Name: Un sistema di coltura 3D Rapid Cartuccia filtro-based per la prostata primaria cellulare Differenziazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Scopri un sistema di coltura 3D basato su inserti filtranti per cellule prostatiche primarie. Questo metodo rapido consente la differenziazione epiteliale e l'isolamento di RNA, DNA e proteine per la ricerca sul cancro prostatico.

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1. Istituzione del Cell 3D cultura sistema di inserimento <ol><li> Posizionare inserti colture cellulari 2 policarbonato in un orientamento invertita (lato filtro verso l&#39;alto) verso il basso in un piatto ben 6 (Figura 1A). </li><li> Applicare uno strato sottile di 0,1% di gelatina in acqua al lato inferiore dell&#39;inserto e lasciare asciugare (10-20 min) in una cappa di sicurezza biologica per mantenere la sterilità. </li><li> Ripetere passaggio 1.2 altre due volte per un totale di 3 applicazioni di 0,1% di gelatina sugli inserti. NOTA: Il rivestimento di gelatina aiuterà diffusione limite tra le camere. </li><li> Per raccogliere i CRC primari da condizioni di coltura standard, aggiungere 5 ml di PBS per lavare il pallone di coltura. <ol><li> Trypsinize le cellule utilizzando (1 mL per un T-25 e 2 mL di T-75) 0,25% tripsina-EDTA per 5 min a 37 ° C. toccare delicatamente il lato del pallone per aiutare a sloggiare le cellule. Quindi procedere per bloccare la reazione tripsina e raccogliere le cellule con l&#39;aggiunta di 5 ml di DMEM completo. </li><li> Raccogliere<html> le cellule in una provetta da 15 ml. Centrifugare la provetta a 4 ° C e 188 XG e contare utilizzando un contatore di cellule automatico o un emocitometro. </li><li> Risospendere 600.000 CRC in 250 microlitri mezzi (CM) condizionati e aggiungere alla correttamente orientata (lato del filtro verso il basso) la cultura inserto (Figura 1B). Questo è indicato come la camera interna. Nota: CM è F-mezzi condizionati dalle cellule irradiate J2 e contiene 10 micron Y-27632 come precedentemente descritto 7, 8, 9, 11. </li></ol></li><li> Applicare 2 ml di CM alla camera esterna del 6 pozzetti e incubare a 37 ° C per una notte (per almeno 18 h). </li><li> Rimuovere accuratamente il CM sulla camera interna con un 1 mL o 200 microlitri pipetta e aggiungere lentamente supporti differenziamento (DM) alla camera interna con una mL pipetta 1 fino completa. Fare attenzione a non disturbare lo strato di cellule. </li></ol>Le &quot;&gt; 2. Manutenzione delle Culture 3D <ol><li> Controllare le culture ogni giorno. Le cellule sane appaiono come mostrato in Figura 2. </li><li> Modificare il CM nella camera esterna ogni giorno o ogni altro giorno a seconda del metabolismo delle cellule. </li><li> Quando i media del interiore cambia colore da camera (giallo), rimuovere con attenzione i media sulla camera di filtro interno con un 1 mL o 200 microlitri pipetta. </li><li> Aspirare il supporto nel esterna 6 ben camera di piatto con una punta di aspirazione. </li><li> Usando una pipetta 1 ml, applicare lentamente DM fresco alla camera interna fino al completo. Fare attenzione a non graffiare o altrimenti rimuovere lo strato di cellule. </li><li> Sostituire i media nella camera esterna con 2 ml di CM fresco. </li><li> Mantenere le culture per 2 settimane, e quindi procedere al trattamento per l&#39;isolamento bimolecular desiderato. NOTA: Ogni riga nella piastra 6 bene, un totale di sei inserti (Figura 1B), dovrebbe essere processato per esperimento per acquisire abbastanza cellule per DNA, RNA o proteine ​​per l&#39;analisi. </li><li> mezzi Aspirare nella camera esterna e risciacquare con 2 ml di tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Rimuovere con attenzione dei media dalla camera interna con un 1 mL o 200 microlitri pipetta e aggiungere 500 microlitri di PBS. Evitare di raschiare o comunque disturbare le cellule sulla membrana. </li><li> Aspirare PBS dalla camera esterna e trasferire PBS dalla camera interna con un 1 mL o 200 microlitri pipetta. Una volta che il PBS è stato rimosso, procedere direttamente alla applicazione appropriata descritto di seguito. Non lasciare che la membrana si asciughi. La coltura può essere mantenuto brevemente in PBS finché l&#39;applicazione è pronto per iniziare. </li></ol> 3. L&#39;elaborazione dei Filtri per Pellet Banking <ol><li> Aggiungere 100 microlitri 0,25% tripsina-EDTA per ogni camera interna e incubare per 5 min a 37 ° C. </li><li> In breve e con attenzione agitano / raschiare le cellule sulla superficie della membrana con una pipetta 200 microlitri mentre pipettando su e giù (evitare puncturing la membrana). Incubare per 1 min a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 250 ml di CM alla prima camera interna e pipetta su e giù delicatamente per lavare il filtro. </li><li> Trasferimento risospesa celle alla camera del filtro adiacente che contiene le stesse condizioni di media e ripetere pipettando su e giù. </li><li> Ripetere questa procedura per ciascuno di detti inserti di un&#39;unica condizione. Raccogliere e trasferire le cellule in una provetta da 1,5 centrifuga. </li><li> Lavare ogni camera interna con un ulteriore 100-200 ml di CM per raccogliere tutte le cellule rimanenti. Aggiungere alla provetta da 1,5 mL centrifuga nel passaggio 3.5. </li><li> Spin le cellule a 423 xg in una microcentrifuga a 4 ° C per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e lavare il pellet di cellule una volta con 1000 ml di PBS. </li><li> Spin nuovo a 423 xg in una microcentrifuga a 4 ° C per 5 min. </li><li> Aspirare PBS e congelamento a -80 ° C per un uso successivo. </li></ol> 4. L&#39;elaborazione dei Filtri per RNA o DNA Isolation <ol&gt; <li> Aggiungere 200 microlitri di guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio o reagente simile estrazione alla camera interna e agitare brevemente le cellule sulla superficie della membrana pipettando su e giù. </li><li> Incubare nel reagente di estrazione per 5 min a temperatura ambiente con la camera esterna asciutta. <ol><li> Poiché il filtro può dissociarsi dal dell&#39;inserto, lavare la membrana del filtro dissociato pipettando la soluzione di estrazione su e giù. Raccogliere quanto più del reagente di estrazione possibile inclinando la piastra ben 6 ed aspirando il liquido residuo. </li></ol></li><li> Seguire il protocollo del produttore per la purificazione e il recupero di DNA, RNA o proteine. </li></ol> 5. L&#39;elaborazione dei Filtri per l&#39;isolamento delle proteine <ol><li> Posizionare la cartuccia del filtro nella piastra 6 bene su ghiaccio. Per la camera interna, aggiungere 10 ml di tampone proteine ​​lisi integrato con 1 fluoruro di sodio mM (NaF), 1 mM di sodio vanadato (NAV), 100 mM dithiothreitol (DTT) e 100 ml di cocktail di anti-proteasi. </li><li> Agitare / raschiare le cellule sulla superficie della membrana con una pipetta 20 ml mentre pipettando su e giù. Evitare di generare bolle nel tampone di lisi. </li><li> Incubare la piastra 6 bene con cartucce filtranti in ghiaccio per 10 min. </li><li> Ripetere raschiatura e quindi risciacquare la superficie della membrana con il tampone di lisi. </li><li> Raccogliere i lisati dai 6 inserti e trasferire in una provetta da 1,5 ml centrifuga sul ghiaccio. </li><li> Risciacquare la prima membrana con altri 10 ml di tampone di lisi e trasferimento al filtro successivo. </li><li> Ripetere il passaggio 5.6 per tutti gli inserti, la raccolta di qualsiasi soluzione tampone di lisi residuo e aggiungere al 1,5 ml di tubo (passo 5,5). </li><li> Incubare il campione in ghiaccio per un ulteriore 5 min. </li><li> Spin alla massima velocità (16.873 xg in una centrifuga da tavolo) per 15 min a 4 ° C. </li><li> Pipetta lisato surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml. </li><li> Procedere all&#39;analisi di concentrazione di proteine ​​o store lisati a -80 ° C. </li></ol> 6. elaborazione per H &amp; E e Immuno-colorazione <ol><li> Aggiungere 500 microlitri e 1 ml di 10% NBF (formalina neutra tamponata) alla camera interna ed esterna e lasciate incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Aspirare il NBF dalla camera esterna e aggiungere 1 ml di agarosio idrossietil (HEA) l&#39;elaborazione di gel per un mL centrifuga 1.5. Lentamente sciogliere l&#39;agarosio in un forno a microonde con bassa potenza e ripetuto 10-20 s impulsi fino a quando l&#39;agarosio è sciolto. </li><li> Tenere il HEA in un bagno caldo a 37 ° C per evitare la solidificazione fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Rimuovere il NBF dalla camera interna e applicare 25 ml di HEA fusa alla camera interna e consentire l&#39;agarosio solidificare per 2-5 min. </li><li> Wet 2 schiuma pastiglie istologia a 10% NBF e mettere un pad in una cassetta embedding (vedi Figura 3D). </li><li> Utilizzare un # 11 bisturi (che ha una lama a punta fine molto forte) di segnare il filtro dal lato inferiore dell&#39;insertocamera, parzialmente svincolandola dalla camera inserto in plastica. </li><li> Mettere una piccola quantità (100-200 ml) di NBF in una capsula di Petri e immergere il filtro parzialmente sloggiato nel NBF (Figura 3A). </li><li> Con # 10 bisturi, premere delicatamente contro il centro del filtro, dall&#39;interno della camera di inserto, per rimuovere completamente il filtro dal inserto barilotto (Figura 3B). Se non vi è alcuna parte del filtro che è ancora attaccato alla canna, tagliare con il bisturi. </li><li> Tagliare il filtro HEA rivestita a metà con il # 10 bisturi lama (Figura 3C). </li><li> Disporre ciascuna metà del filtro sul tappetino in gomma nella cassetta istologia preparato al punto 6.4 (Figura 3D). </li><li> Aggiungere il secondo il 10% NBF spugna imbevuta alla cassetta, sandwich il filtro. </li><li> Snap sigillare la cassetta, posto in NBF, e incubare durante la notte. </li><li> filtri di processo in blocchi di paraffina per il sezionamento e la colorazione comedescritto in precedenza 12. </li></ol>

<ol><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+and+feeder+cells+induce+the+conditional+reprogramming+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells.</a> Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reprogrammed+cells+to+identify+therapy+for+respiratory+papillomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis.</a> N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).</li>
<li>Signoretti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+is+a+prostate+basal+cell+marker+and+is+required+for+prostate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development.</a> Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).</li>
<li>Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).</li>
<li>Ringer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+the+p53+tumor+suppressor+protein+bridges+the+apoptotic+and+autophagic+signaling+pathways+to+regulate+cell+death+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).</li>
<li>Pollock, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strigolactone+analogues+induce+apoptosis+through+activation+of+p38+and+the+stress+response+pathway+in+cancer+cell+lines+and+in+conditionally+reprogrammed+primary+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells.</a> Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).</li>
<li>Crogliom, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26910887">Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Saeed, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Drug+Testing+of+Patient-derived+Conditionally+Reprogrammed+Cells+from+Castration-resistant+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer.</a> Eur Urol. , (2016).</li>
<li>Palechor-Ceron, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+induces+diffusible+feeder+cell+factor%28s%29+that+cooperate+with+ROCK+inhibitor+to+conditionally+reprogram+and+immortalize+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells.</a> Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).</li>
<li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> J Vis Exp. (99), e52868(2015).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
<li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

linee cellulari primarie sono una piattaforma importante e in rapido sviluppo per la ricerca sul cancro. Il sistema di coltura 3D basato su inserto cultura sostiene la differenziazione della prostata CRC primari entro un lasso di tempo di due settimane. Il metodo del filtro CRC rappresenta un nuovo metodo di media produttività per la ricerca della prostata. Esistenti modelli del mouse PDX sono in termini di tempo ed estremamente costoso, e molti dei campioni PDX non possono essere coltivate in cultura, limitando la sper...

L&#39;identificazione e l&#39;uso di terapie del cancro che sono personalizzati per gli individui sono un obiettivo primario nella ricerca sul cancro. Recentemente, sono stati sviluppati nuovi approcci che consentono una maggiore facilità nella creazione di colture cellulari primarie, fornendo potenzialmente modi sia di identificare e testare terapie personalizzate. Ad esempio, la prostata basata R-spondina approccio organoide 1 consente tridimensionale (3D) coltura di normali e metastatici cellule tumorali della prostata in una matrice extracellulare commerciale (ad esempio, Matrigel), mentre il metodo condizionale riprogrammazione delle cellule (CRC) sviluppato presso Georgetown 2, 3 utilizza più condizioni di coltura 2D standard. In particolare, la combinazione di un inibitore della chinasi Rho (Y-27632) e cellule feeder fibroblasti murini J2 irradiati portano alla coltura indefinito di CRC cheratinociti 2. La metodologia è CRCestremamente robusto, con linee cellulari primarie stabilite con successo e mantenuto a tempo indeterminato dalla prostata e molti altri tessuti epiteliali normali e maligne 3. È importante sottolineare che la nostra tecnologia CRC ha permesso la rapida identificazione della base eziologico per papillomatosi respiratoria ricorrente in un paziente che non era riuscito un certo numero di trattamenti farmacologici precedenti. Inoltre, utilizzando normali e tumorali derivate dal CRC, l&#39;identificazione di successo di un farmaco approvato dalla FDA, vorinostat, è stata fatta entro due settimane dalla biopsia dei tessuti iniziale. Il paziente è stato posto sulla vorinostat, conseguente trattamento di successo della loro malattia 4. La prostata normale si compone di luminale, basale e le cellule neuroendocrine rari 5. cellule luminali formano lo strato epiteliale colonnare della ghiandola ed esprimono il recettore degli androgeni (AR), così come altri marcatori luminali quali citocheratine 8 e 18 e proantigene specifico-stato (PSA) 6. Viceversa, le cellule basali sono localizzati sotto lo strato luminale ed esprimono citocheratina 5 e p63, ma bassi livelli di AR 5. Abbiamo 7, 8, 9 e altri 10 hanno utilizzato con successo CRC prostata in preclinici indagini sensibilità ai farmaci meccanicistici. Tuttavia, se coltivate in condizioni di coltura tissutale 2D standard, queste cellule non riescono a cooperare pienamente AR segnalazione 10. È importante sottolineare che, quando posto sotto la capsula renale di topi immunodeficienti, il CRC riacquistato normale prostata architettura e la funzione ghiandolare che indica che CRC prostata mantengono il loro impegno lignaggio, quando sono immessi in un ambiente permissivo. Lo sviluppo del sistema di coltura cellulare basato inserto filtro qui descritto consente rapidi (2 settimane) differenziazione in vitro di CRC prostata come evidenziato by l&#39;aumentata espressione di geni bersaglio AR e AR, nonché diminuzione dei livelli di p63. Gli inserti del filtro utilizzati contengono membrane di policarbonato (dimensione dei pori, 0,4 micron) che possono sostenere la coltura di cellule di mammifero. Il sistema, sviluppato, fa uso di normali e maligne CRC prostata, piastre di coltura così 6 e gli inserti del filtro. Terreni di coltura cellulare condizionati dalle cellule J2 11 è posto nei media da camera e della prostata differenziazione di fondo nella camera superiore. Le tecniche descritte nel presente documento supportano la differenziazione delle cellule della prostata luminale entro una settimana 2 lasso di tempo, in linea con gli obiettivi della medicina personalizzata. Era inoltre indispensabile sviluppare le metodologie che consentono la profilatura molecolare, genetica e cellulare completa delle culture. Approcci per isolare DNA, RNA e proteine ​​da cellule rilasciate dalla superficie del filtro sono stati sviluppati e semplificato per l&#39;elaborazione del campione accurata ripetizione. Finally, la metodologia necessaria per la rimozione del filtro per consentire incorporamento, sezionamento e per H &amp; E, immunoistochimica e immunofluorescenza colorazione, è completamente descritto.

<table><tbody><tr><td>Inserti per colture Corning Costar Snapwell Corning</td><td></td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>Millicell Inserti per colture cellulari</td><td>Millipore</td><td>PIHP01250</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina 0,1% in acqua</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Saftey Scapel 10 Blade</td><td>Integra Miltex</td><td>4-510</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi Standard Sterile 11 Lame</td><td>Integra Miltex</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Tampone di Lisi ed Estrazione</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro di Sodio</td><td>Fishcer Scientific</td><td>S299-100</td><td></td></tr><tr><td>Vanadato di Sodio</td><td>Fishcer Scientific</td><td>13721-39-6</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483123</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi (AEBSF, aprotinina, bestatina, E-64, lepeptina e pepstatina A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA (1x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081& nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Nutrienti Mix Media</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato Acido inibitore della roccia</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-333-M025</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>PHG0315</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Tossina colera</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3012</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264550</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Histogel Specimen Processing Gel ( idrossietilagarosio (HEA))</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Medicazione non aderente</td><td>Telfa</td><td>KDL2132Z</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari Sigma</td><td></td><td>SIAL0167</td><td></td></tr><tr><td>HISTOSETTE II Cassette di elaborazione / inclusione dei tessuti</td><td>Crystalgen</td><td>CG-M492</td><td></td></tr></tbody></table>

un sistema di coltura 3d rapid cartuccia filtro-based per la prostata primaria cellulare differenziazione

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

le cellule riprogrammate condizionale (CRC) forniscono un metodo sostenibile per la coltura di cellule primarie e la capacità di sviluppare ampie &quot;biobanche di vita&quot; di pazienti derivate linee cellulari. Per molti tipi di cellule epiteliali, vari approcci tridimensionale (3D) di coltura sono stati descritti che supporta uno stato differenziato migliorata. Mentre CRC mantengono la loro lineage committment al tessuto dal quale sono isolati, non riescono ad esprimere molti dei marcatori di differenziazione associate al tessuto di origine quando coltivate in normali due condizioni dimensionali (2D) di coltura. Per migliorare l&#39;applicazione della CRC paziente-derivato per la ricerca sul cancro alla prostata, un formato di cultura 3D è stato definito che consente una rapida luminale differenziazione cellulare (2 settimane in totale) in entrambe le cellule epiteliali della prostata normali e tumorali di derivazione. Qui, un formato basato su inserto del filtro è descritto per la coltura e differenziazione di entrambe le normali e maligni CRC prostata. A deDescrizione coda delle procedure richieste per la raccolta delle cellule e di elaborazione per la colorazione immunoistochimica e immunofluorescenza sono forniti. Collettivamente formato coltura 3D descritto, in combinazione con le linee CRC primari, fornisce un importante medio per evidenziare sistema modello produttività per la ricerca della prostata biospecimen-based.

Il sistema basato su inserto coltura cellulare è una procedura relativamente semplice e rapida per la produzione di colture 3D di CRC prostata che supporta la differenziazione delle cellule del lume. Uno schema del sistema è mostrato (Figura 1A) evidenziando l&#39;applicazione del rivestimento di gelatina alla superficie inferiore della cartuccia filtrante. Gli inserti sono ribaltati solo per l&#39;applicazione della gelatina. Nella Figura 1B i filtri so...

Qui, presentiamo un metodo per la creazione di un sistema rapido in vitro che supporta la coltura tridimensionale e la successiva differenziazione luminale delle cellule epiteliali primarie della prostata.

Un sistema di coltura 3D Rapid Cartuccia filtro-based per la prostata primaria cellulare Differenziazione

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

L'obiettivo generale di questo sistema di coltura 3D basato su inserti filtranti per cellule primarie derivate da pazienti è quello di stabilire un modello in vitro più biologicamente rilevante per la ricerca sul cancro alla prostata. Utilizzando cellule umane primarie, questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia dello sviluppo prostatico così come nel cancro alla prostata. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di una metodologia in vitro relativamente rapida per l'allestimento di cellule primarie della prostata differenziate, che consente inoltre l'isolamento rapido di biomolecole come RNA, DNA e proteine.La dimostrazione visiva di questi metodi è fondamentale poiché l'elaborazione delle cellule sull'inserto filtrante per istologia o per il recupero di RNA e proteine è delicata e dipendente dal tempo. Per aiutare a limitare la diffusione tra le camere all'interno di un armadio di sicurezza biologica, applicare uno strato sottile di gelatina allo 0,1% sulla faccia inferiore degli inserti e lasciarli asciugare. Ripetere questa procedura altre due volte.Quindi applicare le cellule nella camera interna degli inserti rivestiti con gelatina e coltivarle per un periodo fino a due settimane. Dopo due settimane, applicare direttamente gli inserti filtranti coltivati a una delle applicazioni a valle appropriate descritte di seguito. Per iniziare questa procedura, aspirare il PBS dalla camera esterna e rimuovere con attenzione il PBS dalla camera interna.Gli inserti coltivati possono essere mantenuti brevemente in PBS fino a quando non si è pronti per iniziare l'applicazione, ma è necessario evitare che la membrana si secchi. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di tripsina EDTA 0,25% in ogni camera interna. Quindi, incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius.Successivamente, raschiare brevemente e con attenzione le cellule sulla superficie della membrana utilizzando una pipetta da 200 microlitri, aspirando e dispensando più volte. Quindi incubare per un minuto a 37 gradi Celsius. Dopo un minuto, aggiungere 250 microlitri di mezzo condizionato alla prima camera interna e pipettare delicatamente su e giù per risciacquare il filtro.Dopo questo trasferimento, risospendere le cellule nella camera del filtro adiacente che contiene le stesse condizioni di mezzo e ripetere la pipettatura su e giù. Ripetere questa procedura per ciascuno degli inserti di una singola condizione. Successivamente, raccogliere le cellule e trasferirle in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri.Risciacquare ogni camera interna con ulteriori 100-200 microlitri di mezzo condizionato per raccogliere eventuali cellule residue e aggiungerli al tubo da centrifuga da 1,5 millilitri. Successivamente, centrifugare le cellule in un microcentrifugo a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopodiché, aspirare il soprannatante e lavare il pellet cellulare una volta con 1.000 microlitri di PBS.Centrifugare nuovamente le cellule in un microcentrifugo a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo cinque minuti, aspirare il PBS e congelare il campione a meno 80 gradi Celsius per un uso successivo. In questa procedura, aggiungere 200 microlitri di tiocianato di guanidinio fenolo cloroformio o di un reagente di estrazione simile alla camera interna e agitare brevemente le cellule sulla superficie della membrana mediante pipettaggio su e giù.Quindi incubare le cellule nel reagente di estrazione per cinque minuti a temperatura ambiente e lasciare la camera esterna asciutta. Successivamente, lavare la membrana filtrante aspirando e dispensando ripetutamente la soluzione di estrazione con la pipetta. Raccogliere la maggior quantità possibile di reagente di estrazione inclinando la piastra a sei pozzetti ed aspirando qualsiasi liquido residuo.Si noti che il filtro potrebbe staccarsi dall'inserimento. Lavare la membrana del filtro staccata, se presente. Quindi raccogliere la maggior quantità possibile del reagente di estrazione e seguire il protocollo del produttore per la purificazione e il recupero di DNA, RNA o proteine.È necessario prestare attenzione durante il lavaggio delle cellule e del filtro con tiocianato di guanidinio, poiché un'agitazione eccessiva può produrre RNA di scarsa qualità. Per isolare le proteine dal filtro, posizionare il filtro nell'apposito alloggiamento della piastra a sei pozzetti su ghiaccio. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di buffer di lisi proteico nella camera interna.Agitare e raschiare le cellule sulla superficie della membrana con una pipetta da 20 microlitri, aspirando e dispensando più volte, e fare attenzione a non generare bolle nel buffer di lisi. Successivamente, incubare la piastra a sei pozzetti con inserti filtranti sul ghiaccio per dieci minuti. Ripetere il raschiamento, quindi risciacquare la superficie della membrana con il buffer di lisi.Raccogliere i lisati dai sei inserti e trasferirli in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri posto sul ghiaccio. Successivamente, risciacquare la prima membrana con ulteriori 10 microlitri di buffer per la lisi e trasferirla al filtro successivo. Ripetere questa procedura per tutti gli inserti di una determinata condizione sperimentale, raccogliendo ogni eventuale soluzione residua di buffer per la lisi e aggiungerla al tubo da 1,5 millilitri.Incubare il campione sul ghiaccio per ulteriori cinque minuti. Successivamente, centrifugarlo alla velocità massima per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine, trasferire il lisato con una pipetta in un tubo fresco da 1,5 millimetri.Procedere quindi all'analisi della concentrazione proteica oppure conservare i lisati a meno 80 gradi Celsius. In questo procedimento, aggiungere 500 microlitri e un millilitro di NBF al 10% rispettivamente nella camera interna e in quella esterna. Incubarli tutta la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, aspirare l'NBF dalla camera esterna e aggiungere un millilitro di gel per la lavorazione HEA in una provetta da centrifuga di 1,5 millilitri. Sciogliere lentamente l'agarosio in un forno a microonde utilizzando potenza bassa e impulsi ripetuti di 10 secondi fino a quando l'agarosio non è completamente sciolto. Mantenere l'HEA in un bagno a 37 gradi Celsius per evitare la solidificazione fino al momento dell'uso.Successivamente rimuovere il NBF dalla camera interna. Applicare 25 microlitri di HEA fuso nella camera interna e lasciare solidificare l'agarosio per due-cinque minuti. Quindi inumidire due tamponi istologici in schiuma con NBF al 10% e posizionarne uno in una cassetta per inclusione.Proteggere l'integrità degli strati cellulari sul filtro utilizzando HistoGel è un passaggio fondamentale per preservare lo strato cellulare intatto durante il sezionamento istologico. Successivamente, utilizzare un bisturi con lama numero 11 per incidere il filtro dal lato inferiore della camera in plastica, staccandolo parzialmente. Collocare da 100 a 200 microlitri di NBF in una capsula di Petri ed immergere il filtro parzialmente staccato nel NBF.Con un bisturi a lama numero 10, premere delicatamente contro la parte centrale del filtro dall'interno della camera dell'inserzione per staccare completamente il filtro dal cilindro dell'inserzione. Se una parte del filtro è ancora attaccata al cilindro, tagliarla con il bisturi. Successivamente, tagliare a metà il filtro rivestito con HEA.Posizionare ogni metà del filtro sul tampone di schiuma all'interno della cassetta istologica preparata. Quindi aggiungere il secondo spugnetta imbevuta di NBF al 10% alla cassetta, inserendo il filtro tra le due spugnette. Successivamente, chiudere ermeticamente la cassetta.Posizionarlo in NBF e incubare durante la notte. Questa immagine in campo chiaro mostra strati cellulari multilaminati sopra la membrana porosa. Sono mostrate le singole immagini fluorescenti per i nuclei, P63 e il recettore degli androgeni, così come la sovrapposizione dei tre marcatori fluorescenti.Infine viene mostrata una sovrapposizione composita di campo chiaro e immunofluorescenza, che stabilisce la localizzazione del segnale fluorescente rispetto alle cellule e al filtro. Qui è mostrata un'immagine sezione trasversale del nostro inserto filtrante, confrontata con gli strati epiteliali duttali di una prostata integra. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due settimane, con un'isolamento finale delle cellule e dell'inserto filtrante o della biomolecola desiderata che richiede meno di 30 minuti se eseguita correttamente.Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare sempre di agire con cautela quando si lavora con i dispositivi filtranti, in modo da evitare danni allo strato cellulare o al filtro sottostante. Al termine di questa procedura, è possibile eseguire altre metodiche, come Western blot, microarray di RNA e analisi del proteoma, al fine di rispondere a ulteriori domande relative all'analisi dei percorsi metabolici e alle cellule tumorali. Questa tecnica contribuirà a tracciare la strada per i ricercatori nel campo del cancro alla prostata, consentendo una migliore esplorazione della biologia prostatica e dei meccanismi alla base del tumore prostatico mediante l'uso di cellule prostatiche primarie.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come impostare correttamente e recuperare cellule prostatiche primarie coltivate da questo sistema di coltura 3D.

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Saggio Dell'organoide Prostatico: una tecnica di coltura ex vivo basata su anello su gel matrice per studiare la capacità di differenziazione delle cellule epiteliali della prostata

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