Un sistema di coltura 3D Rapid Cartuccia filtro-based per la prostata primaria cellulare Differenziazione

L'obiettivo generale di questo sistema di coltura 3D basato su inserti filtranti per cellule primarie derivate da pazienti è quello di stabilire un sistema modello in vitro biologicamente più rilevante per la ricerca sul cancro alla prostata. Utilizzando cellule umane primarie, questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo della prostata e nel cancro alla prostata. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di una metodologia in vitro relativamente rapida per la creazione di cellule prostatiche primarie differenziate che consente anche il rapido isolamento di biomolecole come RNA, DNA e proteine.

La dimostrazione visiva di questi metodi è fondamentale in quanto l'elaborazione delle cellule sull'inserto filtrante per l'istologia o per la raccolta di RNA e proteine è delicata e sensibile al tempo. Per limitare la diffusione tra le camere in una cappa di sicurezza biologica, applicare uno strato sottile di gelatina allo 0,1% sul lato inferiore degli inserti e lasciarli asciugare. Ripetere questa procedura altre due volte.

Quindi applicare le cellule nella camera interna degli inserti rivestiti di gelatina e coltivarle per un massimo di due settimane. Dopo due settimane, applicare gli inserti filtranti coltivati direttamente su una delle applicazioni a valle appropriate descritte di seguito. Per iniziare questa procedura, aspirare il PBS dalla camera esterna e rimuovere con cura il PBS dalla camera interna.

Gli inserti coltivati possono essere conservati brevemente in PBS fino a quando l'applicazione non è pronta per iniziare, ma non lasciare che la membrana si asciughi. Quindi aggiungere 100 microlitri di tripsina EDTA allo 0,25% in ciascuna camera interna. Quindi incubarli per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Successivamente, raschiare brevemente e con cura le cellule sulla superficie della membrana con una pipetta da 200 microlitri mentre si pipettano su e giù. Quindi incubarli per un minuto a 37 gradi Celsius. Dopo un minuto, aggiungere 250 microlitri di terreno condizionato nella prima camera interna e pipettare delicatamente su e giù per risciacquare il filtro.

Successivamente, trasferire le cellule risospese nella camera filtrante adiacente che contiene le stesse condizioni del terreno e ripetere il pipettaggio su e giù. Ripetere questa procedura per ciascuno degli inserti di una singola condizione. Quindi raccogliere le cellule e trasferirle in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri.

Sciacquare ogni camera interna con altri 100-200 microlitri di terreno condizionato per raccogliere le cellule rimanenti e aggiungerle alla provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, centrifugare le cellule in una microcentrifuga a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, aspirare il surnatante e lavare una volta il pellet cellulare con 1.000 microlitri di PBS.

Centrifugare nuovamente le cellule in una microcentrifuga a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo cinque minuti, aspirare il PBS e congelare il campione a meno 80 gradi Celsius per un uso successivo. In questa procedura, aggiungere 200 microlitri di guanidinio, tiocianato, fenolo, cloroformio o reagente di estrazione simile alla camera interna e agitare brevemente le cellule sulla superficie della membrana pipettando su e giù.

Quindi incubare le cellule nel reagente di estrazione per cinque minuti a temperatura ambiente e lasciare asciugare la camera esterna. Successivamente, lavare la membrana del filtro pipettando la soluzione di estrazione su e giù. Raccogliere la maggior parte possibile del reagente di estrazione inclinando la piastra a sei pozzetti e aspirando il liquido residuo.

Si prega di notare che il filtro potrebbe dissociarsi dall'inserto. Lavare la membrana del filtro dissociata, se collegata. Quindi raccogliere la maggior parte possibile del reagente di estrazione e seguire il protocollo del produttore per la purificazione e il recupero di DNA, RNA o proteine.

Prestare attenzione quando si lavano le cellule e si filtra con tiocianato di guanidinio poiché un'eccessiva agitazione può produrre RNA di scarsa qualità. Per isolare le proteine dall'inserto del filtro, posizionare l'inserto del filtro nella piastra a sei pozzetti sul ghiaccio. Quindi aggiungere 10 microlitri di tampone di lisi proteica nella camera interna.

Agitare e raschiare le cellule sulla superficie della membrana con una pipetta da 20 microlitri durante il pipettaggio su e giù ed evitare di generare bolle nel tampone di lisi. Successivamente, incubare la piastra a sei pozzetti con inserti filtranti sul ghiaccio per dieci minuti. Ripetere la raschiatura e quindi risciacquare la superficie della membrana con il tampone di lisi.

Raccogliere i lisati dai sei inserti e trasferirli in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri con ghiaccio. Quindi sciacquare la prima membrana con altri 10 microlitri di tampone di lisi e trasferirla nel filtro successivo. Ripetere questa procedura per tutti gli inserti di una data condizione sperimentale, raccogliendo l'eventuale soluzione tampone di lisi residua e aggiungerla alla provetta da 1,5 millilitri.

Incubare il campione su ghiaccio per altri cinque minuti. Quindi centrifugalo alla massima velocità per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine, pipettare il lisato in una provetta fresca da 1,5 millimetri.

Quindi procedere all'analisi della concentrazione proteica o conservare i lisati a meno 80 gradi Celsius. In questa procedura aggiungere 500 microlitri e un millilitro di 10% NBF rispettivamente nella camera interna ed esterna. Incubarli per una notte a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo aspirare l'NBF dalla camera esterna e aggiungere un millilitro di gel di processo HEA a una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Sciogliere lentamente l'agarosio in un forno a microonde a bassa potenza e ripetere impulsi di 10 secondi fino a quando l'agarosio non si sarà sciolto. Conservare l'HEA in un bagno caldo a 37 gradi Celsius per evitare la solidificazione fino al momento dell'uso.

Quindi, rimuovere l'NBF dalla camera interna. Applicare 25 microlitri di HEA fuso nella camera interna e lasciare solidificare l'agarosio per due-cinque minuti. Quindi bagnare due tamponi istologici in schiuma al 10% NBF e posizionare un tampone in una cassetta di inclusione.

La salvaguardia dell'integrità degli strati cellulari sull'inserto filtrante con HistoGel è un passaggio fondamentale per la conservazione dello strato cellulare intatto per il sezionamento istologico. Successivamente, utilizzare un bisturi a lama numero 11 per incidere il filtro dal lato inferiore della camera di inserimento in plastica, rilasciandolo parzialmente. Mettere 100-200 microlitri di NBF in una capsula di Petri e immergere il filtro parzialmente rimosso nell'NBF.

Con un bisturi a lama numero 10, premere delicatamente contro il centro del filtro dall'interno della camera di inserimento per rimuovere completamente il filtro dal cilindro dell'inserto. Se c'è una parte del filtro che è ancora attaccata al cilindro, reciderla con il bisturi. Successivamente tagliare a metà il filtro rivestito HEA.

Posizionare ciascuna metà del filtro sul tampone di schiuma nella cassetta istologica preparata. Quindi aggiungere la seconda spugna imbevuta di NBF al 10% nella cassetta, inserendo il filtro. Quindi sigillare a scatto la cassetta.

Mettilo in NBF e incubalo per una notte. Questa immagine in campo chiaro mostra strati cellulari multistrato sopra la membrana porosa. Vengono mostrate le singole immagini fluorescenti per i nuclei, P63 e il recettore degli androgeni, così come la fusione di tutti e tre i marcatori di fluorescenza.

Infine viene mostrato un campo chiaro composito e una sovrapposizione di immunofluorescenza, stabilendo la localizzazione del segnale fluorescente rispetto alle cellule e al filtro. Qui viene mostrata un'immagine in sezione trasversale del nostro inserto filtrante, confrontata con gli strati epiteliali duttali di una prostata intatta. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due settimane con un isolamento finale delle cellule e dell'inserto filtrante o della biomolecola desiderata che richiede meno di 30 minuti se eseguita correttamente.

Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare sempre di prestare attenzione quando si lavora con gli inserti del filtro, in modo che non si verifichino danni allo strato cellulare o al filtro sottostante. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come Western blot, RNA microarray e analisi del proteoma per rispondere a ulteriori domande relative all'analisi del percorso e alle cellule tumorali. Questa tecnica aiuterà a spianare la strada ai ricercatori nel campo del cancro alla prostata per esplorare meglio la biologia della prostata e le basi del cancro alla prostata utilizzando le cellule prostatiche primarie.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere un'ottima comprensione di come impostare e recuperare correttamente le cellule prostatiche primarie coltivate da questo sistema di coltura 3D.