Abstract
Перепрограммировать клетки условно (ЗПК) обеспечивают устойчивый метод для первичной культуры клеток и способности развивать обширные «живой» биобанках пациента клеточных линиях. Для многих типов эпителиальных клеток, различные трехмерные подходы (3D) культуры было описано, что поддерживают улучшенное дифференцированное состояние. В то время как вычисление контрольной суммы сохраняют свою коммитирование к ткани, из которой они изолированы, они не выражают многие из маркеров дифференцировки, ассоциированных с тканью происхождения при выращивании в нормальных условиях двух двухмерных (2D) культуры. Для повышения применение ОЦР пациента, полученных для исследования рака простаты, 3D-формат культура была определена, что позволяет быстро (за 2 недели всего) люминальную дифференцировки клеток в нормальных и опухолевых полученных эпителиальных клеток простаты. При этом фильтрующий элемент на основе формата описан для культивирования и дифференцировки нормальных и злокачественных ОЦР простаты. дехвостатые описание процедур, необходимых для сбора клеток и обработки для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного окрашивания предоставляются. Коллективно формат культура 3D описано в сочетании с первичными линиями CRC, обеспечивает важные средне- и высоко- пропускную способность системы для модели biospecimen на основе исследования простаты.
Introduction
Идентификация и использование методов лечения рака, которые являются персонифицированными для отдельных лиц являются основной целью в исследовании рака. В последнее время новые подходы были разработаны, которые позволяют большей легкостью в создании первичных клеточных культур, потенциально обеспечивая способы и определения и тестирования персонализированных терапии. Например, R-spondin основе простаты Органоид подход 1 позволяет для трехмерных (3D) культивирование нормальных и метастатических клеток рака простаты в коммерческом внеклеточного матрикса (например, Матригель), в то время как метод Кондиционно Перепрограммирование клеток (CRC) разработанный в Джорджтауне 2, 3 использует более стандартных условий 2D культуры. В частности, сочетание ингибитора киназы Rho (Y-27632) и облучают J2 мышиных фидерных клеток фибробластов приводит к неопределенному культивировании кератиноцитов контрольных сумм 2. Методология CRC являетсячрезвычайно прочный, с основными клеточные линии успешно установлены и сохраняться неопределенно долго от простаты и многих других нормальных и злокачественных эпителиальных тканей 3. Важно отметить, что наша CRC технология позволила для быстрой идентификации этиологической основы для рецидивирующего респираторного папилломатоза у пациента, который потерпел неудачу ряд предыдущих лекарственной терапии. Кроме того, с использованием нормальных и опухолевых полученных ЗПК, успешная идентификация FDA одобрило препарат, Vorinostat, было сделано в течение двух недель после биопсии исходной ткани. Пациент был помещен на вориностат, что привело к успешному лечению заболевания 4.
Нормальная предстательная железа состоит из люминала, базальных и редких клеток нейроэндокринных 5. Просветными клетки образуют столбчатую эпителиальный слой железы и выражают рецептора андрогена (AR), а также другие маркеры, такие его стенке, как цитокератинам 8 и 18 и просостояние-специфического антигена (ПСА) 6. С другой стороны , базальные клетки локализованы под слоем полостной и выразить цитокератин 5 и p63, но низкие уровни AR 5. Мы 7, 8, 9 и другие 10 успешно использовали ЗПК простаты в доклинических механистических исследований чувствительности к лекарственным препаратам. Тем не менее, при выращивании в стандартных условиях 2D культуры ткани, эти клетки не в полной мере участвовать AR сигнализации 10. Важно отметить, что при помещении под почечную капсулу иммунодефицитных мышей ЗПК восстановили нормальную простату железистой архитектуру и функции указывает, что ЗПК простаты сохраняют свою коммитирование при размещении в разрешительном среде. Разработка фильтрующего элемента на основе системы клеточной культуры , описанной здесь , позволяет быстро (2 недели) дифференциацию ин витро ОЦР простаты, о чем свидетельствует бу увеличение экспрессии генов-мишеней AR и AR, а также снижение уровня p63.
Фильтрующие вставки, используемые содержат поликарбонатные мембраны (размер пор 0,4 мкм), которые могут поддерживать культивирование клеток млекопитающих. Система, как развивается, использует нормальных и злокачественных ОЦР простаты, 6-луночные культуры и фильтрующих вставок. Среды для культивирования клеток , обусловленные клетками J2 11 помещают в нижнюю камеру и простаты дифференцирующих сред в верхней камере. Описанные здесь методы поддерживают люминальную простаты дифференцировки клеток в течение 2-х недельного срока, в соответствии с целями персонализированной медицины. Кроме того, было необходимо разработать методики, которые позволяют комплексной молекулярной, генетической и клеточной профилирования культур. Подходы для выделения ДНК, РНК и белка из клеток высвобождается с поверхности фильтра, были разработаны и обтекаемый для обработки образцов точной повтора. FinaLLY, методология, необходимые для удаления фильтра, чтобы включить вложение, секционирования и для H & E, иммуногистохимических и иммунофлуоресцентного окрашивания, полностью описан.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Создание 3D клеточных культур Вставка системы
- Поместите 2 поликарбонатные вставки клеточной культуры в перевернутой ориентации (боковой фильтр вверх) вниз в 6 - луночный планшет (рисунок 1А).
- Нанесите тонкий слой 0,1% желатина в воде, чтобы в нижней части вставки и дать высохнуть (10-20 мин) в кабинете биологической безопасности для поддержания стерильности.
- Повторите шаг 1,2 еще два раза в общей сложности 3 приложений 0,1% желатина на вставках.
Примечание: Желатин покрытие поможет ограничить диффузию между камерами. - Для сбора первичной ЗПК от стандартных условий культивирования, добавляют 5 мл PBS мыть колбу культуры.
- Trypsinize клеток с использованием (1 мл для Т-25 и 2 мл в течение Т-75) 0,25% трипсин-ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С. Аккуратно нажмите на сторону колбы, чтобы помочь в выбивании клеток. Затем приступают, чтобы остановить реакцию трипсина и собирают клетки путем добавления 5 мл полной среды DMEM.
- собирать клетки в трубке 15 мл. Центрифуга трубки при температуре 4 ° С и 188 мкг и рассчитывать с использованием автоматического счетчика клеток или гемоцитометра.
- Повторное приостановить 600000 ЗПК в 250 мкл кондиционированной среды (СМ) и добавить к правильной ориентации (боковой фильтр вниз) культуры вставки (рис 1B). Это называется внутренней камеры.
Примечание: CM является F-носитель облученными обусловленные J2 клеток и содержит мкм Y-27632 10 , как было описано ранее 7, 8, 9, 11.
- Нанести 2 мл CM к внешней камере 6-луночного планшета и инкубировать при 37 ° С в течение ночи (в течение, по крайней мере 18 ч).
- Осторожно удалите КМ на внутренней камере с 1 мл или 200 мкл пипетки и медленно добавляют дифференцировки (DM) во внутреннюю камеру с 1 мл пипеткой до полного. Будьте осторожны, чтобы не нарушить слой клеток.
- Проверьте культур ежедневно. Здоровые клетки появляются , как показано на рисунке 2.
- Изменение КМ во внешней камере каждый день или через день, в зависимости от метаболизма клеток.
- Когда носитель внутреннего меняет свой цвет камеры (желтый), осторожно удалите носитель на внутренней камере фильтра с 1 мл или 200 мкл пипетки.
- Аспирируйте СМИ в луночного планшета камеры наружный 6 с наконечником аспирационного.
- С помощью 1 мл пипетку, медленно применять свежий DM во внутреннюю камеру до полного. Будьте осторожны, чтобы не поцарапать или иным образом сместить слой клеток.
- Замените носитель во внешней камере с 2 мл свежей КМ.
- Поддерживать культуру в течение 2-х недель, а затем приступить к обработке для желаемого бимолекулярного изоляции.
Примечание: Каждая строка в 6 - луночного планшета, в общей сложности шесть вставок (рис 1В), должны быть обработаны на эксперимент , чтобы получить достаточное количество клеток для DNА, РНК или белка для анализа. - Аспирируйте СМИ в наружной камере и ополоснуть 2 мл фосфатным буферным раствором (PBS).
- Осторожно удалите носители из внутренней камеры с 1 мл или 200 мкл пипетки и добавить 500 мкл PBS. Избегать соскабливания или иным образом нарушая клетки на мембране.
- Отберите PBS от внешней камеры и осторожно удалите PBS из внутренней камеры с 1 мл или 200 мкл пипетки. После того, как PBS был удален, перейдем непосредственно к соответствующему приложению подробно описано ниже. Не позволяйте мембране высохнуть. Культура может быть кратко в PBS, пока приложение не будет готово начать.
3. Обработка Фильтры для окомкования Banking
- Добавьте 100 мкл 0,25% трипсин-ЭДТА в каждой внутренней камере и инкубируют в течение 5 мин при 37 ° С.
- Кратко и тщательно перемешивать / скрести клеток на поверхности мембраны с 200 мкл пипеткой в то время как пипетированием вверх и вниз (во избежание puncТьюринга мембрану). Инкубировать в течение 1 мин при 37 ° С.
- Добавить 250 мкл КМ к первой внутренней камеры и пипеткой вверх и вниз, осторожно, чтобы промыть фильтр.
- Передача ресуспендировали клетки в соседней камере фильтра, который содержит те же условия, СМИ и повторить пипетированием вверх и вниз.
- Повторите эту процедуру для каждой из вставок одного состояния. Сбор и передача клеток в 1,5 мл центрифужную пробирку.
- Промойте каждую внутреннюю камеру с дополнительным 100-200 мкл КМ, чтобы собрать оставшиеся клетки. Добавить в 1,5 мл центрифужную пробирку на шаге 3.5.
- Спин клетки при 423 х г в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 5 мин.
- Аспирируйте супернатант и мыть осадок клеток один раз с 1000 мкл PBS.
- снова отжим на 423 XG в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 5 мин.
- Отберите PBS и замораживают при -80 ° С для последующего использования.
4. Обработка Фильтры для РНК или ДНК Изоляция
- В качестве фильтра может диссоциировать от вставки, моют диссоциированного мембрану фильтра с помощью пипетки экстракционного раствора вверх и вниз. Собрать как можно больше реагента экстракции, как это возможно за счет наклона 6-луночного планшета и аспирационного любой остаточной жидкости.
5. Обработка Фильтры для белка Изоляция
- Поместите вставку фильтра в 6-луночного планшета на льду. Для внутренней камеры, добавьте 10 мкл буфера для лизиса белка с добавлением 1 мМ фторида натрия (NaF), 1 мМ ванадата натрия (СЧА), 100 мМ dithiothreitol (DTT), и 100 мкл анти-протеаз.
- Перемешайте / скрести клеток на поверхности мембраны с 20 мкл пипеткой в то время как пипетированием вверх и вниз. Избегайте образования пузырьков в буфере для лизиса.
- Выдержите 6-луночный планшет с фильтром вставками на льду в течение 10 мин.
- Повторите выскабливание, а затем промыть поверхность мембраны с буфером для лизиса.
- Соберите лизатов от 6 вставок и переносят в 1,5 мл центрифужную пробирку на льду.
- Ополосните первую мембрану с дополнительными 10 мкл буфера для лизиса и передачи к следующему фильтру.
- Повторите шаг 5.6 для всех вставок, собирая любого остаточного раствора буфера для лизиса и добавляют к 1,5 мл трубки (этап 5.5).
- Инкубируйте образца на льду в течение еще 5 мин.
- Отжим на максимальной скорости (16873 Xg в центрифуге таблицу) в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
- Пипетка лизата супернатант в свежую 1,5 мл трубки.
- Перейдем к анализу концентрации белка или STOповторно лизатов при -80 ° С.
6. Обработка для H & E и Иммуно-окрашивания
- Добавить 500 мкл и 1 мл 10% -ного НСБ (нейтральный забуференный формалин) с внутренней и внешней камеры и пусть инкубировать в течение ночи при температуре 4 ° С.
- Аспирируйте НСБ из внешней камеры и добавьте 1 мл гидроксиэтилкарбоксиметилцеллюлозу агарозы (ВЭП) обработка геля в 1,5 мл центрифуге. Медленно расплавления агарозы в микроволновой печи с использованием малой мощности и повторяется 10-20 секунд импульсы пока агароза не расплавится.
- Держите HEA в теплой ванне 37 ° C, чтобы предотвратить затвердевание, пока готов к использованию.
- Удалить НСБ из внутренней камеры и применить 25 мкл расплавленного АЭМ во внутреннюю камеру и позволить агарозы, чтобы затвердеть в течение 2-5 мин.
- Влажные 2 пены гистологии прокладки в 10% НСБ и поместите одну площадку в вложению кассету (см рисунок 3D).
- Используйте лезвие скальпеля на # 11 (который имеет очень острый, тонко заостренным лезвием) забивать фильтр с нижней стороны вставкикамера, частично выпуская его из пластиковой вставки камеры.
- Поместите небольшое количество (100-200 мкл) NBF в чашке Петри и погружают частично выбиты фильтр в НСБ (фиг.3А).
- С помощью лезвия скальпель # 10, осторожно прижиматься к середине фильтра, с внутренней стороны вставки камеры, чтобы полностью выбивать фильтр из вставки ствола (рис 3б). Если есть какая-либо часть фильтра, которая все еще прикреплен к цилиндру, разъединить его с скальпелем.
- Вырезать фильтр АЭМ с покрытием пополам с # 10 лезвий скальпеля (рис 3C).
- Поместите каждую половину фильтра на поролоновую подкладку в гистологии кассете , полученного на стадии 6.4 (рисунок 3D).
- Добавьте второй 10% НСБ смоченную губку к кассете, прослаивая фильтр.
- Привязать уплотнение кассеты, место в НСБ и инкубировать в течение ночи.
- Технологические фильтры в парафиновые блоки для секционирования и окрашивания, какбыло описано ранее 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Система на основе клеточной культуры вставки является относительно простой и быстрой процедуры получения 3D культур контрольных сумм простаты, которые поддерживает люминальную дифференцировки клеток. Схематическое изображение системы показана (Фигура 1А) , подчеркивающие применение желатина покрытия к нижней поверхности фильтрующего элемента. Вставки переворачивают только для применения желатина. На фигуре 1В фильтры в соответствующей ориентации с последующим культивированием. Используя прозрачную вставку ячейки, представитель образ здорового 3D культуры CRC простаты показан (10X) (Рисунок 2). Плотный наслоение здоровых ОЦР продемонстрировал типично после установления и могут быть визуализированы с использованием стандартной световой микроскопии. Во время первоначального создания, очень важно, чтобы визуализировать слой клеток, образованных для обеспечения того, чтобы этот метод совместим с данной клеточной линии, и что соответствующее приспособление и ЛаЙеринг клеток произошли.
АЭМ применяется к внутренней части пластины, как описано выше. После нанесения АЭМ, необходимо соблюдать осторожность , когда забил фильтр , чтобы удалить его из вставки (фиг 3А, 3В). На всех этапах (Фигуры 3A-3D), уход также должны соблюдать осторожность , чтобы свести к минимуму нежелательное движение НЕА слоя на фильтре с клетками. Слой CRC может быть легко нарушена и повреждены во время перевода в H & E кассеты (Рисунок 3D). После удаления фильтра АЭМ покрытием из пластиковой бочке (Фигуры 3А-3C), фильтр может быть в два раза , и обработаны для секционирования и окрашивания с использованием стандартного вложения кассеты (рис 3D). Расщепление фильтр пополам важно максимально доступную поверхность для поперечного секционирования на H & E и IF.
иммунофлуоресцентного окрашиваниеа также светлого поля (BF) были собраны образы клеток, культивируемых на слое фильтра с помощью микроскопа с ДСУ (Disk Unit Scan) вращающийся диск конфокальной возможностей. Представитель результаты гистологии и H & E окрашивания показаны в поперечном сечении вставки и ячеек фильтра (20X) (рисунок 4). При надлежащем уходе, мы показали, что слой CRC на фильтрующих вставок могут быть разрезали и окрашивали, как это стандартная практика для гистологического исследования тканей. Во время секционирования, возможно для ЗПК отделяться от фильтра в качестве неповрежденного слоя клеток , как показано (рисунок 4). БФ изображение показывает многослойную слои клеток на верхней части пористой мембраны (рис 5А). Отдельные флуоресцентные изображения для ядер (DAPI, Фиг.5В), p63 (рис 5в) и АР (рис 5D) показаны, как это имеет место слияние всех трех маркеров флуоресценции (рис 5д). Наконец, композитнаяе BF и IF Покрышка показано (рис 5F), установление локализации сигнала флуоресценции по отношению к клеткам , и фильтр. Наложение DAPI пятно с p63 IF окрашивание ясно демонстрирует некоторые клетки еще в пролиферативной состоянии. Локализация AR IF окрашивания в ядре является показателем функционального реактивации AR в клетках предстательной железы.
Сравнение между IF нашей системы фильтра вставки и секционного ткани простаты показано (рис 6а, 6б) , чтобы продемонстрировать сходство в развитии нашей CRC вставки слоя к этому эпителия простаты. Канал простаты показывает экспрессию р63, в соответствии с базальных клеток простаты. p63 окрашивания также рассматривается в ОЦР на вставке. Более высокий процент клеток, экспрессирующих P63 наблюдалась в нашей вставке по сравнению с секции неповрежденной ткани. Кроме того, как ядерную и цитоплазматическую AR наблюдаются в тис простаты подать в суд на раздел и в то время как ЗПК на фильтре вставки показывают меньше всего выражения AR, как AR экспрессии ядерного и цитоплазматического окрашивания видно, похожий на неповрежденную простаты.
Рисунок 1: Типичные изображения 6-а блюдо культуры и вставки, входящие в состав 3D - системе культуры. (A) Инвертированный вставки для нанесения покрытия на желатиновой нижней стороне фильтра (стрелка). Большее изображение вставки и фильтра-шоу (вставка). (B) должным образом размещены вставки. Внутренние и наружные камеры системы показаны (стрелки). Коробочная строка B показывает, как несколько образцов получены для данного условия эксперимента. По завершении периода роста 2 недели эти вставки могут быть объединены, чтобы получить достаточное количество материала для анализа."Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Представитель изображения слоя здорового CRCS высевают на прозрачную мембранный фильтр показан. Обе внутренние и наружные камеры содержали кондиционированной среды. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Представитель Изображение фильтра Половинки на две части и помещали в кассету Парафин для встраивания. (A) Фильтр вставки с УВО покрытия после озвучивания и перед снятием. (В) Освобожденный вкладыш фильтра из бочки из поликарбоната. (
Рисунок 4: Представитель H & E Витраж Поперечное сечение патрон фильтра и клетки (20X). И мембрана (нижний) и слой клеток (вверху) показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Серия представителя светлого поля (BF) и иммунофлюоресценции (ИФ) ИзображенияКлетки секционного на фильтре (40X). Разрезы фильтра и клетки показаны. Неокрашенными Б.Ф. изображение клеток на поверхности фильтра (5А) сопровождается изображениями для окрашенного ядра DAPI (5б) и специфического окрашивания для двух различных белков, р63 (5С) и рецептора андрогена (AR, 5D). Составной оверлей из секций клеток (5E, F) определяет локализацию сигналов ПЧ в контексте клеток и фильтра. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Представитель Иммунофлуоресценции (IF) Изображение клеток секционного на фильтре против секции простаты Эпителий из ткани (20Х).Поперечное изображение в разрезе нашего фильтрующего элемента показан (6А) по сравнению с протоковой эпителиальных слоев интактной предстательной железы (Фиг.6В). Окрашивание p63, AR и ядро проводили , как на рисунке 5. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Первичные клеточные линии являются важной и быстро развивающейся платформой для исследований рака. Культура вставки на основе 3D-система культуры поддерживает дифференциацию первичных ОЦР простаты в течение двух недель сроки. Метод фильтра CRC представляет собой новый метод, средний пропускная способность для исследования простаты. Существующие модели мыши PDX имеют много времени и очень дорого, и многие из образцов PDX не могут быть выращены в культуре, что ограничивает исследователя инициированное экспериментирование и их полезность. Кроме того, в то время как показатели успешности установления PDX сильно различаются в 13, метод CRC имеет высокий уровень успеха в создании клеточных линий 3. Мы считаем, наша система будет дополнением к R-spondin основе простаты Органоид подхода; Тем не менее, отсутствие успеха в отношении создания органоидами от первичного рака простаты было сообщено 14. Кроме того, средства массовой информации, методы создания,и техническое обслуживание контрольных сумм значительно проще, чем R-spondin основе простаты Органоид подхода. В качестве дополнительного преимущества, ЗПК могут быть установлены и использоваться для проверки совпавшие нормальных и опухолевых культур для прямых молекулярных сравнений.
Некоторые технические проблемы, которые необходимо учитывать при создании этой системы. Во-первых, желатин покрытие, нанесенное на нижней стороне фильтра вставки помогает, но не исключает, диффузию медиа через мембрану. Частые изменения среды используют для поддержания соответствующего градиента дифференцировки (верхний или апикальный слоя клеток) в зависимости от роста (нижний или базальный слой клеток) условий внутри камеры. Во-вторых, успешные культур 3D CRC требуется относительно высокая плотность посева клеток. Более низкие плотности высева дали плохие результаты в отношении целостности клеточного слоя, который развивается на поверхности фильтра. Это общее соображение при культивировании ЗПК, как они растут наиболее интенсивно, когда поддерживалит высокая плотность клеток. И, наконец, надлежащее удаление и последующее парафин интактного слоя клеток имеет решающее значение для определения степени дифференцировки клеток. Добавление гидроксиэтилцеллюлоза агарозы (УВО) и уменьшенные потери клеток и улучшило общую морфологию клеток по сравнению с не встроенные фильтры (не показаны). После того, как правильно вложенным, фильтры разрезали и обработаны таким образом, неотличимой от типичных образцов тканей и клеток.
Мы только начинаем подражать архитектуру эпителия простаты с помощью этого метода фильтра. Дополнительные изменения условий культивирования, в средствах массовой информации и к субстрату, оправдано, которые могут быть легко решены. Например, реформулированный дифференциация Medias, которые могут более эффективно содействовать люминал против базальной дифференцировки может быть быстро проверена. Так как лентивирусов инфекция контрольных сумм была выполнена так же легко , как и с коммерческими раковыми клетками 7 и 2D - контрольных сумм имеют Alпоэтому были трансфицированы cas9 / ген CRISPR технологии редактирования векторов, чтобы навсегда изменить геном клеток (данные не показаны), эффект от мутировавших, удаленных или ремонтируемых генов могут быть проверены. Кроме того, слежение за родословная может быть возможным путем введения линиеспецифический репортерных генов.
В дополнение к изменению СМИ или клетки, модификации поверхности фильтра также могут быть проверены. Различные фильтры мембранные подложки коммерчески доступны. Кроме того, мы обнаружили, что коммерческий внеклеточный матрикс обеспечивает подходящую среду роста при нанесении на внутренней стороне фильтра. В качестве одной из целей системы вставки, чтобы лучше моделировать микросреду простаты, возможно, наиболее интересные модификации могут быть введение нормальных или опухолевых стромальных клеток, полученных либо в совместной культуре с ОЦР в пределах границ вставки или в нижней камере, чтобы кондиционировать в культуральную среду. Изменение вставки хорошо с разделами оF decellularized ткани простаты также возможно. При таком подходе, стромальные / эпителиальные взаимодействия могли позволить первичные клетки использовать decellularized ткани в качестве каркаса для роста.
Способность создавать первичные клетки и впоследствии обеспечить условия для их дифференциации является идеальным форматом для более биологически значимых исследований в нормальной железистой развития, а также для исследования рака. Система, описанная в данном документе представляет собой платформу, с помощью которой неограниченное число типов клеток и модификации могут быть объединены, чтобы адаптировать систему к индивидуальным потребностям экспериментальных и надежно собирать образцы для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Т32 (CA 9686-18) и TL1 (TL1TR001431) постдокторский грантов обучение наград (LT), DOD PC140268 (CA), W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA), а также U01 PAR-12-095 (Kumar) и P30 CA051008-21 (Weiner). Пример фиксации, секционирования и окрашивание проводили в Lombardi Comprehensive Cancer Center гистологии и тканей совместно используемых ресурсов. Мы благодарим Ричарда Schlegel за полезные обсуждения. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института рака или Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 | |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 | |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 | |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 | |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 | |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 | |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 | |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 | |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 | |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 | |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z | |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 | |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
References
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
- Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
- Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T.
- Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
- Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
- Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
- Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
