Summary
Infusion av bukspottskörteln är en viktig teknik som möjliggör härstamning, genintroduktion och celllinjespecifik inriktning. En bukspottskörtelkanalinfusionsteknik för läkemedels- och virusleverans till bukspottskörtelceller presenteras här.
Abstract
Bukspottkörteln är ett bifunktionellt organ med både endokrina och exokrina komponenter. Ett antal patologier kan drabba bukspottkörteln, inklusive diabetes, pankreatit och bukspottskörtelcancer. Alla tre av dessa sjukdomar markerar aktiva studieområden, inte bara för att utveckla omedelbar terapi, men också för att bättre förstå deras patofysiologi. Det finns få verktyg för att främja dessa studieområden. Infusion av bukspottskörteln är en viktig teknik som möjliggör härstamning, genintroduktion och celllinjespecifik inriktning. Tekniken kräver invecklad dissekering av den andra delen av duoden och ampullan, följt av ocklusion av gallgången och kannuleringen av bukspottskörtelkanalen. Även om tekniken är tekniskt utmanande till en början är applikationerna otaliga. Tvetydighet i detaljerna i förfarandet mellan grupper belyste behovet av ett standardprotokoll. Detta arbete beskriver uttrycket av en grön fluorescerande protein (GFP) inom bukspottkörteln efter bukspottskörteln kanal infusion av en viral vektor uttrycker GFP kontra en sken kirurgi. Infusionen och därför uttrycket är specifikt för bukspottkörteln, utan uttryck i någon annan vävnadstyp.
Introduction
Bukspottkörteln är ett bifunktionellt organ, med både endokrina och exokrina komponenter. Ett antal patologier kan drabba bukspottkörteln, inklusive diabetes, pankreatit och bukspottskörtelcancer1. Alla tre av dessa sjukdomar markerar aktiva studieområden, inte bara för att utveckla omedelbar terapi, men också för att bättre förstå deras patofysiologi.
En riktad terapeutisk leveransmetod skulle vara fördelaktig. Vi har utvecklat en bukspottskörtelkanalinfusionsteknik som är en effektiv och selektiv metod för läkemedels- och virusleverans till bukspottskörtelceller. I denna modell är bukspottskörteln selektivt kannulerad, och den gemensamma gallgången är ockluderad, vilket möjliggör leverans uteslutande till bukspottkörteln.
Denna teknik kan möjliggöra härstamning spårning av specifika celltyper för att ytterligare klargöra de utvecklingsvägar som är viktiga för bukspottskörteln utveckling och patologi2,3. Olika promotors i virusvektorer möjliggör specifik inriktning av cellinjer och för införande av gener i dessacellinjer 4,5. Detta arbete visar uttrycket av en grön fluorescerande protein (GFP) inom bukspottkörteln efter bukspottskörteln kanal infusion av en viral vektor uttrycker GFP kontra en sken kirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av Animal Research and Care Committee vid Children's Hospital of Pittsburgh och University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Preoperativ förberedelse
- Administrera inhalerad isofluran (1- 3% för underhåll och upp till 5% för induktion) via en noskon till en lämplig bedövningsnivå. Övervaka anestesins tillräcklighet genom att nypa med tång. Bristen på svar anses vara adekvat, och se till att inte övermedicinera, eftersom andningsdepression kan uppstå.
- Placera djuret på ryggen på det dissekerande mikroskopstadiet, med buken centrerad med tanke på målet. Immobilisera djuret med kirurgisk tejp. Applicera oftalmisk salva på djurets ögon för att förhindra torrhet under anestesi.
- Applicera ett slätt, tjockt lager hårborttagningskräm och lämna den på plats i 3 minuter. Kontrollera ett litet område för hårborttagning. Torka försiktigt av grädden och håret med 70% etanol-blöt gasväv.
- Rengör och desinficera djurets buk genom att torka av det med en 70% etanolindränkt gasväv följt av en betadindränkt gasväv. Håll sterila förhållanden under hela det kirurgiska ingreppet.
2. Korrekt exponering
- Gör ett mittlinjesnitt i huden från xyphoidprocessen till navelsträngen med hjälp av en skalpell. Lyft peritoneumet med Adson-tång och gör ett litet hål i mittlinjen med sax.
- Förläng det peritoneala snittet till längden på hudsnittet, var noga med att stanna kvar på mittlinjen (linea alba).
OBS: Detta kommer att producera en övre mittlinjen buken laparotomy. - Lyft levern med trubbiga upprullningsdon för att exponera den gemensamma gallgången. Kläm fast den gemensamma gallgången med en böjd bulldog vaskulär klämma.
OBS: Denna manöver förhindrar oönskad infusion i levern.
3. Identifiering av bukspottskörteln Papilla och Duodenotomy
- Identifiera årondenumet och, med Arruga tång, dra tillbaka det kaudally för att visa papilla.
OBS: Papillan är en vit fläck på den främre ytan av den andra delen av åronden. - Dra tillbaka årondenumet kaudally, så att man kan identifiera bukspottskörtelkanalens gång. Med en 301/2-gauge nål, punktera väggen i tolvfingertarmen tangentiellt, mittemot papillan.
OBS: Nålen ska följa samma vinkel som kanalen när den kommer in i årondenumet.
4. Infusion.
- Skicka katetern genom duodenotomin som skapas i steg 3.2 tills katetern är synlig i kanalen. För in katetern i kanalen högst 1 cm för att förhindra bypass av mindre kanalbifloder.
- Kläm fast katetern på plats med en andra böjd bulldog vaskulär klämma. Slå på pumpen och ingjut den valda volymen. Volymen infunderad kan variera från 25 - 250 μL, med en idealisk volym på cirka 150 μL.
- Administrera en intraperitoneal injektion på cirka 1,5 ml saltlösning för att kompensera förluster. Täck den exponerade tarmen med en fuktig gasväv för att förhindra uttorkning.
- Vid infusionens slut, ta bort bulldoggklämman som höll katetern på plats. Använd bulldogklämman för att försiktigt ta bort katetern från bukspottskörtelkanalen. Lossa klämman från den gemensamma gallgången.
- Stäng peritoneum och huden i ett eller två lager med en löpande sutur.
OBS: Det finns inget behov av att stänga duodenotomin, eftersom den kommer att försegla på egen hand. - Som postoperativ analgesi, administrera en dos ketofen vid 5 mg/kg under proceduren och en följande dag.
- Sätt tillbaka musen i buret under en värmelampa tills den återhämtar sig. Förse musen med mat och vatten ad libitum.
- Lämna inte djuret obevakat förrän det har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternal kumbency. Returnera inte ett djur som har genomgått operation till sällskap av andra djur förrän det har återhämtat sig helt.
5. Provberedning
- Placera djuret i en koldioxidkammare eller utför livmoderhalsförskjutning.
- Skörda bukspottkörteln, med mjälte, lever och duoden som kontroller. Fixera vävnaderna i paraformaldehyd över natten vid 4 °C. Cryoprotect provet i 30% sackaros över natten, som tidigarebeskrivits 6.
- Fäst proverna. Dela vävnaden med en tjocklek av 6 μm med hjälp av en mikrotom. Utför avbildning på ett mikroskop med fluorescensavbildning, som tidigare beskrivits7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med övning och noggrann kirurgisk teknik bör överlevnadsgraden för dessa möss vara större än 95%. En vecka efter infusionen bör önskad effekt vara uppenbar i bukspottkörteln. Möss vid 10 till 12 veckors ålder användes för infusioner med bukspottskörteln. Här använder vi en adeno-associerade virus serotyp 8 (AAV8) med en CMV promotor för att uttrycka gröna fluorescerande protein (GFP), jämfört med en skenkirurgi. Möss bukspottkörtlar skördades 7 dagar efter infusionerna. Delar av bukspottkörteln, mjälte och duodenum var färgade med insulin antikroppar och Hoescht. Figur 1 visar att det finns ett omfattande uttryck för GFP i bukspottkörteln hos mössen som genomgick bukspottskörtelkanalinfusion med AAV8, i motsats till de som genomgick skenkirurgi. Det finns inget uttryck i levern, mjälten eller årondenum hos dessa möss, vilket dokumenterar infusionens selektiva natur. Dessa data kan bekräftas med flera andra metoder, inklusive DNA- och RNA-uttrycksprofiler.
Figur 1. Uttryck av GFP efter bukspottskörteln kanal infusion. a) Skenkirurgi jämfört med b) infusion av bukspottskörteln med AAV8 som uttrycker GFP. Skalstrecket representerar 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete beskriver i detalj metoden bakom bukspottskörtelkanalinfusion, en effektiv musmodell för leverans av gener och andra molekyler specifikt och effektivt till bukspottkörteln. Tvetydighet i detaljerna i förfarandet mellan olika grupper belyste behovet av ett standardiserat protokoll8,9,10.
Det finns flera kritiska steg i proceduren, som börjar med valet av unga, friska möss. Perforering av årondenum, hur liten och kontrollerad den än är, är en traumatisk händelse i musen som utan tvekan leder till rekrytering av inflammatoriska cytokiner och andra faktorer som inte har karakteriserats helt. Därför är en delikat dissekering avgörande, liksom att skapa den minsta duodenotomin som är möjlig för införandet av katetern. Det viktigaste steget i hela proceduren är kannanuleringen av bukspottskörtelkanalen med leveranssystemet.
Svårigheter kan uppstå med överdriven störning av bukspottskörteln papilla, vilket leder till en överväldigande systemisk inflammatorisk reaktion. Bukspottkörteln är ett känsligt organ; i det kirurgiska samhället beskrivs det vardagligt som ett organ att inte "röra" med. Framgångsgraden varierar endast något med utövarens skicklighetsnivå. Så länge gallgången är ordentligt ockluderad kommer infusionen att vara 100% specifik enbart för bukspottkörteln.
Inlärningskurvan för förfarandet är ganska brant, och huvudbegränsningen övervinns med övning. Som tidigare nämnts kan överdriven manipulering av årondenum och bukspottkörtel leda till ett överväldigande inflammatoriskt svar som måste undvikas.
Förfarandet har bred tillämplighet inom många olika discipliner. Det kan användas som en metod för riktad genleverans genom användning av specifika virusvektorer11. Förfarandet kan också möjliggöra specifik infusion av molekyler som hjälper till att klargöra bukspottskörtelcellsfunktionen. Den specifika leveransen av vissa molekyler är en tilltalande metod för att modifiera signalvägarna inom holmarna för att producera spridning12. Systemet kan också undanröja behovet av transgen avel genom att direkt producera en önskad genotyp och fenotyp i bukspottkörteln. Applikationerna är otaliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna har inga erkännanden. Finansiering er mottogs från Stiftelsen för hälso- och familjeplaneringskommission i Zhejiang-provinsen (Grant 20146242) och Stiftelsen för Wenzhou Science & Technology Bureau (Grant Y20140248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice (25 - 30g, 8-12 weeks old) | Jackson Laboratory | ||
| Ketofen | Henry Schein Inc. | 5487 | |
| Ethanol (70%) | Sigma-Aldrich | 34923 | |
| Sterile Saline Solution | Baxter Healthcare Corp. | 2B-13-00 | |
| Protective Equipment | |||
| Hair Removal Product | Nair or trimmer | ||
| Gauze Pads 2in x 2in | Fisher Healthcare | 22-362-178 | |
| Needles (30.5G and 25G) | Becton Dicksinson and Co. | 305106 and 305122 | |
| Syringe for Ketofen and Saline | Becton Dicksinson and Co. | 309657 | |
| Syringe for Pump | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Infusion Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Infusion Catheter | World Precision Instruments | CMF31G | |
| Curved Bulldog Clamps (2) | Roboz | RS-7439 | |
| Arruga Forceps | Roboz | RS-5163 | |
| Adson Forcep | Roboz | RS-5234 | |
| Needle Holder | Roboz | RS-7882 | |
| Scissor | Roboz | RS-5982 | |
| Cotton Tip Applicators | Physician Sales and Services | 22-9988 | |
| Dissecting Microscope | |||
| Suture | Owens and Minor | SXMD1B402 |
References
- Gittes, G. K. Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review. Dev Biol. 326 (1), 4-35 (2009).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Weinberg, N., Ouziel-Yahalom, L., Knoller, S., Efrat, S., Dor, Y. Lineage tracing evidence for in vitro dedifferentiation but rare proliferation of mouse pancreatic beta-cells. Diabetes. 56 (5), 1299-1304 (2007).
- Raper, S. E., DeMatteo, R. P. Adenovirus-mediated in vivo gene transfer and expression in normal rat pancreas. Pancreas. 12 (4), 401-410 (1996).
- Xiao, X., et al. Pancreatic cell tracing, lineage tagging and targeted genetic manipulations in multiple cell types using pancreatic ductal infusion of adeno-associated viral vectors and/or cell-tagging dyes. Nat Protoc. 9 (12), 2719-2724 (2014).
- Song, Z., et al. EGFR signaling regulates beta cell proliferation in adult mice. J Biol Chem. 291 (43), (2016).
- Xiao, X., et al. M2 macrophages promote beta-cell proliferation by up-regulation of SMAD7. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), E1211-E1220 (2014).
- Laukkarinen, J. M., Van Acker, G. J., Weiss, E. R., Steer, M. L., Perides, G. A mouse model of acute biliary pancreatitis induced by retrograde pancreatic duct infusion of Na-taurocholate. Gut. 56 (11), 1590-1598 (2007).
- Lichtenstein, A., et al. Acute lung injury in two experimental models of acute pancreatitis: infusion of saline or sodium taurocholate into the pancreatic duct. Crit Care Med. 28 (5), 1497-1502 (2000).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nat Protoc. 5 (2), 335-341 (2010).
- Guo, P., et al. Specific transduction and labeling of pancreatic ducts by targeted recombinant viral infusion into mouse pancreatic ducts. Lab Invest. 93 (11), 1241-1253 (2013).
- Xiao, X., et al. Neurogenin3 activation is not sufficient to direct duct-to-beta cell transdifferentiation in the adult pancreas. J Biol Chem. 288 (35), 25297-25308 (2013).
