Un protocollo per caratterizzare i cambiamenti morfologici di

L'obiettivo generale di questo metodo di imaging microbiologico è fornire un mezzo più descrittivo per distinguere gli effetti fenotipici del trattamento farmacologico. Pertanto, questo metodo può essere davvero utile nel campo delle malattie infettive, analizzando in particolare gli effetti morfologici di determinati antibiotici e il modo in cui uccidono C. Difficile.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che combina l'imaging ad alta risoluzione con tecniche di coltura cellulare in vitro per fornire una visione dettagliata dell'azione farmacologica di uccisione. Le implicazioni di questa tecnica potrebbero estendersi alla terapia dell'infezione da Clostridium difficile, o CDI in breve. Il motivo è che questa tecnica potrebbe fornire un mezzo per identificare in che modo un antibiotico possa risultare benefico nel trattamento della CDI.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'azione farmacologica, può essere applicato anche ad altri sistemi, come modelli di colture miste o studi su animali in vivo. In generale, le persone incontrano difficoltà con questo nuovo metodo perché la coltivazione di C.difficile e il funzionamento di un microscopio elettronico a scansione sono operazioni complesse. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando stavamo cercando di distinguere tra i diversi meccanismi d'azione degli antibiotici.

Vorrei presentarle il team di ricerca che incontrerà oggi. Jahangir Alam è un professore e microbiologo. Coordinerà tutte le attività di laboratorio che vedrà oggi.

Tasnuva Rashid è una studentessa laureata del laboratorio. Si occupa di molta della microbiologia quotidiana. Eugenie Bassere è una ricercatrice post dottorato.

Lei ha davvero insegnato a Tasnuva molte delle competenze e assiste anche in laboratorio. Brad Endres è un altro ricercatore post dottorato nel laboratorio. Lui svolgerà molta microscopia con l'aiuto di Long Chang.

Per preparare isolati ambientali indossando guanti sterili, utilizzare una garza di cotone pre-sterilizzata per tamponare la superficie di qualsiasi area di interesse, come un pavimento, una porta, una maniglia o uno scaffale. Successivamente, inserire il tampone in un tubo sterilizzato. Cambiare i guanti tra un campione e l'altro.

Per preparare gli isolati clinici, utilizzare un’ansa di inoculo per piastrare da 10 a 100 milligrammi di campioni fecali clinici su agar cefoxitin-cycloserina-fruttosio, o CCFA, e incubare i campioni in condizioni strettamente anaerobiche per 48-72 ore. Conservare le colonie isolate del ceppo C. Difficile in provette criogeniche a -80 gradi Celsius per ulteriori analisi. Arricchire i campioni da tamponi ambientali in brodo brain heart infusion, o BHI, con taurocolato di sodio allo 0,5% e collocare i campioni in una camera anaerobica a 37 gradi Celsius per cinque giorni.

Centrifugare un millilitro della coltura a 10.000 ×g e utilizzare 100 microlitri di etanolo per risospendere il pellet. Piastrare 50 microlitri delle cellule risospese su piastre CCFA e incubare le colture in una camera anaerobica a 37 gradi Celsius per 40-48 ore. Conservare le colonie isolate di C. difficile in provette criogeniche a -80 gradi Celsius per ulteriori analisi.

Utilizzare il reagente di agglutinazione al lattice o la PCR per testare le colonie sospette di C.difficile. Far crescere ceppi purificati di C.difficile di origine ambientale o clinica su piastre di agar sangue in una camera anaerobica a 37 gradi Celsius per 48 ore. Utilizzare un’ansa di inoculo per prelevare una singola colonia e trasferirla in cinque millilitri di terreno BHI in un tubo da 15 millilitri.

Quindi coltivare la coltura in una camera anaerobica a 37 gradi Celsius per 24 ore. Utilizzare BHIS fresco, pre-ridotto, integrato con taurocolato di sodio e la concentrazione appropriata di antibiotico per diluire le precolture di 1 a 100 fino a circa 10 alla sesta UFC per millilitro. Con una pipetta, raccogliere un campione di un millilitro ad ogni punto temporale e piastrare o distribuire un piccolo aliquota su una piastra di agar sangue.

Incubare la piastra per 48 ore in una camera anaerobica a 37 gradi Celsius e contare il numero risultante di colonie per determinare le UFC. Raccogliere un millilitro di cellule da ciascun punto temporale in provette per microcentrifuga e centrifugare a 10.000 ×g per 10 minuti. Eliminare il soprannatante e lavare le cellule con PBS.

Centrifugare nuovamente i campioni e rimuovere il soprannatante. Quindi utilizzare un millilitro di paraformaldeide al 4% per ri-diluire le cellule e incubare i tubi a temperatura ambiente per un'ora. Dopo aver centrifugato nuovamente i campioni e rimosso il soprannatante, lavare le cellule due volte con acqua distillata prima di ri-diluirle in 100 microlitri di acqua distillata.

Regolare il volume in base alla torbidità della soluzione. Dopo aver etichettato i coprioggetti, aggiungere 40 microlitri del campione su di essi. Sotto una cappa a flusso laminare, incubare i coprioggetti per 15 minuti per far evaporare il liquido e permettere alle cellule di aderire al vetro.

Se è ancora presente del liquido, utilizzare un soffiatore per rimuoverlo. Posizionare i vetrini in una macchina da sputtering da banco e fissarli con del nastro. Inserire dell'oro puro nella macchina da sputtering.

Quindi accendere l'apparecchio e iniziare la sputterizzazione a bassa pressione. Rivestire le cellule per 30 secondi a 80 microamperes, il che corrisponde a un rivestimento d'oro di 20 nanometri. Per iniziare l'acquisizione delle immagini, prima effettuare correttamente la messa in atmosfera del microscopio elettronico a scansione (SEM) nel software del computer premendo il pulsante Vent.

Dopo aver ricoperto le cellule, trasferirle nel microscopio elettronico a scansione, o SEM. Utilizzando il nastro di carbonio, fissare le coprioggetti ricoperte sulla piastra metallica. Una volta che l'SEM è stato ventilato, la porta dovrebbe aprirsi facilmente.

Bloccare il piatto metallico nella camera del SEM avvitandolo. Successivamente, fare clic sul pulsante Pompa nel software. Quando il sistema indicherà che è tutto a posto, il SEM sarà pronto per l'uso.

Nella scheda Detector, fare clic sul rilevatore SE. Accendere il fascio cliccando sul pulsante che mostra la tensione. Iniziare l'acquisizione a una tensione più bassa prima di aumentarla.

Apparirà un'immagine dopo l'accensione del fascio. Utilizzando la funzione di tracciamento, individuare un'area sui coprioggetti rivestiti da acquisire. Ingrandire la regione e cercare strutture a forma di bastoncello, che rappresentano Clostridium difficile.

Per calibrare il sistema, eseguire uno zoom, mettere a fuoco grossolanamente l'immagine e collegare Z alla distanza libera di lavoro. Questa operazione deve essere eseguita a diverse distanze di lavoro, ad esempio a 15, 9 e 5 millimetri. Successivamente passare alla modalità di imaging ad altissima risoluzione.

Utilizzare i comandi di messa a fuoco grossolana e fine per iniziare a mettere a fuoco a ingrandimento elevato. Regolare i comandi di astigmatismo per ottenere un'immagine più nitida e verificare la chiarezza dell'immagine utilizzando il software del computer per ingrandire digitalmente l'immagine. Utilizzare la scansione lenta per acquisire un'immagine di alta qualità.

Salvare l'immagine acquisita come file tiff per un'analisi successiva, assicurandosi di selezionare la barra dati se si effettueranno misurazioni durante l'analisi. Acquisire immagini da angolazioni diverse per rivelare ulteriori informazioni sulla profondità, inclinando il piatto del microscopio elettronico a scansione (SEM). Ottimizzare messa a fuoco e astigmatismo prima di acquisire un'immagine a scansione lenta.

Al termine dell'acquisizione delle immagini, spegnere il fascio e aumentare la distanza di lavoro a 20 millimetri. Quindi ventilare la camera ed estrarre il piatto. Elaborare le immagini, aprendo i file delle immagini in Fiji.

Utilizzando la funzione linea, tracciare con precisione la barra di scala. Fare clic sulla scheda Analyze, quindi scegliere la funzione Select Scale. Apparirà una finestra che richiederà l'impostazione della distanza nota in base alla barra di scala.

Modificare anche l'unità di lunghezza e fare clic su OK. Infine, per misurare la lunghezza della cellula, utilizzare la funzione linea per tracciare l'intera cellula. Selezionare nuovamente la scheda Analizza, quindi fare clic su misura.

La lunghezza dovrebbe essere espressa nelle unità indicate in precedenza. Queste immagini mostrano cellule vegetative di C.difficile catturate durante la fase esponenziale della curva di crescita, così come cellule sporigene. Le cellule vegetative sono strutture allungate, lisce, di forma bastoncellare; al contrario, le spore sono piccole strutture ovali con una superficie esterna ruvida.

Come mostrato in questa figura, le cellule di controllo crescono e raggiungono una fase di plateau; al contrario, le cellule trattate con gli antibiotici vancomicina e metronidazolo mostrano una diminuzione delle UFC totali fino al limite di rilevamento, indicando un effetto battericida. Come dimostrato, vancomicina e metronidazolo risultano efficaci nell'uccidere C.difficile a concentrazioni superiori alla MIC. Per dimostrare l'utilità dell'uso della SEM nell'immaginare C.difficile, le cellule sono state analizzate mediante microscopia prima e dopo il trattamento farmacologico al fine di determinare come fosse cambiata la loro morfologia.

Nel caso della vancomicina, alcune pareti cellulari sono state compromesse e alcune cellule trattate con metronidazolo erano di dimensioni ridotte. Per verificare se la dimensione cellulare era influenzata, la lunghezza delle cellule è stata analizzata utilizzando il programma Fiji. Come mostrato in questa immagine, la dimensione delle cellule vegetative può variare leggermente nel caso di controllo; ma la maggior parte ha una lunghezza di circa 6 micrometri.

Tuttavia, come mostrato in questo grafico, la lunghezza delle cellule è stata influenzata nelle cellule trattate con metronidazolo, ma non in quelle trattate con vancomicina. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di due giorni. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il campione deve essere fissato e completamente asciutto prima della metallizzazione e dell'acquisizione delle immagini.

Seguendo questa procedura, possiamo eseguire ulteriori metodi per rispondere a domande aggiuntive, ad esempio come i batteri rispondono ai trattamenti antibiotici; questo può fornirci maggiori informazioni per comprendere i meccanismi d'azione degli antibiotici. Questa tecnica ha un potenziale enorme e potrebbe aprire la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare ulteriormente la fisiologia e la farmacologia di Clostridium difficile. Spero che abbiate apprezzato la visione di questo video oggi.

Spero che da questo abbiate appreso come coltivare e caratterizzare le cellule di C. difficile, come analizzare la cinetica di uccisione degli antibiotici contro C. difficile e quindi come valutare i cambiamenti morfologici associati a tali schemi di uccisione mediante microscopia avanzata. Mentre si lavora con Clostridium difficile, è necessario adottare precauzioni aggiuntive e utilizzare tutte le protezioni