Un sistema di coltura 3D Rapid Cartuccia filtro-based per la prostata primaria cellulare Differenziazione

L'obiettivo generale di questo sistema di coltura 3D basato su inserti filtranti per cellule primarie derivate da pazienti è quello di stabilire un modello in vitro più biologicamente rilevante per la ricerca sul cancro alla prostata. Utilizzando cellule umane primarie, questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia dello sviluppo prostatico così come nel cancro alla prostata. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di una metodologia in vitro relativamente rapida per l'allestimento di cellule primarie della prostata differenziate, che consente inoltre l'isolamento rapido di biomolecole come RNA, DNA e proteine.

La dimostrazione visiva di questi metodi è fondamentale poiché l'elaborazione delle cellule sull'inserto filtrante per istologia o per il recupero di RNA e proteine è delicata e dipendente dal tempo. Per aiutare a limitare la diffusione tra le camere all'interno di un armadio di sicurezza biologica, applicare uno strato sottile di gelatina allo 0,1% sulla faccia inferiore degli inserti e lasciarli asciugare. Ripetere questa procedura altre due volte.

Quindi applicare le cellule nella camera interna degli inserti rivestiti con gelatina e coltivarle per un periodo fino a due settimane. Dopo due settimane, applicare direttamente gli inserti filtranti coltivati a una delle applicazioni a valle appropriate descritte di seguito. Per iniziare questa procedura, aspirare il PBS dalla camera esterna e rimuovere con attenzione il PBS dalla camera interna.

Gli inserti coltivati possono essere mantenuti brevemente in PBS fino a quando non si è pronti per iniziare l'applicazione, ma è necessario evitare che la membrana si secchi. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di tripsina EDTA 0,25% in ogni camera interna. Quindi, incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Successivamente, raschiare brevemente e con attenzione le cellule sulla superficie della membrana utilizzando una pipetta da 200 microlitri, aspirando e dispensando più volte. Quindi incubare per un minuto a 37 gradi Celsius. Dopo un minuto, aggiungere 250 microlitri di mezzo condizionato alla prima camera interna e pipettare delicatamente su e giù per risciacquare il filtro.

Dopo questo trasferimento, risospendere le cellule nella camera del filtro adiacente che contiene le stesse condizioni di mezzo e ripetere la pipettatura su e giù. Ripetere questa procedura per ciascuno degli inserti di una singola condizione. Successivamente, raccogliere le cellule e trasferirle in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri.

Risciacquare ogni camera interna con ulteriori 100-200 microlitri di mezzo condizionato per raccogliere eventuali cellule residue e aggiungerli al tubo da centrifuga da 1,5 millilitri. Successivamente, centrifugare le cellule in un microcentrifugo a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopodiché, aspirare il soprannatante e lavare il pellet cellulare una volta con 1.000 microlitri di PBS.

Centrifugare nuovamente le cellule in un microcentrifugo a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo cinque minuti, aspirare il PBS e congelare il campione a meno 80 gradi Celsius per un uso successivo. In questa procedura, aggiungere 200 microlitri di tiocianato di guanidinio fenolo cloroformio o di un reagente di estrazione simile alla camera interna e agitare brevemente le cellule sulla superficie della membrana mediante pipettaggio su e giù.

Quindi incubare le cellule nel reagente di estrazione per cinque minuti a temperatura ambiente e lasciare la camera esterna asciutta. Successivamente, lavare la membrana filtrante aspirando e dispensando ripetutamente la soluzione di estrazione con la pipetta. Raccogliere la maggior quantità possibile di reagente di estrazione inclinando la piastra a sei pozzetti ed aspirando qualsiasi liquido residuo.

Si noti che il filtro potrebbe staccarsi dall'inserimento. Lavare la membrana del filtro staccata, se presente. Quindi raccogliere la maggior quantità possibile del reagente di estrazione e seguire il protocollo del produttore per la purificazione e il recupero di DNA, RNA o proteine.

È necessario prestare attenzione durante il lavaggio delle cellule e del filtro con tiocianato di guanidinio, poiché un'agitazione eccessiva può produrre RNA di scarsa qualità. Per isolare le proteine dal filtro, posizionare il filtro nell'apposito alloggiamento della piastra a sei pozzetti su ghiaccio. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di buffer di lisi proteico nella camera interna.

Agitare e raschiare le cellule sulla superficie della membrana con una pipetta da 20 microlitri, aspirando e dispensando più volte, e fare attenzione a non generare bolle nel buffer di lisi. Successivamente, incubare la piastra a sei pozzetti con inserti filtranti sul ghiaccio per dieci minuti. Ripetere il raschiamento, quindi risciacquare la superficie della membrana con il buffer di lisi.

Raccogliere i lisati dai sei inserti e trasferirli in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri posto sul ghiaccio. Successivamente, risciacquare la prima membrana con ulteriori 10 microlitri di buffer per la lisi e trasferirla al filtro successivo. Ripetere questa procedura per tutti gli inserti di una determinata condizione sperimentale, raccogliendo ogni eventuale soluzione residua di buffer per la lisi e aggiungerla al tubo da 1,5 millilitri.

Incubare il campione sul ghiaccio per ulteriori cinque minuti. Successivamente, centrifugarlo alla velocità massima per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine, trasferire il lisato con una pipetta in un tubo fresco da 1,5 millimetri.

Procedere quindi all'analisi della concentrazione proteica oppure conservare i lisati a meno 80 gradi Celsius. In questo procedimento, aggiungere 500 microlitri e un millilitro di NBF al 10% rispettivamente nella camera interna e in quella esterna. Incubarli tutta la notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, aspirare l'NBF dalla camera esterna e aggiungere un millilitro di gel per la lavorazione HEA in una provetta da centrifuga di 1,5 millilitri. Sciogliere lentamente l'agarosio in un forno a microonde utilizzando potenza bassa e impulsi ripetuti di 10 secondi fino a quando l'agarosio non è completamente sciolto. Mantenere l'HEA in un bagno a 37 gradi Celsius per evitare la solidificazione fino al momento dell'uso.

Successivamente rimuovere il NBF dalla camera interna. Applicare 25 microlitri di HEA fuso nella camera interna e lasciare solidificare l'agarosio per due-cinque minuti. Quindi inumidire due tamponi istologici in schiuma con NBF al 10% e posizionarne uno in una cassetta per inclusione.

Proteggere l'integrità degli strati cellulari sul filtro utilizzando HistoGel è un passaggio fondamentale per preservare lo strato cellulare intatto durante il sezionamento istologico. Successivamente, utilizzare un bisturi con lama numero 11 per incidere il filtro dal lato inferiore della camera in plastica, staccandolo parzialmente. Collocare da 100 a 200 microlitri di NBF in una capsula di Petri ed immergere il filtro parzialmente staccato nel NBF.

Con un bisturi a lama numero 10, premere delicatamente contro la parte centrale del filtro dall'interno della camera dell'inserzione per staccare completamente il filtro dal cilindro dell'inserzione. Se una parte del filtro è ancora attaccata al cilindro, tagliarla con il bisturi. Successivamente, tagliare a metà il filtro rivestito con HEA.

Posizionare ogni metà del filtro sul tampone di schiuma all'interno della cassetta istologica preparata. Quindi aggiungere il secondo spugnetta imbevuta di NBF al 10% alla cassetta, inserendo il filtro tra le due spugnette. Successivamente, chiudere ermeticamente la cassetta.

Posizionarlo in NBF e incubare durante la notte. Questa immagine in campo chiaro mostra strati cellulari multilaminati sopra la membrana porosa. Sono mostrate le singole immagini fluorescenti per i nuclei, P63 e il recettore degli androgeni, così come la sovrapposizione dei tre marcatori fluorescenti.

Infine viene mostrata una sovrapposizione composita di campo chiaro e immunofluorescenza, che stabilisce la localizzazione del segnale fluorescente rispetto alle cellule e al filtro. Qui è mostrata un'immagine sezione trasversale del nostro inserto filtrante, confrontata con gli strati epiteliali duttali di una prostata integra. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due settimane, con un'isolamento finale delle cellule e dell'inserto filtrante o della biomolecola desiderata che richiede meno di 30 minuti se eseguita correttamente.

Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare sempre di agire con cautela quando si lavora con i dispositivi filtranti, in modo da evitare danni allo strato cellulare o al filtro sottostante. Al termine di questa procedura, è possibile eseguire altre metodiche, come Western blot, microarray di RNA e analisi del proteoma, al fine di rispondere a ulteriori domande relative all'analisi dei percorsi metabolici e alle cellule tumorali. Questa tecnica contribuirà a tracciare la strada per i ricercatori nel campo del cancro alla prostata, consentendo una migliore esplorazione della biologia prostatica e dei meccanismi alla base del tumore prostatico mediante l'uso di cellule prostatiche primarie.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come impostare correttamente e recuperare cellule prostatiche primarie coltivate da questo sistema di coltura 3D.