservierten Pankreas Aggregate Beibehaltung ihrer Funktion in vivo 19 fähig waren.
In diesem Papier beschreiben wir eine 4-Stufen - Protokoll effizient PDX1 + / + NKX6-1 pankreatischen Progenitoren aus einer Vielzahl von HPSC Linien erzeugen. HPSC durch vier wichtigsten Phasen der Pankreasentwicklung Durch die Differenzierung bietet dieses Protokoll ein Modell für die Entwicklung des menschlichen Pankreas in vitro zu studieren. Furthermore, da die PDX1 + / NKX6-1 + Zellen , die das Potenzial haben , sowohl in vivo Insulin-produzierenden Zellen zu erzeugen , und in vitro (Daten nicht gezeigt) 3, 4, 5, die hES-abgeleitete PDX1 + / + NKX6-1 pankreatischen Progenitoren stellen eine mögliche Quelle für die Behandlung von Diabetes.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Das Manuskript wurde durch Mittel aus dem Toronto General und West-Stiftung und der Banting & Best Diabetes-Zentrum-Universität Health Network Graduate-Award unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and cytokines | |||
| 1-Thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | |
| Activin A | R&D | 338-AC/CF | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Buffer | BD Bioscience | 554722 | |
| BD Perm/Wash buffer, 1x | BD Bioscience | 554723 | |
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| CHIR990210 | Tocris | 4423a | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995 | |
| DNase I | VWR | 80510-412 | |
| Dorsomorphin | Sigma | P5499 | |
| EGF | R&D | 236-EG | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 88150 | |
| FGF10 | R&D | 345-FG | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| Glutamine | Life Technologies | 25030 | |
| Nicotinamide | Sigma | NO636 | |
| NOGGIN | R&D | 3344-NG | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875 | |
| SANT-1 | Tocris | 1974 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Life Technologies | 12605-010 | |
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Antibodies for flow cytometry (working dilutions) | |||
| CD117 PE (1:100) | Life Technologies | CD11705 | |
| CXCR4 APC (1:50) | BD Bioscience | 551966 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400) | Life Technologies | A-31571 | |
| Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 705-546-147 | |
| Isotype Control Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 015-000-003 | |
| Isotype Control Goat IgG | R&D | AB-108-C | |
| NKX6-1 (1:2,000) | DSHB | F55A10 | |
| PDX1 (1:100) | R&D | AF2419 |
References
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