Un protocollo per caratterizzare i cambiamenti morfologici di Clostridium difficile In risposta al trattamento antibiotico

L'obiettivo generale di questo metodo di imaging microbiologico è quello di fornire un mezzo più descrittivo per distinguere gli effetti fenotipici del trattamento farmacologico. Quindi questo metodo può davvero aiutare nell'area delle malattie infettive. In particolare, esaminando gli effetti morfologici di alcuni antibiotici e il modo in cui uccidono il C.Difficile.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina l'imaging ad alta risoluzione con tecniche di coltura cellulare in vitro per fornire una visione dettagliata dell'azione di uccisione farmaceutica. L'implicazione di questa tecnica può estendersi alla terapia per l'infezione da Clostridium difficile, o CDI in breve. Il motivo è che questa tecnica può fornire un mezzo per identificare come un antibiotico possa essere utile nel trattamento della CDI.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'azione farmacologica, può essere applicato anche ad altri sistemi, come il modello di coltura mista o gli studi su animali in vivo. In generale, le persone hanno difficoltà con questo nuovo metodo perché coltivare C.difficile e utilizzare un microscopio elettronico a scansione è impegnativo. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo cercando di distinguere tra le diverse modalità d'azione degli antibiotici.

Vorrei presentarvi il team di ricerca che incontrerete oggi. Jahangir Alam è un professore e microbiologo. Coordina tutte le attività di laboratorio che vedrete oggi.

Tasnuva Rashid è una studentessa laureata in laboratorio. Si occupa di gran parte della microbiologia quotidiana. Eugenie Bassere è una borsista post-dottorato.

Ha davvero insegnato a Tasnuva molte delle abilità e assiste anche in laboratorio. Brad Endres è un altro post-dottorato in laboratorio. Farà un sacco di microscopia con l'aiuto di Long Chang.

Per preparare gli isolati dell'ambiente indossando guanti sterili, utilizzare una garza di cotone pre-sterilizzata per tamponare la superficie di qualsiasi area di interesse, come un pavimento, una porta, una maniglia o uno scaffale. Quindi posizionare il tampone in una provetta sterilizzata. Cambiare i guanti tra un campione e l'altro.

Per preparare gli isolati clinici, utilizzare un circuito di inoculazione per impiattare da 10 a 100 milligrammi di campioni di feci cliniche su agar cefoxitina cicloserina fruttosio, o CCFA, e intubare i campioni in rigorose condizioni anaerobiche per 48-72 ore. Conservare le colonie isolate del C.Difficile in fiale criogeniche a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per ulteriori analisi. Arricchire i campioni di tampone ambientale in infuso di cuore cerebrale, o brodo BHI, con taurocolato di sodio allo 05% e porre i campioni in una camera anaerobica a 37 gradi Celsius per cinque giorni.

Centrifugare un millilitro di coltura a 10.000 volte G e utilizzare 100 microlitri di etanolo per risospendere il pellet. Piastra 50 microlitri di cellule risospese su piastre CCFA e incuba le colture in una camera anaerobica a 37 gradi Celsius per 40-48 ore. Conservare le colonie isolate di C. difficile in fiale criogeniche a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per ulteriori analisi.

Utilizzare il reagente per agglutinazione al lattice, o PCR, per testare le colonie sospette di C.difficile. Coltiva ceppi di C.difficile purificati ambientali o clinici su piastre di agar sanguigno in una camera anaerobica a 37 gradi Celsius per 48 ore. Utilizzare un circuito di inoculazione per prelevare una colonia isolata e trasferirla in cinque millilitri di terreno BHI in una provetta da 15 millilitri.

Quindi far crescere la coltura in una camera anaerobica a 37 gradi Celsius per 24 ore. Utilizzando BHIS freschi e pre-ridotti integrati con taurocolato di sodio e la concentrazione appropriata di antibiotico per diluire le precolture da 1 a 100 a circa 10 al sesto CFU per millilitro. Con una pipetta, raccogliere un campione da un millilitro in ogni punto temporale e piastrarlo o stendere una piccola aliquota su una piastra di agar sanguigno.

Incubare la piastra per 48 ore in una camera anaerobica a 37 gradi Celsius e contare il numero risultante di colonie per determinare le CFU. Raccogliere un millilitro di cellule da ogni punto temporale in provette da microcentrifuga e centrifugare a 10.000 volte G per 10 minuti. Scartare il surnatante e utilizzare il PBS per lavare le cellule.

Centrifugare nuovamente i campioni ed eliminare il surnatante. Quindi utilizzare un millilitro di paraformaldeide al 4% per diluire nuovamente le cellule e incubare le provette a temperatura ambiente per un'ora. Dopo aver centrifugato nuovamente i campioni e scartato il surnatante, utilizzare acqua distillata per lavare le cellule due volte prima di diluirle nuovamente in 100 microlitri di acqua distillata.

Regolare il volume in base alla torbidità della soluzione. Dopo aver etichettato i vetrini, aggiungere 40 microlitri di campione su di essi. Sotto una cappa di flusso, incubare i vetrini coprioggetto per 15 minuti per far evaporare il liquido e consentire alle celle di aderire al vetro.

Se il liquido è ancora presente, utilizzare un soffiatore per rimuoverlo. Metti i vetrini coprioggetto in una macchina sputtering da tavolo e fissali con del nastro adesivo. Fissa l'oro puro nella macchina sputtering.

Quindi accendere la macchina e iniziare a farfugliare a bassa pressione. Rivestire le celle per 30 secondi a 80 microampere, che si traduce in 20 nanometri di rivestimento d'oro. Per iniziare l'imaging, prima sfiatare correttamente il SEM nel software del computer premendo il pulsante Vent.

Dopo aver rivestito le cellule, trasferirle al microscopio elettronico a scansione, o SEM. Utilizzando il nastro di carbonio, fissare i vetrini coprioggetto rivestiti sul tavolino metallico. Una volta che il SEM è stato sfiatato, la porta dovrebbe aprirsi facilmente.

Bloccare lo stadio metallico nella camera SEM avvitandolo. Quindi, fai clic sul pulsante Pompa nel software. Quando il sistema rilegge correttamente, il SEM sarà pronto per l'uso.

Nella scheda del rilevatore, fare clic sul rilevatore SE. Accendere il raggio facendo clic sul pulsante che visualizza la tensione. Iniziare l'imaging a una tensione più bassa prima di aumentare la tensione.

Un'immagine apparirà dopo l'accensione del raggio. Utilizzando la funzione di tracciamento, trova un'area sui vetrini coprioggetto rivestiti da riprendere. Ingrandisci la regione e trova strutture a forma di bastoncino, che rappresentano il Clostridium difficile.

Per calibrare il sistema, ingrandire, mettere a fuoco grossolanamente l'immagine e collegare Z alla distanza di lavoro libera. Questo dovrebbe essere fatto a più distanze di lavoro, ad esempio a 15, 9 e 5 millimetri. Quindi passa alla modalità di imaging ad altissima risoluzione.

Utilizzare gli interruttori di messa a fuoco grossolana e fine per iniziare a mettere a fuoco ad alto ingrandimento. Regola gli interruttori dell'astigmatismo per ottenere un'immagine più chiara e controlla la nitidezza dell'immagine utilizzando il software del computer per ingrandire digitalmente l'immagine. Utilizzare la scansione lenta per raccogliere un'immagine di alta qualità.

Salvare l'immagine raccolta come file tiff per un'analisi successiva, assicurandosi che la barra dei dati sia selezionata se le misurazioni verranno effettuate durante l'analisi. Raccogli le immagini da diverse angolazioni per rivelare più informazioni sulla profondità inclinando il tavolino sul SEM. Ottimizza la messa a fuoco e l'astigmatismo prima di raccogliere un'immagine a scansione lenta.

Al termine dell'imaging, spegnere il raggio e aumentare la distanza di lavoro a 20 millimetri. Quindi sfiatare la camera e rimuovere il tavolino. Elabora le immagini, apri i file immagine nelle Fiji.

Utilizzando la funzione linea, traccia con precisione la barra della scala. Fare clic sulla scheda Analizza; quindi scegli la funzione Seleziona scala. Apparirà una finestra che richiederà l'impostazione della distanza nota in base alla barra della scala.

Modificate anche l'unità di lunghezza e fate clic su OK (Okay). Infine, per misurare la lunghezza della cella, utilizzare la funzione linea per tracciare la cella nella sua interezza. Selezionare nuovamente la scheda Analizza, quindi fare clic su misura.

La lunghezza dovrebbe apparire nelle unità indicate in precedenza. Queste immagini mostrano le cellule vegetative di C.difficile che sono state catturate durante la fase esponenziale della curva di crescita, così come le cellule sporiche. Le cellule vegetative sono strutture lunghe, lisce, a forma di bastoncello; Considerando che le spore sono piccole strutture ovali che hanno un esterno ruvido.

Come mostrato in questa figura, le cellule di controllo crescono e raggiungono un plateau; mentre, le cellule trattate con gli antibiotici vancomicina e metronidazolo diminuiscono le CFU totali fino al limite di rilevamento, indicando un effetto battericida. Come dimostrato, la vancomicina e il metronidazolo sono efficaci nell'uccidere il C.difficile a concentrazioni di super MIC. Per dimostrare l'utilità dell'uso del SEM per l'imaging di C.difficile, le cellule sono state sottoposte a imaging prima e dopo il trattamento farmacologico per determinare come è cambiata la morfologia.

Nel caso della vancomicina, alcune pareti cellulari sono state colpite e alcune cellule trattate con metronidazolo erano di dimensioni più piccole. Per verificare se la dimensione delle celle è stata influenzata, la lunghezza delle celle è stata analizzata utilizzando il programma Fiji. Come dimostrato in questa immagine, la dimensione delle cellule vegetative può variare un po' nel caso di controllo; Ma la maggior parte è lunga circa 6 micrometri.

Tuttavia, come mostrato in questo grafico, la lunghezza cellulare è stata influenzata nelle cellule trattate con metronidazolo, ma non nelle cellule trattate con vancomicina. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di due giorni. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che il campione è fissato e completamente asciutto prima del rivestimento e dell'imaging.

Seguendo questa procedura, possiamo eseguire metodi aggiuntivi per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio come i batteri risponderanno ai trattamenti antibiotici; E questo può darci qualche informazione in più sulla comprensione dei meccanismi d'azione degli antibiotici, per esempio. Questa tecnica ha un potenziale immenso e può aprire la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare ulteriormente la fisiologia e la farmacologia del Clostridium difficile. Spero che ti sia piaciuto guardare questo video oggi.

Spero che ciò che avete guadagnato da questo sia come far crescere e caratterizzare le cellule di C.difficile, come osservare la cinetica di uccisione degli antibiotici contro C.Difficile, e poi come valutare i cambiamenti morfologici associati a quei modelli di uccisione utilizzando la microscopia ad alto livello. Mentre stiamo lavorando con il Clostridium difficile, dobbiamo prendere ulteriori precauzioni e utilizzare tutte le misure protettive