Abstract
Bedömning av antibiotikabehandling med ny läkemedelsutveckling riktad mot anaeroba bakterier är svår och tekniskt krävande. För att få insikt i möjlig MOA kan morfologiska förändringar i samband med antibiotisk exponering visualiseras med hjälp av skanningelektronmikroskopi (SEM). Integrering av SEM-bildbehandling med traditionella dödskurvor kan förbättra vår insikt i narkotikahantering och utveckla läkemedelsutvecklingsprocessen. För att testa denna premiss utfördes dödkurvor och SEM-studier med användning av läkemedel med känd men olika MOA (vankomycin och metronidazol). C. difficile celler (R20291) odlades med eller utan närvaro av antibiotikum i upp till 48 timmar. Under hela 48 timmarsintervallet samlades celler upp på flera tidpunkter för att bestämma antibiotikabehandling och för bildbehandling på SEM. I överensstämmelse med tidigare rapporter hade vankomycin och metronidazol signifikant baktericidaktivitet efter 24 timmars behandling, mätt genom kolonnbildande enhet (CFU) länderting. Med SEM-bildbehandling bestämde vi att metronidazol hade signifikanta effekter på celllängden (> 50% minskning av celllängden för varje antibiotikum, P <0,05) jämfört med kontroller och vankomycin. Medan det fenotypiska svaret på läkemedelsbehandling inte har dokumenterats tidigare på detta sätt är de förenliga med läkemedlets MOA som visar mångfalden och tillförlitligheten av avbildningen och mätningarna och tillämpningen av denna teknik för andra experimentella föreningar.
Introduction
Clostridium difficile är en gram positiv, sporbildande bakterie, vilket orsakar cirka 500 000 infektioner årligen i USA och betraktas som en brådskande brådskande patogen av Centers for Disease Control and Prevention (CDC), den högsta risknivån. 1 Det senaste decenniet har sett en betydande läkemedelsutveckling i antimikrobiella medel med aktivitet mot C. difficile . 2 , 3 In vitro- studier är en nödvändig del av läkemedelsutvecklingsprocessen. 4 Traditionellt används in vitro- mottagnings- och tidsdödstudier för att validera framtida djur och andra in vivo- studier.
Medan dessa metoder bidrar till en viktig roll för utvärdering av dödande åtgärder, fångar de inte cellernas fenotypiska respons på farmakologisk behandling. Genom att inkorporera skanningelektronmikroskopi (SEM) med standarD dödande kinetiska studier är en mer noggrann karakterisering av antibiotikabehandlingarna möjliga. 5 , 6 , 7 Här presenterar vi en metod där SEM används som ett sätt att profilera effekten av antibiotikabehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering C. difficile från olika miljö- eller kliniska källor
- Miljöisoler: Använd en försteriliserad bomullsmätare (lätt fuktad med 0,85% NaCl), vattna på ytan av något intresseområde (golv, dörr, handtag, hyllan etc. ). 8 Var noga med att bära sterila handskar och placera pinnen i ett steriliserat rör efter avslutat.
- Kliniska isolat (avföring): Placera 10 till 100 mg kliniska avföringsprover på cefoxitin-cykloserin-fruktosagar (CCFA) med användning av en inokuleringsslinga och inkubera under strikta anaeroba förhållanden under 48 - 72 timmar. Förvara de isolerade kolonierna av C. difficile-stammen i cryovials vid -80 ° C för ytterligare analyser. 7 , 9 , 10
- Berik de miljömässiga provkroppen i hjärthjärtainfusion (BHI) buljong med 0,05% natriumtaurokolat och placera i en anaerobkammare vid 37 ° CI 5 dagar. Centrifugera 1 ml odlingen vid 10 000 xg och resuspendera pelleten i 100 | il etanol.
- Placera de resuspenderade cellerna (50 μl) på cykloserinecefoxitin fruktosagar (CCFA) -plattor och inkubera i en anaerob kammare vid 37 ° C under 40-48 timmar. Förvara de isolerade kolonierna av C. difficile-stammen i cryovials vid -80 ° C för ytterligare analyser.
- Testa misstänkta C. difficile kolonier med hjälp av latexagglutinationsreagenset eller PCR.
2. Odling av C. difficile och dödande kinetiska förfaranden
- Växa renade miljö- eller kliniska C. difficile- stammar på blodagarplattor i en anaerob kammare vid 37 ° C under 48 timmar.
- Ta en isolerad koloni med en inokulationsslinga, överför den till 5 ml BHI-medium i ett 15 ml rör och växa i 24 h i en anaerob kammare vid 37 ° C.
- Späd förekulturerna 1: 100 till ungefär 10 6 kolonidannande enheterS (CFU) / ml i friskt förminskat BHIS (BHI plus 5 g / L jästextrakt och 1% L-cystein) kompletterat med 0,1% natriumtaurokolat och lämplig koncentration av antibiotikum (T0).
- Samla ett 1 ml prov med en pipett vid varje tidpunkt (T0, T6, T24, T48) och plattan / sprid en liten alikvot (100 μL i serieutspädningar) på en blodagarplatta. Låt cellerna växa på blodagarplattan i 48 timmar i en anaerob kammare vid 37 ° C och räkna det resulterande antalet kolonier för att bestämma CFU.
3. Förbereda prov för scanningelektronmikroskopi
- Samla 1 ml celler från varje punkt i mikrocentrifugrör och centrifugera vid 10 000 xg under 10 min. Kassera supernatanten och tvätta cellerna i PBS.
- Centrifugera proverna vid 10 000 xg i 10 minuter igen och kassera supernatanten. Återutspädda celler i 1 ml 4% paraformaldehyd och inkubera i 1 h vid rumstemperatur.
- Centrifugera prov igen under 10 minuter vid 10,000 xg och kassera supernatanten. Tvätta cellerna två gånger med destillerat vatten och redilute i 100 μl destillerat vatten. Justera volymen beroende på lösningens grumlighet.
OBS! Att göra flera seriella utspädningar är en bra idé. - Etikett täckglas och tillsätt 40 μL av provet på den. Inkubera i 15 minuter i en flödeskåpa för att indunsta vätskan och låta cellerna klibba på täckglaset. Om vätska fortfarande finns, använd en fläkt för att avlägsna vätskan.
- Placera märkta täckglas med celler i en skrivbordsplastermaskin och bunt ner. Säkra rent guld i förstoftningsmaskinen. Sätt på maskinen och starta förstoftning vid lågt tryck (50 mTorr). Coatceller i 30 s vid 80 mA, vilket översätter till 20 nm av guldbeläggning.
- Överför belagda celler till scanningelektronmikroskopet.
4. Imaging C. difficile celler på ett scanningelektronmikroskop
- Venta avsökningselektronmikroskopet (SEM) ordentligt med prEssing avluftningsknappen på datorprogrammet.
- Använda karbonband, säkra de belagda täckglasen på metallsteget. När SEM är ventilerad, ska dörren lätt öppnas. Lås metallsteget i SEM-kammaren genom att skruva in det.
- Klicka på PUMP-knappen på datorprogrammet. SEM kommer att användas när systemet läser "Vac OK".
- Klicka på SE-detektorn under fliken detektorer. Slå på strålen genom att klicka på knappen som visar spänningen. Starta avbildningen med en lägre spänning (5 kV) innan du ökar spänningen (upp till 15 kV). En bild visas efter att strålen är påslagen.
- Använd spårningsfunktionen, hitta ett område på de belagda täckglasen till bilden. Zooma in i regionen och hitta stångformade strukturer; Dessa är clostridium difficile .
- Zooma in och fokusera bilden för att kalibrera systemet. Detta bör göras på flera arbetsavstånd: 15, 9 och 5 mm. Bild på ett arbetsavstånd på 5 mm.
- Slå på digLtra högupplöst bildläge och börja fokusera och optimera astigmatism.
- Börja fokusera vid hög förstoring. Använd den grova och fina fokusväxeln för detta. Justera astigmatism för att få en tydligare bild.
- Justera astigmatism vid hög förstoring. För att göra detta, justera Astigmatism-växlarna (de liknar de fina / grova fokusknapparna) och kontrollera bilden för tydlighet genom att zooma in digitalt på datorns programvara.
- Se funktionen långsam skanning för att samla en högkvalitativ bild. Spara den samlade bilden som en. TIFF-fil, som kommer att användas för analys. Se till att datafältet är valt om mätningar görs under analysen.
- Samla bilder i olika vinklar (upp till 52 ° genom att manuellt vrida vinkeln direkt på SEM. Vinklade bilder tenderar att avslöja mer djupinformation.
- Ändra strålspänning beroende på cellerna som avbildas. Håll detta för det mesta mellan 5 - 15 kV för alla experiment. När bilden är klar, stäng av strålen och höja arbetsavståndet till 20 mm. Kammaren kan sedan ventileras och scenen kan avlägsnas. Kopiera alla bilder på en enhet för vidare analys.
5. Bildbehandling och analys
- Hämta och installera den fritt tillgängliga programvaran, FIJI (http://fiji.sc), till datorn.
- Öppna bildfilen i FIJI.
- Med hjälp av linjelfunktionen spårar du noggrant skalaen.
- Klicka på fliken Analysera i FIJI-programmet och slutligen välja Select Scale-funktionen. Ett fönster visas som kräver inställning av det kända distansen baserat på skalfältet. Ändra också längdenheten och klicka på OK.
- Nu när programmet är kalibrerat för avstånd, använd linjelfunktionen för att mäta celllängden. För att få längden, använd linjelfunktionen för att spåra cellen i dess helhet. Välj fliken Analys igen och klicka sedan på Mätning. Längden ska vara ca.Öra i enheterna som tidigare nämnts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Clostridium difficile är en sporbildande bakterie och det är därför viktigt att bestämma morfologiska skillnader mellan vegetativa och sporeceller före någon funktionell analys. Figur 1 visar representativa bilder av vegetativa celler som fångades under exponentialfasen av tillväxtkurvan och sporcellerna. Som framgår är vegetativa celler långa, släta, stavformade strukturer medan sporer är små, ovala strukturer som har ett grovt yttre. Funktionellt växer vegetativa celler och splittras snabbt och är ansvariga för virulensen av C. difficile- infektioner genom att utsöndra toxiner, medan sporer normalt är vilande med liten aktivitet. Därför är antibiotika mest aktiva mot vegetativa celler, medan sporer vanligtvis är resistenta mot läkemedelsbehandling, på grund av flera skikt som skyddar kärnan med DNA och brist på fysiologisk aktivitet. På grund av dessa fakta, majoritetenAv den morfologiska analysen är inriktad på de vegetativa cellerna. 11 , 12
En antibiotisk dödkurva är standardmetoden för att visa antibiotikares effektivitet mot växande bakterier. Koncentrationer som användes med C. difficile stam R20291 baserades på MIC-värdena, 1 pg / ml för vancomycin och 0,51 pg / ml för metronidazol. 10 Såsom visas i figur 2 växer kontrollcellerna och når en platå, medan de behandlade cellerna minskar i totala kolonidannande enheter (CFU) till detektionsgränsen (LOD) som visar bakteriedödande effekt. Som demonstrerat är vancomycin ( Figur 2A ) och metronidazol ( Figur 2B ) effektiva vid dödande av C. difficile vid supraMIC-koncentrationer (4xMIC). Man kan märka att antibiotikans dödkurvor ser likartade ut, men drogerna har olika mekanismer av acTion (vankomycin förhindrar cellväggssyntes medan metronidazol påverkar DNA-replikation). Därför föreslår vi att antibiotika-dödkurvor kanske inte har tillräckligt med diskriminerande kraft för att ge detaljerade skillnader mellan dessa antibiotika. Vi använde mikroskopi för att ge mer diskriminering.
På grund av sin mikroskopiska storlek är C. difficile inte möjligt att bilda utan hög förstoring. Detta har gett ett tillfälle för användning av skanningelektronmikroskopi (SEM), en avbildningsmetod som kan uppnå upplösning vid nanometerskalan, för att bedöma de detaljerade effekterna av antibiotikabehandling direkt på cellerna. För att visa användbarheten av detta tillvägagångssätt, identifierades celler före och efter läkemedelsbehandling för att bestämma hur morfologin förändrades ( Figur 3A ). Som visat sig påverkades några av cellernas väggar, som i fallet med vancomycin, och några av cellerna var mindre i storlek,Som det var fallet för metronidazol. För att testa om cellstorleken påverkades analyserade vi celllängden med programmet FIJI. Vegetativcellstorlek kan variera något i kontrollfallet, men de flesta är ungefär 6 μm i längd ( Figur 3B ). När man överväger många celler från kontroll och behandlade inställningar kan man snabbt märka att celllängden påverkas företrädesvis i metronidazol, men påverkas inte av vancomycinbehandling ( Figur 3C ).
Figur 1: Differentiering mellan celltyper genom scanningelektronmikroskopi. Visas är representativa bilder av Clostridium difficile vegetativa och spore celler. Vegetativa celler är stavkonstruktioner som är långa och flagellerade. I motsats härtill är sporerceller små och har en grov och skumpig kappa. Sporer är pseudofärgade röda för bildpurpoBara ses. Skala barer visas på bilderna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Antibiotiska Time-Kill-kurvor. SupraMIC-dödkurvor bärdes för fyra olika antibiotika: vankomycin (A) , metronidazol (B) . Dessa antibiotika hade signifikant dödande verkan mot C. difficile stam R20291 och närmade sig detektionsgränsen (LOD) för att räkna kolonidannande enheter (CFU). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Undersökning av de farmakologiska effekterna av antibiotisk behandling. Bilder av behandlade och obehandlade celler togs vid flera tidpunkter under de dödande kinetiska studierna (A) . Visat är ett representativt exempel på en kontroll vegetativ cell som mättes för längd (B) . Behandlade och obehandlade celler mättes och jämfördes (C) . Experiment utfördes i åtminstone dubbletter och> 17 celler mättes per grupp. * P <0,05 jämfört med kontroll- och vankomycinbehandlingsgrupper. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med den aktuella studien var att skapa en hög genomströmningsmetod för att isolera C. difficile och testa antibiotikaresistens med hjälp av skanningelektronmikroskopi (SEM) som ett medel för en mer noggrann karakterisering av antibiotikans farmakologiska verkan. Med hjälp av de protokoll som skisseras här har vi visat att avbildning av cellens fenotypiska respons på antibiotikabehandling kan avslöja insikt i läkemedlets farmakologiska verkan. Sammantaget tar bildbildningsdelen av detta protokoll ungefär 2 h i varaktighet efter samling av cellerna, men kan vara mycket mer diskriminerande än typiska dödande kinetiska studier ensamma. Samtidigt som man lär sig att använda en SEM kan vara tekniskt krävande är förberedelser av prover relativt enkla och snabba. Vi tror att dessa protokoll som beskrivs här kommer att ge ett objektivt tillvägagångssätt för att utvärdera den farmakologiska verkan av antibiotikabehandling.
Med tanke på likheterna mellan tHans antibiotiska dödkurvor ( Figur 2 ) försökte vi bestämma om det fanns skillnader mellan cellens respons på farmakologisk behandling. Med SEM bestämde vi att metronidazol hade effekter på celllängd vid supraMIC-koncentrationer av läkemedlet. Även om dessa fenotyper inte har rapporterats tidigare, är de förenliga med antibiotikernas mekanismer för åtgärder och föreslår en effekt på cellmetabolism och tillväxt. Vankomycin hade däremot signifikanta effekter på cellväggen, vilket också överensstämmer med dess verkningsmekanism. 13 Även om det finns likheter mellan dödkinetiken mellan dessa antibiotika framgår det av SEM-bilderna att det finns signifikanta fenotypiska skillnader. Att skapa ett antibiotikumfenotypbibliotek kommer att möjliggöra en mer noggrann karakterisering av läkemedel som kanske inte har en tydlig verkningsmekanism identifierad, som det är fallet med ridinilazol.
becausE den här metoden är tekniskt utmanande, det kan behöva ändras för att ta itu med den vetenskapliga frågan, inklusive konsekvent cellberedning och förändringar i förstoftning av guldbeläggning. För mycket beläggning kan oskärpa eventuella effekter på cellernas utsida, men inte tillräckligt med beläggning kan resultera i laddning av strålen och snedvrida bilderna. För att undvika detta, förbereda prov med olika mängder guldbeläggning för att optimera sputteringstiden. Slutligen kommer konsekvent metodik mellan studier att möjliggöra inter-experimentella jämförelser.
En begränsning av att använda SEM är att den är begränsad till att observera cellmorfologiska förändringar; Därför är funktionella studier nödvändiga för att bekräfta eventuellt misstänkt svar. På grund av detta tror vi att detta bildningsprotokoll kan användas som ett sätt att styra funktionella studier. Trots denna begränsning kan immunogoldmärkning göras med SEM för att bekräfta eventuella misstänkta förändringar i proteinhandel eller aggregering.Vi har dock inte utfört dessa experiment ännu.
På grund av den aktiva rörledningen för nya antibiotika för behandling med C. difficile krävs en noggrannare utvärdering av läkemedelsverkan. Som presenteras här erbjuder SEM en unik, hög genomströmning och tillförlitlig möjlighet för att karakterisera farmakologiska åtgärder. Genom att avbilda många olika antibiotiska effekter bland olika diffusionsstammar kommer vi att kunna förstå varför vissa antibiotika är mer effektiva än andra mot specifika patogena stammar som 027 / NAP1 / BI-epidemiska stammen. 14 SEM-analys kan dessutom vara till hjälp för att diskriminera antibiotiska effekter mellan ribotyper eller stammar och kan användas för att studera andra bakteriearter som visar sin breda användbarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cotton gauze | Caring | PRM21408C | |
| NaCl | Macron | 7532 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352098 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Criterion | C5141 | |
| L-cysteine | Alfa Aesar | A10389 | |
| yeast extract | Criterion | C741 | |
| sodium taurocholate | Alfa Aesar | A18346 | |
| anaerobic chamber | Coy | vinyl anaerobic chamber | |
| cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates | Anaerobe systems | AS-213 | |
| blood agar plates | Hardy diagnostics | A-10 | |
| latex agglutination reagent | Oxoid | DR1107A | C. diff test kit |
| microcentrifuge tubes | Eppendorf | 222363204 | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | 50-259-98 | |
| microscope slides | J. Melvin freed brand | 7525M | 75 x 25mm |
| flow hood | Labconco | Class II type A2 | biosafety cabinet |
| desk sputtering machine | Denton Vacuum | Desk II | |
| tape | Plastic Core | 05072-AB | SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape |
| gold | Denton Vacuum | TAR001-0158 | 2.375” Diameter x .002” Thick Gold foil |
| scanning electron microscope | FEI | XL-30 |
References
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
- Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).
- Shah, D., et al. Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance. Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).
- Ambrose, P. G., et al. New EMA guideline for antimicrobial development. Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).
- Bassères, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Endres, B. T., et al. A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile. Anaerobe. 40, 10-14 (2016).
- Endres, B. T., et al. Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes. Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).
- Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs. Anaerobe. 27, 31-33 (2014).
- Aitken, S. L., et al. In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent. Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).
- Basseres, E., et al. Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection. J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).
- Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy. Gut. 24 (3), 206-212 (1983).
- Chilton, C. H., et al. Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery. J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).
- Ofosu, A. Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies. Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).
- McDonald, L. C., et al. An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile. New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).
