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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

अलगाव, लक्षण वर्णन, और मोटापे से संबंधित सूजन से प्रभावित ऊतकों से मैक्रोफेज की शुद्धि

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55445
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, 2Microscopy and Cytometry Facility, The Huck Institutes of Life Sciences, Pennsylvania State University

Summary

इस प्रोटोकॉल की अनुमति देता है एक शोधकर्ता को अलग और ऊतक की विशेषता-विभिंन पहचान सूजन ऊतक आहार से निकाले में निवासी मैक्रोफेज चयापचय विकारों के मॉडल प्रेरित ।

Abstract

मोटापा एक पुरानी भड़काऊ राज्य है कि काफी हद तक ऊतक निवासी मैक्रोफेज द्वारा मध्यस्थता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से monocyte-मैक्रोफेज व्युत्पंन को बढ़ावा देता है । आहार-प्रेरित मोटापा (दिो) macrophage विविधता की भूमिका का अध्ययन करने में एक मूल्यवान मॉडल है; हालांकि, पर्याप्त macrophage अलगाव सूजन ऊतकों से प्राप्त करने के लिए मुश्किल हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम अलगाव कदम और आवश्यक समस्या निवारण दिशानिर्देश ऊतक के एक उपयुक्त जनसंख्या प्राप्त करने के लिए हमारे अध्ययन से प्राप्त करने के लिए रूपरेखा-निवासी मैक्रोफेज के 18 सप्ताह के बाद चूहों से उच्च वसा (HFD) या उच्च वसा/ HFHCD) आहार हस्तक्षेप. इस प्रोटोकॉल तीन बानगी जिगर, सफेद वसा ऊतकों (वाट), और महाधमनी सहित मोटापा और atherosclerosis में अध्ययन ऊतकों पर केंद्रित है । हम उजागर कैसे द्वैतवादी के उपयोग के प्रवाह cytometry अलगाव और ऊतक के लक्षण वर्णन-निवासी मैक्रोफेज के एक नए आयाम को प्राप्त कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल का एक मूलभूत खंड पते जटिलताओं अंतर्निहित ऊतक-विशिष्ट एंजाइमी पाचक और macrophage अलगाव, और बाद में सेल सतह एंटीबॉडी प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए धुंधला । इस प्रोटोकॉल के मौजूदा जटिलताओं के लिए फ्लोरोसेंट अंतर्निहित कक्ष छंटाई (FACS) और इन जटिलताओं को प्रस्तुत स्पष्टीकरण इतनी के रूप में पर्याप्त रूप से हल सेल आबादी से व्यापक रेंज लक्षण वर्णन प्राप्त करने के पते । वैकल्पिक संवर्धन तरीकों ऐसे घने जिगर के रूप में कोशिकाओं छंटाई, लचीलापन और समय प्रबंधन के लिए अनुमति जब FACS के साथ काम करने के लिए शामिल हैं । संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल शोधकर्ता एड्स एक दिया अध्ययन में सूजन ऊतकों की भीड़ से macrophage विविधता का मूल्यांकन करने और व्यावहारिक समस्या निवारण युक्तियां है कि अनुकूल सेलुलर अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए सफल रहा है प्रदान करता है की प्रतिरक्षा कोशिकाओं में दिो-मध्यस्थता सूजन ।

Introduction

माउस मॉडलों को बड़े पैमाने पर मानव रोगों की गतिशीलता का अध्ययन किया गया है । एक रोगग्रस्त राज्य में चूहों से ऊतक निवासी कोशिकाओं के समुचित अलगाव एक रोग के रोगजनन के लिए आणविक और सेलुलर योगदान को समझने के लिए एक मंच प्रदान कर सकते हैं1. एक विकार है कि महत्वपूर्ण महत्व का है मोटापा है । मोटापे की घटनाओं इंसुलिन प्रतिरोध और प्रकार 2 मधुमेह के साथ समानांतर में दुनिया भर में वृद्धि जारी है, हृदय रोग, और फैटी लीवर रोग2,3. अत्यधिक पोषक तत्वों की खपत आगे की कमी शारीरिक गतिविधि वसा ऊतक, जो महाधमनी और जिगर के रूप में अंय परिधीय ऊतकों के सेलुलर वातावरण बदल सकते है से निकलने को ट्रिगर बदलने के संकेत से विषम है4। एक पुरानी कम ग्रेड प्रणालीगत सूजन में चयापचय homeostasis परिणाम के इस तरह के विघटन5.

महाधमनी और जिगर के लिए मैक्रोफेज निवासी के शास्त्रीय सक्रियकरण के रूप में अच्छी तरह से सफेद वसा ऊतक (वाट) के लिए उनकी भर्ती के लिए न केवल चयापचय संकेतों की dysregulation आरंभ करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन यह भी सूजन को बनाए रखने6,7. मैक्रोफेज के phenotypic और कार्यात्मक विविधता मोटापे से संबंधित सह-रुग्णता के रोगजनन के साथ दृढ़ता से जुड़ा हुआ है7. macrophage ध्रुवीकरण में गतिशील प्लास्टिक के लिए इन कोशिकाओं को सक्रिय phenotypes की एक श्रृंखला है कि प्रगति और सूजन के समाधान के समंवय8के लिए अनुमति देता है । जबकि प्रतिष्ठित (M1) मैक्रोफेज सूजन के प्रचार में फंसा रहे हैं, वैकल्पिक रूप से सक्रिय (M2) मैक्रोफेज संकल्प और ऊतक की मरंमत के साथ संबद्ध किया गया है9,10।

शरीर के रूप में चयापचय तनाव, सफेद वसा ऊतक असामान्य रूप से जमा हो जाती है । विस्तारित वसा ऊतक को आकर्षित करती है और भड़काऊ कोशिकाओं को बरकरार रखती है कि अंत में इंसुलिन प्रतिरोध को बढ़ावा देने के लिए सामान्य adipocyte समारोह में परिवर्तन, hyperglycemia और अंततः टाइप 2 मधुमेह, इंसुलिन प्रतिरोध या hyperglycemia11, 12. समानांतर में, सफेद वसा ऊतक घुसपैठ द्वारा जारी भड़काऊ संकेतों के जवाब में remodels क्लासिकल (M1) वसा ऊतक मैक्रोफेज (एटीएम)13,14। इस बहु-सेलुलर अंग संकेतों का झरना है कि इस तरह के महाधमनी और जिगर के रूप में शरीर के अंय अंगों के सामांय समारोह में उतारना4डालती है ।

जिगर एक चयापचय बिजलीघर है कि पास dysregulated वाट15से उद्भव उत्तेजनाओं के जवाब में अनुकूल है । यकृत मैक्रोफेज या Kupffer कोशिकाओं, चयापचय परिवर्तन के जवाब में, भड़काऊ साइटोकिंस कि दोनों parenchymal और गैर parenchymal सेल phenotype को बदलने और ऊतक remodeling को बढ़ावा देने के स्रावित । यकृत लिपिड संचय, सूजन, अत्यधिक extracellular मैट्रिक्स जमा, परिगलन और अंतिम समारोह हानि जिगर गैर शराबी फैटी लीवर रोग के साथ जुड़े नुकसान की व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए योगदान भड़काऊ अपमान के बाद 16,17,18.

समझौता वाट और जिगर समारोह के समानांतर में, बड़े धमनियों शरीर जीर्ण चयापचय तनाव19के रूप में धमनी की दीवार के भीतर लिपिड जमा । धमनी लिपिड संचय सक्रिय endothelial कोशिकाओं और monocytes20के बाद भर्ती द्वारा chemokines के स्राव से चलाता है । एक बार भर्ती, monocytes पैदा, अंतर, लिपो निगल और फोम कोशिकाओं बन जाते हैं । Atherogenesis और भर्ती और ऊतक निवासी लिपिड लादेन मैक्रोफेज के समर्थक भड़काऊ गतिविधि द्वारा शुरू की है । extracellular और intracellular तनाव इस atherogenic microenvironment में relayed संकेतों के सामने झुकने, इन मैक्रोफेज तो एक अपोप्तोटिक संकेतन झरना में संलग्न हैं । इन फोम कोशिकाओं के मरने के रूप में, वे घाव, जो फिर पट्टिका टूटना करने के लिए सुराग, रोधगलन, और स्ट्रोक की ओर जाता है उनके लिपिड भरा सामग्री योगदान ।

सामूहिक रूप से, भाग में macrophage phenotypes के विविधता इस तरह वाट, जिगर और महाधमनी8,21के रूप में dysregulated ऊतकों में मनाया भड़काऊ परिवर्तन द्वारा प्रेरित मोटापे का उद्घोष । भर्ती और ऊतक निवासी मैक्रोफेज के लक्षण वर्णन संभावित आणविक लक्ष्य है कि macrophage phenotype1हेरफेर में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है । प्रभावी रूप से मोटापे से प्रेरित सूजन ऊतकों से मैक्रोफेज की विशेषता के लिए, एक एकल कोशिका निलंबन एंजाइमी पाचन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है । इस तरह के पृथक्करण प्रोटोकॉल पर्याप्त अपमानजनक संयोजी ऊतक जबकि प्रतिरक्षा कोशिका मृत्यु को कम करने और इष्टतम सेल उपज प्रदान करने में प्रभावी होना चाहिए । एंजाइम मिश्रण ऊतक के प्रकार और उसके संरचनात्मक श्रृंगार पर निर्भर है । ऐसे महाधमनी के रूप में लचीला ऊतकों मजबूत एंजाइमी गतिविधि की आवश्यकता है, के रूप में जिगर और वाट की तुलना में, ऊतक पृथक्करण प्राप्त करने के लिए । एकल सेल निलंबन से, ऊतक निवासी मैक्रोफेज स्पष्ट रूप से विशेषता या transcriptional रूपरेखा के रूप में आगे बहाव के विश्लेषण के लिए अलग किया जा सकता है ।

यहाँ एक ऊतक-विशिष्ट प्रोटोकॉल का उपयोग करता है कि collagenase-निर्भर ऊतक पाचन और polychromatic प्रवाह cytometry को प्रभावी ढंग से अलग और ऊतक-निवासी मैक्रोफेज पारंपरिक आहार से प्राप्त मोटापे से प्रेरित की विशेषताएं, atherosclerosis, सिंपल steatosis और steatohepatitis माउस मॉडल्स । ल्युकोसैट के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ सेल सतह मार्करों के एक साथ धुंधला-(CD45 और/CD11b) और macrophage-(F4/विशिष्ट एंटीजन अक्सर macrophage आबादी22की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) उच्च शुद्धता पर इन की पहचान की आबादी को क्रमबद्ध करने के लिए इस्तेमाल एक शक्तिशाली रणनीति है. हल जनसंख्या तो phenotype विशिष्ट जीन बहाव आणविक विश्लेषण (जैसे मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया)23के रूप में) का उपयोग कर प्रोफाइल के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है । हालांकि मानक प्रवाह cytometry और प्रवाह cytometry-आधारित कक्ष छँटाई एक काफी विषम कोशिका निलंबन के भीतर मैक्रोफेज भेद में शक्तिशाली उपकरण हैं, पूर्व प्रोटोकॉल सफल उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. इस अध्ययन में, प्रोटोकॉल है कि प्रभावी ढंग से अलग और व्यवहार्य ऊतक विशिष्ट मैक्रोफेज विशेषताएं वर्णित हैं; इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस अध्ययन तकनीकी मुद्दों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है कि अक्सर उठता है, साथ ही साथ सक्रिय और मुसीबत शूटिंग रणनीतियों को रोकने के लिए और/

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रोटोकॉल (वर्गों 1, १.२, और १.३) पेंसिल्वेनिया राज्य विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

ऊतक पृथक्करण थें तयारी अंतिम मात्रा भंडारण
सफेद वसा ऊतक (वाट) पृथक्करण बफर: २.५% HEPES, 10 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA), 3 mg/एमएल (०.३%) l-glutamine और सोडियम पाइरूवेट के बिना ४.५ g/l ग्लूकोज के साथ Dulbecco के संशोधित ईगल मीडियम (DMEM) में Collagenase टाइप II ५०० एमएल शूंय से ८० ° c (10 मिलीलीटर aliquots)
जिगर 25x छिड़काव बफर ध्यान (PBC): ३.५५ मीटर NaCl, १६८ मिमी KCl, २४० मिमी HEPES, १५० मिमी NaOH आसुत में ज2हे ५०० एमएल शूंय से 20 ° c (४० एमएल aliquots)
संरक्षण बफ़र (PRB): 1x छिड़काव बफ़र में 1% BSA 1 L 4 ° c
पृथक्करण बफर: 1x छिड़काव बफर ४.७६ mM CaCl2 और ७२ यू/एमएल Collagenase प्रकार चतुर्थ के साथ पूरक ५० एमएल (प्रति माउस) उपयोग करने से पहले तुरंत तैयार करें
महाधमनी पृथक्करण बफर: १२५ u/एमएल Collagenase प्रकार XI, ६० u/एमएल Hyaluronidase प्रकार मैं, ६० u/एमएल DNase मैं, ४५० u/एमएल Collagenase प्रकार मैं, 20 मिमी HEPES 1x फास्फेट में खारा (पंजाब) ५०० एमएल शूंय से ८० ° c (10 मिलीलीटर aliquots)

तालिका 1: ऊतक विशिष्ट छिड़काव बफर व्यंजनों ।

1. ऊतक अलगाव और पृथक्करण

  1. वाट अलगाव और पृथक्करण
    1. ऊतक-विशिष्ट बफ़र्स तालिका 1के अनुसार तैयार करें, और उंहें वर्णन किया गया के रूप में संग्रहीत ।
    2. निम्नलिखित रिएजेंट तैयार करें ।
      1. उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर वाट पृथक्करण बफर और स्टोर के उचित मात्रा गल द्वारा पाचन बफर तैयार करें । तुरंत उपयोग करने से पहले, ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म बफर । 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त 1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब) तैयार करके FACS बफर तैयार करें ।
    3. वाट अलगाव
      1. Euthanize एक कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) भरा चैंबर में एक चूहा । विच्छेदन चरण को जारी रखने से पहले प्रभावशीलता की जांच करें ।
      2. euthanized माउस को संक्षेप में एक चोंच में ७०% इथेनॉल युक्त जब तक अच्छी तरह से लथपथ और इथेनॉल के साथ लेपित में डुबकी । माउस ventral सतह को विच्छेदन चरण पर रखें और 21 ग्राम सुई का उपयोग करते हुए विच्छेदन बोर्ड को माउस सामने और हिंद पंजे जकड़ना ।
      3. मध्यम बिंदु टिप संदंश का प्रयोग करें मूत्रमार्ग खोलने के लिए उदर त्वचा पूर्वकाल समझ, तो तेज विदारक कैंची का प्रयोग कर लोभी पेट की त्वचा में एक निक बनाने के लिए ।
      4. त्वचा और आँख के बीच छोटे चीरा में कैंची के निचले ब्लेड डालें और रिब पिंजरे के लिए पेट से एक पार्श्व चीरा बनाते हैं ।
      5. धीरे से बरकरार पेरिटोनियल गुहा का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा को वापस खींच और एक पार्श्व चीरा बनाने के लिए और या तो वापस पारदर्शी झिल्ली गुना या ऊतक उत्पाद उदर वाट बेनकाब करने के लिए ।
      6. मान एट अल में वर्णित के रूप में perigonadal वसा पैड लीजिए. 24
        1. पुरुष चूहों में perigonadal फैट पैड शिथिल अधिवृषण और testes के लिए बाध्य कर रहे हैं । पहले परीक्षण का पता लगाने और फिर मध्यम बिंदु संदंश के साथ, अधिवृषण सिर की पकड़ समझ और धीरे से खींच ।
        2. तेज विदारक कैंची का प्रयोग, अधिवृषण की सतह (सिर, शरीर और पूंछ) और परीक्षण के साथ काटने के द्वारा प्रत्येक epididymal वसा पैड उत्पाद ।
        3. संदंश के साथ, धीरे सीधे अधिवृषण संरचना करने के लिए बाध्य संयोजी ऊतक के माध्यम से काटने, जबकि वसा पैड पर खींच.
        4. संदंश का प्रयोग, मजबूती से अधिवृषण को वसा पैड समीपस्थ के अंत पकड़ और धीरे gonads से दूर वसा पैड छील
        5. मादा चूहों में perigonadal फैट पैड को शिथिल कर गर्भाशय शरीर और गर्भाशय के हॉर्न के बंधन में बंध जाते हैं ।
        6. मध्यम बिंदु संदंश का उपयोग करना, perigonadal वसा ऊतक पकड़ और धीरे ऊतक गर्भाशय शरीर और गर्भाशय सींग से दूर खींच ।
        7. एक्साइज प्रत्येक वसा पैड गर्भाशय शरीर और गर्भाशय सींग तेज विदारक कैंची का उपयोग कर के साथ काटने के द्वारा ।
      7. एक पेट्री-पंजाबियों से भरी डिश में फैट पैड प्लेस और ऊतक नम रखने के लिए बर्फ पर रखें ।
    4. एकल सेल सस्पेंशन में वाट की पृथक्करण
      1. पेट्री पकवान से अतिरिक्त पंजाबियों को हटा दें और एक एकल बढ़त उस्तरा ब्लेड का उपयोग करने के लिए छोटे टुकड़ों में पेट वाट कीमा ।
      2. उस्तरा ब्लेड की तेज धार के साथ, धीरे से एक लेबल 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब 2 मिलीलीटर वाट पृथक्करण बफर युक्त में कीमा बनाया हुआ पेट वाट परिमार्जन ।
      3. इस ऊतक की मशीन-४५ मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर धीमी गति से सतत रोटेशन के तहत पाचन बफर मिश्रण ।
      4. एक ५० मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से पचा ऊतक फ़िल्टर जबकि एक परिपत्र गति में एक सिरिंज सवार के रबर पिस्टन चलती है और फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन चलनी जारी है ।
      5. प्लास्टिक एक 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब करने के लिए Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 2 मिलीलीटर, धीरे ऊपर और नीचे प्लास्टिक और एकल सेल निलंबन के साथ फिल्टर धो लो ।
      6. फिल्टर को ठंडे DMEM के साथ दो अतिरिक्त बार धोएं और बर्फ पर सिंगल सेल सस्पेंशन लगाएं ।
      7. 8 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ३०० x g पर सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक ।
      8. फ्लोटिंग adipocytes (प्रथम) और शेष supernatant को सावधानीपूर्वक निकालने के लिए एक वैक्यूम aspirator का प्रयोग करें । सुनिश्चित करें कि गोली stromal संवहनी अंश (SVF) परेशान नहीं करने के लिए ।
      9. एक १,००० µ एल पिपेट के साथ, धीरे से फिर से निलंबित अमोनियम क्लोराइड में गोली-पोटेशियम (ले) बफर करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार लाइसे एरिथ्रोसाइट्स ।
      10. DMEM के साथ ऊपर के सेल सस्पेंशन को पतला करें और 8 मिनट के लिए ३०० g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल सस्पेंशन को कम कर दीजिये ।
      11. 2% FBS (FACS बफर) युक्त ठंडे पंजाब में कोशिकाओं को पुनः निलंबित और एक Burker कक्ष में कोशिकाओं की गणना/hemocytometer ।
      12. या तो 1 x 106 कोशिकाओं स्थानांतरण (बुनियादी प्रवाह cytometry के लिए) या पूरे सेल निलंबन (FACS के लिए) 5 मिलीलीटर गोल नीचे polystyrene ट्यूबों लेबल करने के लिए । प्रवाह cytometry दाग प्रोटोकॉल के लिए खंड 2 के लिए जारी रखें ।
  2. जिगर ऊतक अलगाव और पृथक्करण
    नोट: इस प्रोटोकॉल Smedsrød25से अनुकूलित किया गया था ।
    1. ऊतक-विशिष्ट बफ़र्स तालिका 1 के अनुसार तैयार करें और उंहें बताए अनुसार संग्रह ।
    2. निम्नलिखित रिएजेंट तैयार करें ।
      1. 1x छिड़काव बफर (पंजाब) तैयार, PBC के कमजोर ४० मिलीलीटर ९६० मिलीलीटर ultrapure एच2में से पूर्व गर्म एक सिरिंज ३७ डिग्री सेल्सियस पर पंजाब के ५० मिलीलीटर से भरा, बस से पहले छिड़काव शुरू होता है । किसी भी वर्तमान हवा बुलबुले को हटा दें ।
        1. हवा बुलबुले को खत्म करने के लिए, जहां leur ताला टिप ऊपर की ओर इशारा कर रहा है सिरिंज पलटना । नल या हवा के बुलबुले शीर्ष पीएफ सिरिंज के लिए कर रहे हैं जब तक सिरिंज झटका. सवार को हवा से निष्कासित करने पर धीरे से धक्का
      2. कमजोर ०.५ एमएल के ४७६ mM CaCl2 समाधान ४९.५ एमएल 1x छिड़काव बफर के द्वारा पाचन बफर तैयार करें । ४.७६ mM CaCl2 -पंजाब समाधान के लिए Collagenase प्रकार चतुर्थ के 3600U जोड़ें । पूर्व गर्म एक सिरिंज पाचन की ५० मिलीलीटर से भरा ३७ डिग्री सेल्सियस पर बस से पहले छिड़काव शुरू होता है । चरण 1.2.2.1.1 में वर्णित के रूप में किसी भी वर्तमान हवा बुलबुले को हटा दें ।
      3. संरक्षण बफर (PRB) को भंग करके तैयार २.५ जी गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) में २५० एमएल 1x छिड़काव बफर । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या उपयोग जब तक बर्फ पर रखें ।
      4. 1x पंजाबियों और 2% FBS के साथ FACS बफर तैयार करें ।
    3. जिगर ऊतक अलगाव
      1. Euthanize CO2 asphyxiation द्वारा एक माउस, ७०% इथेनॉल के साथ संतृप्त माउस को फर से intraabdominal अंगों के संक्रमण को रोकने के ।
      2. स्थिति माउस ventral ओर एक polystyrene फोम विदारक बोर्ड पर और माउस सामने और हिंद पंजे 21 जी सुई का उपयोग कर विच्छेदन बोर्ड को सुरक्षित ।
      3. वक्ष दीवार और पेरिटोनियल गुहा का पर्दाफाश करने के लिए, एक मध्यम बिंदु टिप संदंश का उपयोग कर मूत्रमार्ग खोलने के पास उदर त्वचा समझ । फिर लोभी उदर की त्वचा के लिए एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए एक तेज विदारक कैंची का प्रयोग करें ।
      4. त्वचा और आँख के बीच छोटा सा चीरा में कैंची के निचले ब्लेड डालें और कमर से ठोड़ी तक एक पार्श्व चीरा बनाते हैं ।
      5. धीरे से बरकरार पेरिटोनियल गुहा और वक्ष दीवार को बेनकाब करने के लिए त्वचा को वापस खींच, एक पार्श्व चीरा करने के लिए और श्लेष्मा झिल्ली उत्पाद ।
      6. उरोस्थि को उठा लें और डायाफ्राम को सावधानी से काटकर, हीन वेना कावा (IVC) को परेशान न करें । पक्ष को जठरांत्र अंगों हटो और उपयकृत IVC का पता लगाने । स्थानीयकृत छिड़काव बनाए रखने के लिए suprahepatic IVC को दबाना hemostatic संदंश का उपयोग करें ।
        ध्यान दें: आंत सफेद वसा ऊतक के अत्यधिक संचय अक्सर IVC मुखौटा कर सकते हैं । बेहतर इस पोत कल्पना करने के लिए, IVC के बगल में वसा ऊतक के एक छोटे से क्षेत्र में उत्पाद किया जा सकता है । लचीला वसा ऊतक के भीतर incised खिड़की तो IVC पर तैनात किया जा सकता है cannulation के लिए पोत को बेनकाब ।
      7. 23 जी रक्त संग्रह और अर्क सेट करने के लिए पूर्व गर्म पंजाब से भरा सिरिंज संलग्न करें । धीरे ट्यूबिंग और सुई पंजाब से भर रहे हैं जब तक सवार पर धक्का.
      8. 23 जी सुई डालें, उपयकृत IVC के स्तर के समानांतर । एक 4 सेमी hemostatic दबाना का उपयोग कर जगह में सुई सुरक्षित ।
        नोट: उपयकृत IVC के Cannulation आहार में पसंद किया जाता है खिलाया चूहों में है कि IVC बेहतर visualized हो सकता है और वसा से भरा गुहा के भीतर cannulated ।
      9. धीरे सवार पर धक्का छिड़काव शुरू करने के लिए, रंग तेजी से जिगर से फ्लश जाएगा (सही पालि पहले) यदि सुई उचित पोत में तैनात है । पालियों के इज़ाफ़ा भी दिखाई अगर सुई ठीक से उपयकृत IVC में डाला जाता है ।
      10. तुरंत पोर्टल नस में कटौती पंजाब जिगर के माध्यम से स्वतंत्र रूप से प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं ।
      11. लिवर को तब तक Perfuse, जब तक खून दिखाई न दे । अवसर पर धीरे छिड़काव की सुविधा के लिए सामने उंगली और अंगूठे के बीच जिगर पालियों मालिश ।
        नोट: यह गैर दांतेदार कुंद उपकरण धार का उपयोग करने के लिए जिगर को संभाल ऊतक नुकसान को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है ।
      12. जब पंजाब के 5 मिलीलीटर सिरिंज के भीतर रहता है, पूर्व गर्म पृथक्करण बफर के साथ भरा सिरिंज को बदलने. इस समय के दौरान सुरक्षित सुई की स्थिति को परेशान मत करो ।
        नोट: बढ़े हुए जिगर काफी १.५ जी से अधिक पूर्व गर्म पाचन बफर की एक बड़ी मात्रा के साथ perfused होना चाहिए सफल जिगर पृथक्करण की गारंटी ।
      13. लिवर को पूरी तरह से पच जाने तक Perfuse । धीरे छिड़काव की सुविधा के लिए जिगर पालियों मालिश ।
        नोट: पैरेन्काइमा से Glisson के कैप्सूल की जुदाई एक सफलतापूर्वक पचा जिगर में चौकस है. इस का आकलन करने के लिए, संदंश की एक जोड़ी के कुंद किनारे का उपयोग करें, धीरे बाएं पार्श्व पालि पर प्रेस करने के लिए । सतह पर एक इंप्रेशन दिखाई देना चाहिए और संदंश निकाले जाने के बाद इंडेंट को धीरे से भरना चाहिए.
      14. उपयकृत IVC से सुई निकालें. suprahepatic IVC को दबाना hemostatic संदंश न निकालें ।
      15. एक छोटी सीधे ब्लेड विदारक कैंची का उपयोग कर जोड़ने के बंधन के माध्यम से ध्यान से काटने और पित्ताशय की थैली को हटाने के द्वारा पूरे जिगर एक्साइज ।
      16. एक 10 सेमी पेट्री में पूरे जिगर प्लेस-10 मिलीलीटर बर्फ शीत संरक्षण बफर और 4 оसी पर स्टोर से युक्त पकवान मुक्त कोशिकाओं को तैयार जब तक ।
    4. लिवर सेल पृथक्करण
      1. 10 मिलीलीटर बर्फ से युक्त 10 सेमी डिश के लिए जिगर को हस्तांतरण-शीत DMEM ।
      2. पकड़ गंभीर suprahepatic IVC एक दांतेदार संदंश का उपयोग कर उत्पाद के जिगर से जुड़ी । प्रत्येक पालि के लिए तेजी से पथपाकर गति लागू करके Glisson के कैप्सूल से कोशिकाओं को रिहा करने के लिए मध्यम बिंदु संदंश का प्रयोग करें ।
      3. एक ७० µm सेल एक ५० मिलीलीटर संग्रह ट्यूब से जुड़ी छलनी के माध्यम से संतृप्त DMEM दर्रा ।
      4. प्लास्टिक 10 मिलीलीटर बर्फ-शीत DMEM 10 सेमी पेट्री पकवान और दोहराने कदम 1.2.4.1 को 1.2.4.3 जब तक मीडिया संतृप्ति अब नहीं मनाया जाता है । बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन रखें ।
      5. धीरे संग्रह ट्यूब औंधा द्वारा सेल निलंबन मिश्रण है और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ५४ x g पर केंद्रापसारक ।
      6. एक साफ ५० मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में supernatant लीजिए । फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ५४ x g पर सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक ।
      7. चरण 1.2.4.8 करने के लिए आगे बढ़ने से पहले दो अतिरिक्त समय 1.2.4.6 चरण दोहराएँ ।
      8. supernatant एक साफ ५० एमएल संग्रह ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक ।
      9. FACS बफर में गैर parenchymal सेल गोली पुनः निलंबित और उंहें एक Burker कक्ष में गिनती/hemocytometer ।
      10. स्थानांतरण 1 x 106 कोशिकाओं (बुनियादी प्रवाह cytometry के लिए) या 15 x 106 -20 x 106 कोशिकाओं (FACS के लिए) 5-एमएल गोल नीचे polystyrene ट्यूबों लेबल करने के लिए । प्रवाह cytometry दाग प्रोटोकॉल के लिए खंड 2 के लिए जारी रखें ।
  3. महाधमनी अलगाव और पृथक्करण
    नोट: इस प्रोटोकॉल कसाई से अनुकूलित किया गयाet al.26
    1. तालिका 1 में प्रदान किए गए व्यंजनों पर आधारित ऊतक-विशिष्ट बफ़र्स तैयार करें और उंहें वर्णन किया गया के रूप में संग्रहीत करे ।
    2. निम्नलिखित रिएजेंट तैयार करें ।
      1. उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर वाट पृथक्करण बफर और स्टोर के उचित मात्रा गल द्वारा पाचन बफर तैयार करें । तुरंत उपयोग करने से पहले, ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म बफर ।
      2. २०० U/एमएल की एकाग्रता पर 1x पंजाब में हेपरिन सोडियम नमक को भंग करके एक 10x हेपरिन समाधान तैयार करें । 1x पंजाबियों के साथ 10x हेपरिन शेयर समाधान पतला एक 1x हेपरिन समाधान तैयार करने के लिए । उपयोग करने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 10x और 1x हेपरिन समाधान की दुकान ।
      3. 2% FBS युक्त 1x पंजाबियों के साथ FACS बफर तैयार करें ।
    3. महाधमनी विच्छेदन
      1. Euthanize एक कार्बन डाइऑक्साइड भरा चैंबर में एक चूहा और ७०% इथेनॉल के साथ कुल्ला ।
      2. माउस ventral बगल के मंच पर जगह है, माउस सामने और हिंद पंजे फैला है और उंहें 21 जी सुई का उपयोग कर विच्छेदन बोर्ड को जकड़ना ।
      3. माउस euthanizing के तुरंत बाद, कार्डियक पंचर प्रदर्शन करते हैं । यदि आवश्यक हो, तो 1.3.3.9 1.3.3.4 चरणों का संदर्भ लें ।
      4. उरोस्थि के निचले छोर पर असिरूप प्रक्रिया की स्थिति जानें
      5. ऐसा करने के लिए, एक उंगली जानवरों की गर्दन की चौड़ाई के साथ मध्यबिंदु जगह है । एक उपास्थि विस्तार महसूस किया है जब तक उरोस्थि के caudal अंत करने के लिए गर्दन से ventral midline साथ ट्रेस ।
      6. मध्यम बिंदु संदंश उपास्थि विस्तार समझ का प्रयोग करें, और यदि आवश्यक हो तो क्षेत्र में बाल या त्वचा के पैच को हटाने के द्वारा असिरूप प्रक्रिया के स्थान चिह्नित ।
      7. आंशिक रूप से 20-30 ° कोण पर असिरूप प्रक्रिया के तहत एक 26 ग्राम सुई डालें ।
      8. धीरे सवार वापस लेने से सिरिंज के लिए नकारात्मक दबाव लागू होते हैं, तो गुहा में आगे सुई डालने जब तक रक्त बहता है.
      9. यदि रक्त प्रवाह बंद हो जाता है, धीरे सुई घुमाएं या थोड़ा अंदर और बाहर ले जाएं ।
      10. संदंश की जोड़ी का प्रयोग करें मूत्रमार्ग खोलने के लिए उदर त्वचा पूर्वकाल की पकड़ हड़पने के लिए, और तेज विदारक कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए कमर से ठोड़ी को ventral midline के साथ कट ।
      11. वापस त्वचा खींचो पेट अंगों और उंगलियों या कुंद संदंश के साथ रिब पिंजरे को बेनकाब करने के लिए धीरे पक्ष के लिए उदर अंगों ले जाएं ।
      12. असिरूप प्रक्रिया की पकड़ हड़पने के लिए संदंश का प्रयोग करें, उरोस्थि उठा, और डायाफ्राम काटकर ।
      13. विच्छेदन कैंची, दोनों पक्षों पर पार्श्व पसलियों के माध्यम से कटौती का उपयोग करना । उरोस्थि मनोरंजक, रिब पिंजरे ऊपर की ओर फ्लिप और जोड़ने के आधार के माध्यम से कटौती । रिब पिंजरे अंतर्निहित वक्ष अंगों को उजागर निकालें ।
      14. Perfuse के साथ महाधमनी एक 26-गेज सुई से जुड़ी एक 10 मिलीलीटर-के लिए छोड़ दिया निलय (एल. वी.) में समाधान की 1-2 मिलीलीटर इंजेक्शन द्वारा 1x हेपरिन समाधान से भर सिरिंज ।
        नोट: बरकरार atherosclerotic महाधमनी घावों को सुनिश्चित करने के लिए थोड़ा दबाव के साथ एक धीमी दर पर perfuse सुनिश्चित करें ।
      15. थाइमस, फेफड़ों और संयोजी ऊतक उत्पाद । यदि आवश्यक हो, तो 1.3.3.16 और 1.3.3.17 चरणों का संदर्भ लें ।
        1. दिल को पूर्वकाल सफेद द्वि-पालि (या तितली आकार का) अंग का पता लगाने और दृढ़ता से संदंश के साथ थाइमस की पकड़ पकड़ो । गुहा से दोनों पालियों को ऊपर की ओर खींचें और कैंची से आधार पर काटें ।
        2. फेफड़ों को हटाने के लिए, संदंश के साथ एक फेफड़े पालि चुटकी, ऊतक वक्ष गुहा से दूर खींच और आधार पर कटौती । प्रत्येक शेष पालि के लिए दोहराएँ ।
      16. एक विच्छेदी माइक्रोस्कोप और सूक्ष्म-विदारक उपकरण का उपयोग करें, और महाधमनी आर्क (भाजक सहित, छोड़ आम मन्या धमनी और बाएं अवजत्रुकी धमनी), आरोही, अवरोही, वक्ष और उदर महाधमनी को इकट्ठा ।
        1. दिल की बाईं निलय पर आरोही महाधमनी का पता लगाएँ.
        2. वक्र ०.०७ x ०.०४ mm-टिप संदंश की एक जोड़ी के साथ धीरे आरोही महाधमनी के भाग को समझ में वाम निलय से उभर रहे हैं ।
          नोट: आसपास के पीले रंग की वसा ऊतक की तुलना में, महाधमनी एक चमकदार सफेद LV जब पर्याप्त रूप से हेपरिन समाधान के साथ फ्लश से उद्भव पोत होगा ।
          1. यदि महाधमनी को कार्डियक छिड़काव द्वारा ठीक से फ्लश नहीं किया गया था, तो महाधमनी को पुनः फ्लश करते समय महाधमनी गुहा से जुड़ा रहता है । ऐसा करने के लिए, दिल-महाधमनी जंक्शन के पास कट, दिल को हटा दें, और फिर पेट महाधमनी के निचले छोर के माध्यम से क्षैतिज कटौती । आरोही महाधमनी के उद्घाटन में एक 26 जी सुई डालें और धीरे 1x हेपरिन समाधान के साथ महाधमनी फ्लश ।
          2. धीरे वसा ऊतक और एंबेडेड महाधमनी के बीच बेहतर भेदभाव को आरोही महाधमनी पर रस्साकशी ।
          3. फिर भी धीरे से आरोही महाधमनी पर खींच, बंद वसंत विदारक कैंची की नोक का उपयोग करने के लिए वसा स्पष्ट है कि आरोही महाधमनी और महाधमनी आर्क encapsulate । ऐसा करने के लिए, स्ट्रोक बंद कैंची ब्लेड की नोक के साथ वसा ऊतक दूर जोड़ने वसा आंसू ।
            नोट: जब तक आरोही महाधमनी और मेहराब स्पष्ट रूप से visualized किया जा सकता है काटने से किसी भी वसा ऊतक एक्साइज से बचना । यह महाधमनी को काटने से रोकने के लिए है ।
          4. यदि आरोही महाधमनी और चाप स्पष्ट रूप से चारों ओर वसा ऊतक से delineated जा सकता है, वसंत विदारक कैंची का उपयोग करने के लिए अतिरिक्त वसा एक्साइज ।
          5. धीरे संदंश के साथ महाधमनी आर्क की पकड़ पकड़ो । फिर वसंत है कैंची टिप, पेट महाधमनी के caudal अंत करने के लिए उतरते, वक्ष और उदर महाधमनी की लंबाई के साथ वसा पर स्ट्रोक का उपयोग करना, वसा की आस्तीन के दाईं ओर ऐसा करते हैं ।
          6. महाधमनी जब दूर वसा फाड़ के साथ समझ जारी रखें । हो तो धीरे से महाधमनी को नुकसान रोकने के लिए सुनिश्चित करें ।
          7. धीरे से माइक्रोस्कोप की ओर ऊपर की तरफ महाधमनी खींचो ताकि वसा अब महाधमनी के पीछे तैनात है.
          8. वसा महाधमनी के बीच बंद कैंची ब्लेड डालें अवरोही महाधमनी के पूर्वकाल अंत के पास अंतरफलक, गंभीर है महाधमनी सतह के लिए वसा ऊतक लगाव कुंद से एक व्यापक गति का उपयोग करके ।
            नोट: महाधमनी गुहा के भीतर अभी भी है, जबकि अच्छी तरह से अतिरिक्त वसा और जोड़ने ऊतक हटाने की सिफारिश की है.
          9. उत् पाद को उदर महाधमनी transversely के caudal छोर पर दिल और काट लें । पूरी महाधमनी निकाल दें ।
          10. एक ३५ mm पकवान में महाधमनी प्लेस और दूर महाधमनी पर किसी भी अतिरिक्त वसा तंग २ २१ गेज सुई का उपयोग कर । १.७ एमएल microcentrifuge ट्यूब में एक्साइज महाधमनी को बर्फ पर लगाएं ।
    4. सिंगल सेल सस्पेंशन में महाधमनी का पृथक्करण
      1. महाधमनी युक्त ट्यूब को प्लास्टिक ०.२ एमएल महाधमनी पृथक्करण बफर है । ट्यूब के पतला अंत की ओर स्प्रिंग कैंची ब्लेड डालें और तेजी से एंजाइमी पाचन की सुविधा के लिए महाधमनी भरती ।
      2. ऊतक-समाधान मिश्रण एक 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब और पिपेट १.८ मिलीलीटर महाधमनी पृथक्करण बफर 2 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए स्थानांतरण ।
        नोट: ऊतक निलंबन के आसान हस्तांतरण के लिए, एक मानक १,००० µ एल पिपेट टिप के पतला अंत से 1 सेमी काट । निलंबन को micropipette के साथ स्थानांतरित करने के लिए छोटा टिप का उपयोग करें ।
      3. ५५ मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस, २२० rpm (०.५१४ x g) में मिलाते हुए महाधमनी पृथक्करण बफर में कीमा बनाया हुआ महाधमनी ।
      4. एक 15 मिलीलीटर के संग्रह ट्यूब में ५०-µm सेल छलनी के माध्यम से निलंबन पारित । फिल्टर की सुविधा के लिए एक सिरिंज सवार के रबर पिस्टन का प्रयोग करें ।
      5. 1 मिलीलीटर FACS बफर के साथ 15 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब कुल्ला, निलंबन इकट्ठा करने और सेल छलनी के माध्यम से पारित ।
      6. 1 मिलीलीटर FACS बफर के साथ ५० µm सेल छलनी दो अतिरिक्त बार धो लें ।
      7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं गोली । शीत FACS बफ़र में कक्ष पुन: निलंबित । किसी Burker कक्ष में कक्षों की गणना hemocytometer/
      8. या तो 1 x 106 स्थानांतरण (मूल प्रवाह cytometry के लिए) कोशिकाओं या पूरे सेल निलंबन (FACS के लिए) एक लेबल 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूबों के लिए । प्रवाह cytometry दाग प्रोटोकॉल के लिए खंड 2 के लिए जारी रखें ।

2. फ्लो Cytometry और FACS धुंधला

Fluorophore आर-Phycoerythrin (पीई) PE/Cyanine (Cy) 7 PE/Cyanine (Cy) 5 प्रशांत ब्लू (पंजाब)
लेजर (एनएम) नीला (४८८ एनएम)/पीला (561-570 एनएम)-ग्रीन (५३२ एनएम) नीला (४८८ एनएम)/पीला (561-570 एनएम)-ग्रीन (५३२ एनएम) नीला (४८८ एनएम)/पीला (561-570 एनएम)-ग्रीन (५३२ एनएम) बैंगनी (४०५ एनएम)
उत्तेजनामैक्स (एनएम) ४९६ ४९६ ४९६ ४०१
उत्सर्जनअधिकतम (एनएम) ५७८ ७८५ ६६७ ४५५
Phenotypic मार्कर F4/80 CD11c CD11b CD45
EMR1, Ly71 αX integrin, integrin αX चैन, CR4, p150, ITGAX αM integrin, मैक-1, Mo1, CR3, ४०, C3biR, ITGAM T200, एलसीए-५,
लक्षित कक्ष प्रकार टिशू निवासी मैक्रोफेज उत्कृष्ट रूप से सक्रिय (M1) मैक्रोफेज Monocytes/मैक्रोफेज ल्यूकोसाइट्स (मैक्रोफेज/monocytes, लिम्फोसाइटों, और granulocytes)
वृक्ष कक्षों का सबसेट वृक्ष कोशिकाओं, NK कोशिकाओं, सक्रिय टी कोशिकाओं, और आंतों intraepithelial लिम्फोसाइटों (IEL) का एक सबसेट Granulocytes, वृक्ष कक्ष, NK कक्ष, और T और B कक्षों के सबसेट
कमजोर पड़ने का कारक 1:50 1:100 1:100 1:100
Isotype नियंत्रण पे चूहा IgG2a PE/Cy7 अरमेनियाई हंसटर आईजीजी PE/Cy5 चूहा IgG2b प्रशांत नीला चूहा IgG2c

तालिका 2: fluorophore टैग की सूची में भेदभाव ऊतक निवासी मैक्रोफेज के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी ।

  1. लीजिए और निंनलिखित मदों की तैयारी: FACS बफर 5 मिलीलीटर दौर-नीचे polystyrene ट्यूबों, विरोधी माउस CD16/32 एफसी रिसेप्टर अवरुद्ध एंटीबॉडी, fluorophore संयुग्मित या unconjugated प्राथमिक एंटीबॉडी, fluorophore-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (यदि आवश्यक), 1x फास्फेट-खारा (पंजाब) बफर ।
    नोट: कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में दाग के लिए, एंटीबॉडी एकाग्रता के बजाय कोशिका संख्या सबसे महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, यदि दाग 10 x 106 कोशिकाओं धुंधला बफर मात्रा और एंटीबॉडी एकाग्रता के रूप में एक ही होना चाहिए अगर धुंधला १.० x 106 कोशिकाओं में १०० µ एल बफर मात्रा । धुंधला १.० x 108 कोशिकाओं के लिए, एंटीबॉडी राशि 5 गुना बढ़ाने की सिफारिश की है ।
  2. प्रत्येक FACS ट्यूब के लिए अतिरिक्त बर्फ ठंडा FACS बफर जोड़ें यदि आवश्यक हो तो, 5 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए ७५१ x g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली कोशिकाओं । महाप्राण supernatant निंनलिखित केंद्रापसारक ।
  3. विरोधी माउस CD16/CD32 एफसी रिसेप्टर निर्माता के निर्देशों के अनुसार सभी नमूनों के लिए एंटीबॉडी ब्लॉकिंग जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
  4. fluorophore-संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ें सीधे एफसी रिसेप्टर ब्लॉकिंग एंटीबॉडी-युक्त सेल निलंबन और 4 ° c के लिए 30 मिनट में गर्मी के नमूने के लिए । प्रकाश से नमूनों की रक्षा fluorophore-संयुग्मित एंटीबॉडी के ब्लीचिंग को कम करने के लिए ।
    1. प्राथमिक एंटीबॉडी unconjugated घटना में उपयोग किया गया था, चरण २.४ को पूरा करने के बाद इन चरणों का पालन करें ।
    2. 5 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए ७५१ x g पर केंद्रापसारक द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी दाग नमूने धो लें ।
    3. supernatant को हटाना और फिर से १०० µ एल FACS बफर में गोली सस्पेंड द्वारा निकालें ।
    4. सभी आवश्यक नमूनों के लिए संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन । २.५ चरण के लिए आगे बढ़ें ।
  5. एंटीबॉडी के बाद, बर्फ शीत FACS बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें 5 मिनट (4 डिग्री सेल्सियस) के लिए ७५१ x g पर तो गोली कोशिकाओं । खिचड़ी भाषा supernatant और गोली को परेशान नहीं यकीन है ।
  6. मिश्रण कोशिकाओं धीरे और फिर FACS बफर के 200-400 µ एल के साथ पुनः निलंबित, तो 4 ° c पर अंधेरे में इस रखने के मानक प्रवाह cytometry विश्लेषण या सेल छंटाई जब तक ।
  7. सना हुआ कोशिकाओं के अल्पावधि निर्धारण के लिए, २.८ के लिए कदम आगे बढ़ना २.१० । मानक प्रवाह cytometry के लिए निर्धारण का उपयोग करें ।
  8. तुरंत चरण २.५ के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस में 15-30 मिनट के लिए ०.५ मिलीलीटर 2-4% paraformaldehyde (पीएफए) में पुन: निलंबित कोशिकाओं ।
    नोट: सावधानी: पीएफए यलो और विषाक्त प्रभाव के साथ एक ज्ञात अड़चन है । जब पीएफए का उपयोग कर, चरम देखभाल के साथ संभाल । उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों और निकास वेंटिलेशन का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें ।
  9. निर्धारण के बाद, सभी नमूनों के लिए 2 मिलीलीटर FACS बफर जोड़कर कोशिकाओं को धोने और 5 मिनट के लिए 4 ° c में ७५१ x g पर केंद्रापसारक । निकालें supernatant निंनलिखित केंद्रापसारक ।
  10. बर्फ शीत FACS बफर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के २०० µ एल में फिक्स्ड कोशिकाओं reसस्पेंड । स्टोर फिक्स कोशिकाओं को 1 सप्ताह के लिए 4 ° c पर, आदर्श रूप में ४८ घंटे के भीतर प्रवाह cytometry अधिग्रहण करने के लिए autofluorescence ंयूनतम प्रदर्शन ।
  11. प्रवाह cytometer निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्लो cytometry डेटा प्राप्त करें या बासु एट अलद्वारा वर्णित के रूप में फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई प्रदर्शन. 23

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Representative Results

जब उपयोग apolipoprotein E आपुर्ति (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) चूहों पर बनाए रखा एक उच्च वसा उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार (HCHFD या HCD) 18 सप्ताह के लिए, 1 x 104 -2 x 104 CD45+F4/80+ महाधमनी मैक्रोफेज जब दो नमूने है अलग किया जा सकता है परित. HFHCD-खिलाया ApoE को चूहों से विच्छेदित जिगर, से अधिक उत्पादन 5 x 105 हल Kupffer कोशिकाओं (जो उपलब्ध छंटाई समय पर निर्भर करता है) । जब उच्च वसा आहार का उपयोग (HFD) तंग आ जंगली प्रकार (WT) C57BL/6 चूहों, 5 एक्स 105 करने के लिए 1 एक्स 106 निवासी वसा ऊतक मैक्रोफेज (एटीएम) stromal संवहनी अंश (SVF) से हल किया जा सकता है । मैक्रोफेज कि किसी दिए गए ऊतकों से हल किया जा सकता है की कुल संख्या मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) का उपयोग कर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रदर्शन के लिए पर्याप्त था । macrophage आबादी की कम संख्या के ऊतकों, जैसे महाधमनी के रूप में बरामद कर रहे हैं, जहां आरएनए अलग इन विश्लेषण के लिए आवश्यक है जब precipitants (उदाहरण के ग्लाइकोजन के लिए) और रात के समय का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है ।

यहाँ, आहार के प्रभाव-प्रेरित चयापचय विकारों macrophage phenotype पर बुनियादी प्रवाह cytometry का उपयोग कर, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS), और नीचे की ओर पोस्ट सॉर्ट विश्लेषण दिखाए जाते हैं. इन निष्कर्षों पुष्टि पहले प्रकाशित टिप्पणियों है कि चूहों एक HFD या HFHCD उत्कृष्ट (M1) महाधमनी (आंकड़ा 1b) के रूप में प्रभावित ऊतकों में मैक्रोफेज के बढ़ते घुसपैठ प्रदर्शन खिलाया । प्रवाह cytometry, FACS, और जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा का लाभ उठाते हुए (मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) के द्वारा, रॉन रिसेप्टर phenotype tyrosine के लिए हावी कळेनासे-व्यक्त CD45+ F4/80+ मैक्रोफेज से व्युत्पंन आहार खिलाया चूहों से पृथक ऊतकों मनाया गया । रॉन रिसेप्टर-व्यक्त महाधमनी मैक्रोफेज जो एक विरोधी भड़काऊ phenotype का प्रदर्शन किया HFHCD में कमी आई चूहों (चित्रा 1C और डी) । हल रॉन रिसेप्टर-पचा aortas से व्युत्पंन मैक्रोफेज व्यक्त arginase 1 (Arg1) जीन अभिव्यक्ति है, जो एक अच्छी तरह से स्थापित M2 macrophage मार्कर (चित्रा 1E) का प्रदर्शन किया । समर्थक भड़काऊ मैक्रोफेज जो CD45+ F4/80+ CD11c+ के रूप में विशेषता थे HFHCD-फेड चूहों (चित्रा 1b और डी) से अलग aortas में वृद्धि हुई । निस्र्पक जिगर-निवासी मैक्रोफेज आगे रॉन रिसेप्टर-एक्सप्रेस उपआबादी (चित्रा 2a) के प्रचलित phenotype का आविर्भाव । CD11c + समर्थक भड़काऊ macrophage आबादी जीन की कमी अभिव्यक्ति है कि दृढ़ता से एक विरोधी भड़काऊ (M2) phenotype जैसे Arg1 और रॉन (चित्रा बी) के साथ जुड़े रहे है का प्रदर्शन किया । इसी तरह की प्रवृत्तियों macrophage आबादियों में मनाया सफेद वसा ऊतक (चित्रा 3) से पृथक किया गया । एक समर्थक भड़काऊ हस्ताक्षर के साथ Macrophage जनसंख्या रॉन रिसेप्टर की कमी सतह अभिव्यक्ति दिखाया (चित्रा 3). दृष्टिकोण का मेल, बुनियादी प्रवाह cytometry और FACS, निर्णायक डेटा के परिणामस्वरूप है कि आगे वैकल्पिक (M2) मैक्रोफेज३२में सक्रियण के एक नियामक के रूप में रॉन रिसेप्टर पुष्टि । एक विरोधी भड़काऊ (M2) phenotype की ओर इस तरह के पूर्वाग्रह के विकास और मोटापा, atherosclerosis और steatohepatitis31के प्रगति में एक सुरक्षात्मक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्र 1: असंबद्ध महाधमनी से अलग मैक्रोफेज के लक्षण वर्णन ApoE KO चूहों से हटा 18 सप्ताह के लिए एक HCD पर बनाए रखा । (क) कोशिकाएँ सेलुलर मलबे को छोड़कर पहले CD45+ ल्यूकोसाइट्स पर gated थीं. (B) F4/80 के साथ संयोजन में CD45 धुंधला करने के लिए मैक्रोफेज किया जा करने के लिए डबल सकारात्मक आबादी माना चित्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । अतिरिक्त गेटिंग का प्रतिशत प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया गया था CD11c+CD45+f4/80+ (M1) और (C) रॉन+CD45+F4/80+ (संभावित M2) मैक्रोफेज में एक या तो पर खिलाया चूहों से प्राप्त aortas सामांय चाउ या उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार के लिए 18 सप्ताह । (घ) CD11c का प्रतिशत बढ़ा+CD45+f4/80+ (M1) मैक्रोफेज, साथ ही रॉन+CD45+f4/80+ (संभावित M2) के एक प्रतिशत कम मैक्रोफेज में मनाया गया aortas चूहों की तुलना में फेड HCD से व्युत्पंन एक सामांय चाउ आहार खिलाया । (ङ) हल रॉन+CD45+F4/80+ मैक्रोफेज के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण arginase मैं (एक प्रसिद्ध murine M2 मार्कर) की वृद्धि की अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया । मान है छात्र टी परीक्षण का उपयोग कर प्राप्त किया गया विश्लेषण सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग प्रदर्शन किया और के रूप में प्रतिनिधित्व ± SEM. p < ०.०५ सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था (* p < ०.०५, * * * p < ०.००१) । चित्रा को यू एट अल से संशोधित किया गया है । (२०१६) 31. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: Kupffer सेल के जीन प्रतिलिपि डाइजेस्ट ApoE KO चूहों से विच्छेदित जिगर से हल की आबादी 18 सप्ताह के लिए एक HCD पर बनाए रखा । (क) निस्र्पक और छँटाई Kupffer कोशिका आबादी के लिए सामान्य गेटिंग योजना. (ख) हल रॉन व्यक्त की जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण (रॉन+) और गैर व्यक्त (रॉन-) CD45+F4/80+ मैक्रोफेज मात्रा आरटी पीसीआर द्वारा । छात्र t-परीक्षण विश्लेषण सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर और मूल्यों का उपयोग किया गया के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे थे मतलब ± SEM. p < ०.०५ सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था (* p < ०.०५, * * * p < ०.००१) । चित्रा को यू एट अल से संशोधित किया गया है । (२०१६) 31 . कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: WT BL6 चूहों से विच्छेदित सफेद वसा ऊतक से पृथक एटीएम के लक्षण वर्णन 18 सप्ताह के लिए एक HFD खिलाया । (क) निस्र्पक और छंटाई के लिए जनरल गेटिंग योजना वसा ऊतक व्युत्पंन macrophage आबादी (ख) के भीतर रॉन + कोशिकाओं के प्रतिशत CD45+f4/80+CD11c- और CD45+f4/80+CD11c+ macrophage वाट से हल आबादी । चित्रा को यू एट अल से संशोधित किया गया है । (२०१६) 31 . कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

आहार प्रेरित चयापचय विकार मॉडल है कि atherosclerosis जैसे सह-रुग्णता नकल, सरल steatosis, steatohepatitis और प्रकार 2 मधुमेह बड़े पैमाने पर बेहतर रोग प्रगति के अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. Collagenase निर्भर पाचन अक्सर extracellular मैट्रिक्स (ECM)16,27से कोशिकाओं को मुक्त करने के लिए ऊतकों अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है । collagenase व्यवधान कोलेजन जैसे एंजाइमों जो पड़ोसी कोशिकाओं के लिए संरचनात्मक समर्थन प्रदान करता है । ' ऊतकों संरचनात्मक संरचना ऊतक मैट्रिक्स कठोरता (विरूपण के लिए प्रतिरोध) और जो कच्चे collagenase उत्पाद सबसे सफल ECM व्यवधान को सुनिश्चित करने में कुशल है हुक्म28। वाट, जो "नरम मैट्रिक्स" से बना है अक्सर adipocytes और निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को मुक्त करने के लिए Collagenase प्रकार द्वितीय के साथ पचता है, जबकि एक साथ सेल सतह इंसुलिन रिसेप्टर्स की अखंडता को बनाए रखने29. महाधमनी के फाइब्रिल घटकों के microarchitecture "कड़ा मैट्रिक्स" के लिए योगदान देता है, जिसके लिए प्रभावी महाधमनी पाचन collagenase प्रकार ग्यारहवीं के साथ (जो उच्चतम collagenase गतिविधि है) अतिरिक्त एंजाइमों के साथ संयोजन में प्रयोग किया जाता है. महाधमनी के विपरीत, जिगर पाचन एक कमजोर एंजाइमी गतिविधि के साथ एक collagenase का उपयोग करता है, collagenase प्रकार IV, मैट्रिक्स और मुक्त व्यवहार्य parenchymal और गैर parenchymal कोशिकाओं को बाधित करने के लिए30। लंबे समय तक सूजन ऊतक आहार से व्युत्पंन-खिलाया जंगली प्रकार या apolipoprotein ई की कमी (ApoE KO) चूहों एक C57BL6 पृष्ठभूमि पर अक्सर remodeling है कि उचित एंजाइमी पाचन को रोका जा सकता से गुजरना । इस खंड को कम करने और/या अनुचित ऊतक पृथक्करण और कम सेल वसूली की संभावना को खत्म करने के लिए रणनीतियों पर चर्चा करेंगे ।

आहार से व्युत्पंन ऊतकों की एक आम सुविधा खिलाया माउस मॉडल है कि मोटापे की नकल, atherosclerosis, और/या गैर शराबी फैटी लीवर रोग, असामांय ऊतक remodeling है । सफेद वसा ऊतक में, महाधमनी, और जिगर, ECM संरचना बदल गया है, अक्सर ऐसे कोलेजन के रूप में fibrillar घटकों के अत्यधिक जमाव में जिसके परिणामस्वरूप । जंगली प्रकार C57BL6 चूहों अठारह सप्ताह के लिए एक उच्च वसा वाले आहार पर बनाए रखा, ऊतक विशिष्ट असामान्यताओं जैसे विस्तारित सफेद वसा ऊतक और बढ़े हुए फैटी लीवर (सरल steatosis) के रूप में अनुभव. अक्सर बार इन चयापचय सुविधाओं परेशानी बाधा नहीं ऊतक पृथक्करण प्रक्रिया के दौरान काबू पाने के लिए कर रहे हैं । दूसरी ओर, अन्य आहार में मॉडल है कि दर्पण अधिक गहरा phenotypes, ऊतक पाचन के दौरान एक समस्या पैदा कर सकता है ऊतक के व्यापक remodeling प्रेरित । HFHCD फेड ApoE KO चूहों अक्सर मॉडल atherosclerosis और steatohepatitis के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । उन्नत steatohepatitis के साथ जुड़े एक आम सुविधा जिगर (या फाइब्रोसिस) में ECM के अत्यधिक जमाव है । Fibrotic जिगर एंजाइमी ऊतक पृथक्करण के दौरान काफी समस्याग्रस्त होना दिखाया गया है और अक्सर कम सेल उपज31पैदा करता है । कोशिका प्राप्ति में सुधार करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि पाचन प्रोटोकॉल विचलन के बिना पालन किया जाना है । हालांकि सामान्य जिगर और कीमा बनाया जा सकता पृथक्करण प्राप्त करने के लिए पाचन बफर में जलमग्न, पाचन बफर के साथ छिड़काव जिगर और collagenase समाधान के extracellular मैट्रिक्स के बीच संपर्क को अधिकतम; और इसलिए इस दृष्टिकोण अत्यधिक की सिफारिश की है । साथ ही, पाचन बफर की 20-30 मिलीलीटर अक्सर सामान्य जिगर के सफल पृथक्करण के लिए एक पर्याप्त मात्रा है; हालांकि, में माउस मॉडल है कि विकसित और/या fibrotic जिगर का संबंध है, पाचन बफर के ५० मिलीलीटर के साथ छिड़काव के लिए उचित पाचन सुनिश्चित करने के लिए पसंद किया जाता है जबकि सेल मौत को कम करने । वजन है कि काफी १.५ ग्राम से अधिक के साथ जिगर के लिए, पाचन बफर की मात्रा बढ़ाने के सफल पाचन की गारंटी के लिए सिफारिश की है ।

ऊतक समस्या संभावित कारण समाधान
सफेद वसा ऊतक (वाट) गरीब सेल पृथक्करण गरीब पाचन सुनिश्चित करें कि पाचन बफर ३७ डिग्री सेल्सियस पर है
सेल मौत अत्यधिक collagenase पाचन पाचन के समय को कम
पाचन बफर की मात्रा कम
महाधमनी गरीब सेल पृथक्करण गरीब पाचन सुनिश्चित करें कि पाचन बफर ३७ डिग्री सेल्सियस पर है
पाचन बफर में महाधमनी टुकड़े बहुत बड़े थे सुनिश्चित करें कि महाधमनी लगभग 1 मिमी टुकड़ों में काट रहा है
महाधमनी टुकड़े मशीन के दौरान पृथक्करण बफर में नहीं मिलाते थे सुनिश्चित करें कि महाधमनी टुकड़े पाचन समाधान में मिलाते है
सेल मौत अत्यधिक collagenase पाचन पाचन के समय को कम
पाचन बफर की मात्रा कम
जिगर गरीब सेल पृथक्करण गरीब पाचन सुनिश्चित करें कि पाचन बफर ३७ डिग्री सेल्सियस पर है
पाचन बफर की मात्रा बढ़ाएं
IVC के अनुचित cannulation (IVC आसपास ऊतक की सूजन होती है) सुनिश्चित करें कि सुई ठीक से IVC में डाला जाता है
टूटना IVC छिड़काव करने से पहले IVC में ठीक से सुरक्षित सुई
छिड़काव गति को कम
उठी ऊतक छिड़काव गति को कम
सेल मौत Glisson के कैप् सूल से कोशिकाओं की अनुचित रिहाई पहले चर्चा पथपाकर विधि का उपयोग कैप्सूल से कोशिकाओं अलग करने के लिए सुनिश्चित करें
अत्यधिक collagenase पाचन पाचन के समय को कम
पाचन बफर की मात्रा कम

तालिका 3: असफल ऊतक पृथक्करण समस्या निवारण । प्रवाह cytometry आधारित कोशिका छंटाई या FACS कोशिका आबादी को अलग करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है जहां उच्च शुद्धता एक आवश्यकता है । जब सेल छँटाई द्वारा कोशिकाओं को शुद्ध, उच्च कोशिका उपज को प्राप्त करने लेकिन यह भी एक उच्च शुद्धता सॉर्ट उचित छंटाई रणनीतियों का उपयोग करने की आवश्यकता है । इस अनुभाग में, मल्टी-fluorophore फ्लो cytometry-आधारित कोशिका में सुधार करने के लिए विधियाँ, आहार खिलाया चूहों से व्युत्पंन macrophage ऊतक निवासी की छंटाई वर्णित हैं । अलग ऊतक निवासी macrophage अलगाव के लिए, सतह मार्कर चयन एक महत्वपूर्ण कदम है । मैक्रोफेज वाट, महाधमनी, और जिगर से व्युत्पंन अक्सर एक CD45+, CD11b+, F4/गेटिंग रणनीति का उपयोग कर प्रतिष्ठित हैं । अतिरिक्त प्रवाह cytometric पैनलों ऊतक निवासी मैक्रोफेज की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन पैनलों में एंटीबॉडी शामिल है जो macrophage विशिष्ट नच की सतह अभिव्यक्ति के लिए जांच (CD64, CD68, और CD14), प्रमुख histocompatibility परिसरों (MHCII) और अपोप्तोटिक सेल tyrosine कळेनासे रिसेप्टर्स (MerTK)३२, ३३. विशिष्ट macrophage phenotype फिर M2 (CD163, CD209, और CD206) या M1 मार्करों (CD38, CD40, CD80, और CD86) के चयनात्मक सतह अभिव्यक्ति के लिए जांच के द्वारा delineated जा सकता है३४,३५। लिपिड लादेन मैक्रोफेज द्वारा उत्पंन ऑटो प्रतिदीप्ति कुछ मुद्दों जब गेटिंग आबादी मौजूद कर सकते हैं । fluorochromes कि पीले-हरे रंग की लेजर (जैसे पीई, पीई/Cy5, पीई/Cy7) या लाल लेजर (जैसे apc, apc Cy7 के रूप में) परिणाम उत्सर्जित प्रतिदीप्ति कि काफी उज्ज्वल है से उत्साहित है के साथ टैग की गईं एंटीबॉडी का उपयोग करना ऑटो प्रतिदीप्ति और इस तरह सुधार कर सकते है परिणाम३६। जब इस तरह के उच्च धुंधला सूचकांक और संभावित उत्सर्जन स्पेक्ट्रा ओवरलैप के साथ fluorophore conjugates का चयन, उचित नियंत्रण का समावेश महत्वपूर्ण है । जब गेटिंग सीमाओं की पहचान, एक दाग (एसएस) नियंत्रण और isotype नियंत्रण के शामिल किए जाने की अनुमति के लिए सकारात्मक/नकारात्मक आबादी के विरेखांकन और गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि प्राथमिक एंटीबॉडी के कारण संकेत की माप, क्रमशः ३७. उन परिस्थितियों के लिए जहां कक्ष दुर्लभ हैं, हम एसएस और isotype नियंत्रणों के लिए क्षतिपूर्ति कणों का उपयोग करने की सलाह देते हैं । मुआवजा कणों आमतौर पर जैविक नियंत्रण की तुलना में उज्जवल संकेतों का उत्सर्जन और भी पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में कम विचरण किया है । साथ ही, प्रतिदीप्ति ऋण एक (एफएमओ) नियंत्रण delineating गेटिंग सीमाओं के लिए आदर्श होते हैं । एफएमओ नियंत्रण शामिल करके, एक धुंधला सबसेट के लिए अपेक्षित अधिकतम प्रतिदीप्ति किसी दिए गए चैनल में प्रकट होता है जब fluorochrome-टैग की गई एंटीबॉडी विशिष्ट प्रतिदीप्ति चैनल के लिए विशेष रूप से३८बाहर रखा गया है । हमारे अनुभव में, एकल दाग मुआवजा कण नियंत्रण के अलावा, एक दाग जैविक तुलना नियंत्रण और अधिक सटीक सकारात्मक/नकारात्मक सीमाओं की स्थापना के लिए शामिल किया जाना चाहिए ।

गेटिंग रणनीति में सेलुलर मलबे और सेल समुच्चय को छोड़कर भी ऑटो प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए इस्तेमाल एक अतिरिक्त दृष्टिकोण है । व्यवहार्य कोशिका आबादी से सेलुलर मलबे भेद करने के लिए, आगे तितर बितर (FSC) और साइड कैटर (एसएससी) का उपयोग सबसे आम गेटिंग रणनीति है । अलग कोशिकाओं है कि पोस्ट प्रकार के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा और डीएनए/आरएनए निकालने के लिए उच्च व्यवहार्यता की आवश्यकता होती है के लिए, यह सिफारिश की है कि व्यवहार्यता दाग किसी भी निर्धारण और/या permeabilization प्रक्रियाओं के साथ नहीं किया जा सकता है । Formaldehyde कोशिकाओं के फिक्सिंग न्यूक्लिक एसिड प्रोटीन crosslinking के कारण न्यूक्लिक एसिड अखंडता समझौता कर सकते हैं और इस तरह अलगाव दक्षता, पता लगाने, और सटीक ठहराव सीमा । पहले उल्लेख के रूप में सेल समुच्चय केवल उत्सर्जित ऑटो फ्लोरोसेंट संकेतों के लिए योगदान नहीं कर सकते, लेकिन यह भी "संयोग निरस्त" में परिणाम । इस तरह की कार्रवाई एक तरह से उच्च शुद्धता बनाए रखने के लिए होता है, लेकिन अगर बहुत लगातार, यह हल सेल उपज कम कर देता है । सेल धुंधलान के दौरान DNAse और MgCl2 के साथ पूरक बफ़र (FACS बफ़र) को कक्ष एग्रीगेट को कम कर सकते हैं । यह DNAse के साथ संयोजन में EDTA का उपयोग नहीं के रूप में यह एंजाइम गतिविधि रोकता सिफारिश की है । छंटाई से पहले एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से एक सेल निलंबन छानने भी समुच्चय से कोशिकाओं को मुक्त कर सकते हैं । यह ध्यान रखें कि एकत्रीकरण को कम करने के लिए आवश्यक है, सेल निलंबन ०.४ मिलीलीटर की न्यूनतम मात्रा में प्रति मिलीलीटर ५,०००,००० कोशिकाओं की एकाग्रता पर होना चाहिए । लिपिड लादेन ऊतकों से अलग कोशिकाओं के एकत्रीकरण के लिए और अधिक प्रवण हो जाते हैं और यह संयोग निरस्त और कम तरह उपज में परिणाम कर सकते हैं । यह सिफारिश की है कि नमूने आगे यदि एकत्रीकरण बनी हुई है पतला । क्रमबद्ध मैक्रोफेज सेल वसूली को अधिकतम करने के लिए भ्रूण गोजातीय अमीर माध्यम से युक्त गोल नीचे संग्रह ट्यूबों में एकत्र किया जा सकता है । एक प्रारंभिक उच्च FBS एकाग्रता सेल वसूली सुनिश्चित करता है के बाद से एकाग्रता अंततः प्रत्येक हल छोटी बूंद के साथ पतला हो जाता है । डीएनए या आरएनए विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, कोशिकाओं RNAse संदूषण को रोकने के लिए उचित निष्कर्षण एजेंट (उदा. TriZol) में सीधे हल किया जा सकता है । जब उच्च मात्रा छंटाई, FBS की कम सांद्रता के साथ पूरक संस्कृति मीडिया में पहले कोशिकाओं छंटाई, की सिफारिश की है । तुरंत छंटाई के बाद, कोशिकाओं को फिर गोली और डीएनए के लिए लीजड/ अलग आनुवंशिक सामग्री तो बदल जीन अभिव्यक्ति के लिए फाइल किया जा सकता है । TNFα, IL1-β, आईएल-6, आईएल-12, 1L-23, IFNγ, Nos2, और MCP1 (CCL2) सहित समर्थक भड़काऊ जीन अक्सर एक क्लासिकल (M1) मैक्रोफेज३९सक्रिय प्रदर्शन phenotype में विनियमित रहे हैं । दूसरी ओर, वैकल्पिक रूप से सक्रिय (M2) phenotype मैक्रोफेज में अक्सर जीन एंकोडिंग Chi3l3 (Ym1), Fizz1, Arginase 1, CD206, CD163, CD209 1L-10, और TGFβ३४,४०के प्रेरण द्वारा चिह्नित है । हाल ही में, CD38, Fpr2 और Gpr18 को M1-विशिष्ट जीन और सी-Myc और Egr2 के रूप में M2-विशिष्ट जीन३४के रूप में मांय किया गया है ।

हालांकि बहु रंग प्रवाह cytometry-आधारित कोशिका छंटाई उच्च शुद्धता पर मैक्रोफेज अलग करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, इस दृष्टिकोण महंगा हो सकता है । FACS मध्यस्थ छंटाई के शक्तिशाली लाभ संचालन कर्मियों कि सेल सॉर्टर रखरखाव रिएजेंट की उच्च लागत के अलावा एक सेल सॉर्टर पैंतरेबाज़ी कर सकते है पर निर्भर हैं । वैकल्पिक दृष्टिकोण महंगा प्रवाह cytometry आधारित सेल छंटाई के विकल्प में इस्तेमाल किया जा सकता है । वे चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस) या घनत्व ढाल केंद्रापसारक शामिल हैं । पहली वैकल्पिक कक्ष छंटाई विधि उल्लेख चुंबकीय और/या microbead स्तंभ अलगाव किट के लिए अलग से ब्याज की कोशिकाओं को रक्त या ठोस ऊतकों४१। दूसरी कोशिका छंटाई दृष्टिकोण एक विषम कोशिका घनत्व और केंद्रापसारक के बल पर आधारित निलंबन अलग । दुर्भाग्य से, घनत्व मध्यस्थता केंद्रापसारक महाधमनी से मैक्रोफेज अलग करने के लिए व्यावहारिक नहीं है-या वाट-व्युत्पंन एकल सेल निलंबन । अक्सर, उत्पाद विभेदक केंद्रापसारक से प्राप्त दूषित है, और कम उपज की । नतीजतन, छोटे ऊतकों (जैसे महाधमनी या वाट के रूप में) है कि कुछ कोशिकाओं में परिणाम एंजाइमी पाचन के बाद शुरू में अंतर केंद्रापसारक के लिए आदर्श उंमीदवार नहीं हैं । दूसरी ओर, असंबद्ध जिगर से व्युत्पंन सेल निलंबन हल मैक्रोफेज की एक पर्याप्त संख्या है कि पोस्ट तरह के प्रयोगों और संस्कृति उत्तेजना, qPCR, या पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण के रूप में विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता का उत्पादन कर सकते हैं । इन वैकल्पिक दृष्टिकोण भी आबादी FACS से पहले समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, क्लीनर तरह के लिए अनुमति दी । नोट की, ऊतक निवासी मैक्रोफेज वाट, जिगर और महाधमनी में पूरे सेल जनसंख्या का एक छोटा सा प्रतिशत बना । FACS छंटाई से पहले कोशिकाओं के संवर्धन एक दृष्टिकोण है जब सेल की आबादी है कि कम अक्सर अलग इस्तेमाल किया गया है । एक मुद्दा है कि छोटी आबादी को अलग करने में आम है कि बड़े सेल नंबर बाद विश्लेषण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए संसाधित किया जाना चाहिए है । संवर्धन या पूर्व छंटाई इस तरह के एक मुद्दे को हल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस विधि सकारात्मक और नकारात्मक चयन के माध्यम से कोशिकाओं की एक अधिक संक्षिप्त जनसंख्या प्राप्त करने में एड्स लेकिन यह भी FACS छंटाई के रूप में समय के संरक्षण की अनुमति देता है जिगर जैसे घने ऊतक स्रोतों के लिए एक स्थाई प्रक्रिया हो सकती है ।

सूजन जीवविज्ञान में हाल के अग्रिमों phenotypic और macrophage विविधता के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के महत्व पर प्रकाश डाला जीर्ण सूजन को विनियमित करने में इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं के जटिल भूमिका की समझ । संक्षेप में, यह व्यापक प्रोटोकॉल तीन बानगी स्थापित आहार में अध्ययन किया ऊतकों से निस्र्पक ऊतक निवासी मैक्रोफेज के लिए एक बहु आयामी दृष्टिकोण प्रदान करता है मोटापा और सूजन मॉडल । इससे भी महत्वपूर्ण बात यह प्रोटोकॉल खाते में कठिनाई और ऐसे वाट, महाधमनी सजीले टुकड़े और फैटी लीवर के रूप में dysregulated सूजन ऊतकों से साफ एकल सेल निलंबन को अलग करने के लिए आवश्यक उपाय लेता है । प्रोटोकॉल शोधकर्ता प्रवाह cytometry लागू करने के लिए और एक अभिनव आयाम में उपकरण छँटाई FACS ऊतक निवासी मैक्रोफेज, मोटापे में सूजन के प्रमुख नियामकों की विशेषता के लिए अनुमति देता है. में गहराई से macrophage जनसंख्या गतिशीलता के लक्षण वर्णन सूजन ऊतकों में monocyte तस्करी में अंतर्दृष्टि प्रदान करते है और हल मैक्रोफेज पर प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के एक भीड़ के माध्यम से जारी यंत्रवत मूल्यांकन के लिए अनुमति दे सकते हैं । macrophage आबादी के आगे लक्षण वर्णन जैविक आधार है कि स्वास्थ्य और रोग में macrophage विविधता विनियमन में एक निर्णायक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई विरोध प्रकट नहीं है.

Acknowledgments

हम पेंसिल्वेनिया राज्य विश्वविद्यालय मिलेनियम विज्ञान परिसर में प्रवाह Cytometry कोर सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 G x 5/8 in Needles BD 305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1 mL syringe with rubber stops BD 309659
10 mL Syringes BD 309604
1 mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 μm cell strainers Corning, Inc. 352350
1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500 mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 μm Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

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इम्यूनोलॉजी अंक १२२ मोटापा आहार-प्रेरित सूजन मैक्रोफेज एंजाइमी ऊतक पाचन सेल छँटाई एकल कोशिका निलंबन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी FACS जिगर छिड़काव महाधमनी पाचन वसा ऊतक पाचन
अलगाव, लक्षण वर्णन, और मोटापे से संबंधित सूजन से प्रभावित ऊतकों से मैक्रोफेज की शुद्धि
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Allen, J. N., Dey, A., Nissly, R.,… More

Allen, J. N., Dey, A., Nissly, R., Fraser, J., Yu, S., Balandaram, G., Peters, J. M., Hankey-Giblin, P. A. Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation. J. Vis. Exp. (122), e55445, doi:10.3791/55445 (2017).

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