Summary
Här beskriver vi ett protokoll för extraktion av metaboliter från Staphylococcus aureus och deras efterföljande analys via vätskekromatografi och masspektrometri.
Abstract
I ett försök att omintetgöra bakteriella patogener, värdar begränsar ofta tillgången på näringsämnen på platsen för infektionen. Denna begränsning kan ändra bestånd av viktiga metaboliter som regulatoriska faktorer svarar, justera cellulär metabolism. Under de senaste åren har ett antal proteiner och RNA framträtt som viktiga regulatorer av virulens genuttryck. Till exempel, svarar Cody proteinet till nivåer av grenkedjiga aminosyror och GTP och är allmänt konserverad i lågt G + C grampositiva bakterier. Som en global regulator i Staphylococcus aureus, styr Cody uttrycket av dussintals virulens och metaboliska gener. Vår hypotes är att S. aureus använder Cody, delvis för att ändra dess metaboliska tillstånd i ett försök att anpassa sig till näringsbegränsande förhållanden potentiellt förekommer i värdmiljön. Detta manuskript beskriver en metod för att extrahera och analysera metaboliter från S. aureus med användning av vätskekromatografi kopplat med masspektrometry, ett protokoll som utvecklats för att testa denna hypotes. Metoden belyser också bästa sätt som säkerställer noggrannhet och reproducerbarhet, såsom bibehållande biologisk stationärt tillstånd och konstant luftning utan användning av kontinuerliga kemostat kulturer. Relativt de USA200 meticillinkänsliga S. aureus isolat UAMS-1 föräldrastammen, uppvisade den isogena Cody mutanten signifikanta ökningar i aminosyror härledda från aspartat (t.ex. treonin och isoleucin) och minskar i deras prekursorer (t ex aspartat och O acetylhomoserin ). Dessa fynd korrelerar väl med transkriptionella data erhållna med RNA-seq analys: gener i dessa vägar uppreglerades mellan 10- och 800-faldigt i Cody null mutant. Koppling globala analyser av transkriptom och metabolomet kan avslöja hur bakterier förändrar deras metabolism när man står inför miljö- eller närings stress, ger potential inblick i Physiological förändringar i samband med näringsämnen utarmning upplevt under infektion. Sådana upptäckter kan bana väg för utveckling av nya medel mot infektioner och läkemedel.
Introduction
Bakteriella patogener måste brottas med många utmaningar inom värdmiljön. Förutom direkt attack av immunceller, värden sequesters också näringsämnen som är nödvändiga för bakteriell överlevnad och replikering, generera närings immunitet 1, 2. För att överleva dessa fientliga miljöer, bakteriella patogener distribuera virulensfaktorer. Några av dessa faktorer gör det möjligt för bakterierna att undgå immunsvaret; Andra faktorer inkluderar utsöndrade matsmältningsenzymer, såsom hyaluronidas, thermonuclease, och lipas, som kan göra det möjligt för bakterierna att fylla saknade näringsämnen genom att konsumera vävnadshärledda beståndsdelar 3, 4, 5. I själva verket har bakterier utvecklats regelsystem som binder den fysiologiska tillståndet hos cellen till produktionen av virulensfaktorer 6, 7,
En växande mängd bevis pekar på Cody som en kritisk regulator som förbinder metabolism och virulens. Även upptäcktes först i Bacillus subtilis som en repressor av dipeptiden permeaset (dpp) -genen 11, är Cody nu känt för att produceras av nästan alla de låga G + C grampositiva bakterier 12, 13 och reglerar tiotals gener involverade i kol och kvävemetabolism 14, 15, 16, 17, 18, 19. I patogena arter, Cody kontrollerar även expressionen av några av de viktigaste virulensgener 20, 21,. ef "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody aktiveras som ett DNA-bindande protein av två klasser av ligander: grenkedjiga aminosyror (BCAA, isoleucin, leucin, och valin [ILV]) och GTP . När dessa näringsämnen är riklig, rycker Cody (eller i vissa fall, stimulerar) transkription. Eftersom dessa näringsämnen bli begränsade, är Cody aktivitet gradvis minskas, vilket resulterar i en graderad transkriptionell svar som re-rutter prekursorer genom olika metaboliska vägar som är anslutna till centrala metabolism 28, 29, 30.
Tandem vätskekromatografi kopplad till masspektrometri (LC-MS) är en kraftfull teknik som exakt kan identifiera och kvantifiera småmolekylära intracellulära metaboliter 31. När ihopkopplad med transcriptome analys (t ex RNA-Seq), denna analytiska arbetsflöde kan ge insikt i de fysiologiska förändringar som sker som svar på miljö eller näringsstress. Här presenterar vi en metod för metabolit extraktion från Staphylococcus aureus-celler och efterföljande analys via LC-MS. Denna metod har använts för att demonstrera pleiotropa effekterna av Cody på S. aureus fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av buffertlösningar
- Förbereda fosfatbuffrad saltlösning (PBS; pH 7,4) genom att späda en förrådslösning av 10x PBS till en slutlig koncentration av 1 x med ultrarent (destillerad och avjoniserat) vatten.
- Bereda härdningslösning genom att kombinera 2 ml acetonitril, 2 ml metanol, 1 ml ultrarent H2O, och 19 | il (0,1 mM slutlig koncentration) myrsyra.
- Förbereda LC-MS lösningsmedel A genom tillsats av myrsyra (0,2% [v / v] slutlig koncentration) till ultrarent vatten.
- Förbereda LC-MS lösningsmedel B genom tillsats av myrsyra (0,2% [v / v] slutlig koncentration) till acetonitril.
NOTERA: Alla lösningar bör framställas med användning de högsta renhet reagens finns (allmänt HPLC grade). Lösningar bör beredas på nytt före varje experiment och lagras på is före användning.
2. Upprättande av Steady-state S. aureus Tillväxt
- Streak S. aureus-stammar av intresse för isolering på tryptisk sojaagar (TSA) från en fryst glycerolstam. Inkubera vid 37 ° C under 16-24 h.
- Ympa 4 ml tryptisk sojabuljong (TSB) eller ett annat lämpligt medium i sterila glas inkubationsrören med enstaka kolonier av varje stam. Inkubera lutande (~ 70 ° vinkel) med rotation vid 60 varv per minut (rpm) vid 37 ° C under 16-20 h.
OBS: Över natten odlingar är benägna att syre gradienter vid användning av standardmetoder, inklusive de som beskrivs i steg 2,2, som påverkar cellulär fysiologi. Således använder vi en multipel back-utspädning strategi för att säkerställa biologisk stationärt tillstånd (se steg 2,4-3,2, nedan). - Använda en spektrofotometer för att mäta den optiska densiteten hos kulturerna från steg 2,2 vid 600 nm (OD 600). Använda sterilt medium som en optisk referens (blank). Späd dessa celler till en OD 600 av 0,05 i 50 ml sterilt TSB-medium (förvärmd till 37 ° C) i separata, 250 mL DeLong-kolvar.
- Incubate kulturerna vid 37 ° C i ett vattenbad med skakning vid 280 rpm.
- Varje 30 min, ta OD 600 mätningar; som de optiska densitet ökar, kan det bli nödvändigt att späda kulturerna med TSB så att de förblir inom det linjära absorbans spektrofotometerns.
- När kulturer från steg 2,5 uppnå en OD 600 av ~ 0,8-1,0, subkultur dem i 50 ml 37 ° C TSB till ett OD 600 av 0,01-0,05 och upprepa steg 2,4 och 2,5.
3. Prov Collection Setup
- Förbereda en bädd av krossad torris i ett lämpligt kärl (t.ex., glasskål, ishink, eller kallare).
- Som de optiska densiteterna hos odlingarna närma sig det önskade skörden punkt, tillsätt 1 ml av släckning lösningen till en 35 mm obehandlad petriskål och pre-kyler på torris under ≥5 min.
OBS! "Önskade skörden punkt" kommer att variera beroende på experimentella mål. Till exempel, om man skulle undersöka metabolites under aerob tillväxt, nyckelindikatorer för detta tillstånd innefattar acetat utsöndring och åter assimilering av acetatet under efter exponentiella tillväxtfasen 32, 33. Allmänhet, bör denna punkt ligga inom ett specifikt tillväxtstadium (t ex exponentiell fas). De specifika OD 600 värden associerade med detta steg kan variera mellan olika bakteriestammar och tillväxtmedier. - Placera ett filter av rostfritt stål fritta (i förväg kyld till -20 ° C) i en gummipropp och placera den på toppen av en vakuumkolv ansluten till ett hus vakuum eller vakuumpump.
- Applicera vakuumet och placera en blandad cellulosaestermembran (0,22 fim porstorlek) ovanpå.
OBS: Det är viktigt att använda ett filter med en diameter lika stor som frittan och att korrekt centrera det här filtret för att säkerställa att provet dras genom filtret snarare än över kanten. Vätning av membranet med iskall, steril H 2 O kan hjälpamed positionering av membranet.
4. Provskörd
- Vid en OD 600 av ~ 0,4-0,5, använd en serologisk pipett för att avlägsna 13 ml av kulturen från kolven och att applicera provet till filtret.
- Efter det att hela provet har filtrerats, omedelbart tvätta filtret med ≥5 ml iskall PBS för att tvätta bort medel associerade metaboliter.
- Koppla bort vakuumet och använda ett par av sterila pincetter för att avlägsna filtret från frittan. Invertera filtret (cellsidan nedåt) i den för-kylda släckningslösning.
OBS: Det är viktigt att utföra stegen ovan snabbt (dvs inom sekunder) och så snart som vätskan har tagits bort för att säkerställa en snabb avkylning av cellerna, arresting metabolisk aktivitet. - Inkubera filtret i snabbkylningslösning på torr is under ≥20 min.
- Med användning av sterila pincetter, invertera filtret (cellsidan uppåt) i petriskålen och använda en mikropipett för att skölja cellerna bort av than membranet in i snabbkylningslösningen.
- Re-suspenderades cellerna i släckningslösningen och sedan överföra cellsuspensionen till en steril 2 ml slagtålig rör innehållande ~ 100 mikroliter av 0,1 mm kiseldioxidpärlor. Lagra denna på torr is eller vid -80 ° C.
5. Metabolit Extraktion
- Tö prover på våt is och sönderdela cellerna i en homogenisator med fyra 30 s skurar vid 6000 varv per minut, med 2 min kylning perioder på torris mellan cyklerna.
- Klargöra lysaten för 15 min i en i förväg kyld, kyld mikrocentrifug vid maximal hastighet (dvs 18.213 xg vid ≤4 ° C).
- Överför supernatanten till ett rent mikrocentrifugrör.
- Med användning av en mikropipett, överföra en liten del av provet till ett mikrocentrifugrör för kvantifiering av kvarvarande peptidhalt i steg 6; lagra resten vid -80 ° C.
OBS: Den volym av reserverade prov varierar, beroende på den BCA-analys som används i steg 6,1. DettaProvet bör lagras på våt is för omedelbar analys eller frystes vid -80 ° C.
6. bicinkoninsyra (BCA) Analys
- Utföra en BCA-analys såsom rekommenderas av kit tillverkaren, med användning av prover från steg 5,4 för att bestämma den återstående peptidkoncentrationen för varje prov.
7. LC-MS
- Blanda 75 | il av S. aureus-extrakt med 75 mikroliter av LC-MS lösningsmedel B, som framställts i steg 1,4.
- Vortex att blanda och centrifugera vid 13.000 xg under 5 minuter.
- Placera 100 | il av supernatanten i en vätskekromatografi (LC) ampull och frysa det. Se till att inga luftbubblor fastnar i provet.
- Ladda LC flaskorna på LC-MS autosampler och redigera löpande lista i programmet "Offline Worklist Editor."
- Fylla i "Provnamn" (t ex vildtyp-1), "Prov Position" (t ex P1-A1), "Method" (t.ex., Myrsyra Acid-Negativ-metoden), och "datafil" (t.ex. vildtyp-1) kolumner. Klicka på knappen "Save Worklist" -knappen. Öppna programmet "Mass Spectrometry Data Acquisition Workstation" och mata in tidigare sparade arbetslista. Klicka på "Start Worklist Run" för att starta den kontinuerliga LC-MS mätning.
- Separera proverna på en kolonn, länk kolumnen till en flygtid (TOF) spektrometer, och paret TOF-spektrometer med LC-systemet. Använda en mobil fas gradient enligt följande: 0-2 min, 85% lösningsmedel B; 3-5 min, 80% lösningsmedel B; 6-7 min, 75% lösningsmedel B; 8-9 min, 70% lösningsmedel B; 10-11,1 min, 50% lösningsmedel B; 11,1-14 min, 20% lösningsmedel B; och 14,1 till 24 min, 5% lösningsmedel B; avslutas med en 10 min re-jämviktsperiod vid 85% lösningsmedel B och en flödeshastighet av 0,4 ml min -1.
- Med användning av en isokratisk pump, infundera en referensmassa lösning med körningen för att möjliggöra samtidig kalibrering mass axel.
OBS: Detta stegär baserad på standard TOF-spektrometer manual.- Använd blandning av ättiksyra D4 och hexakis (1H, 1H, 3H-tetrafluorpropoxi) phosphazine som referensmasslösning för att utföra realtidskalibrering. Använda isokratisk pump med flödeshastigheten för 2,5 ml min -1 för infusionen.
8. Sats Korrigering av Ion Counts
- Beteckna varje prov för att tjäna som ett referensprov för kull korrigering (t ex vildtyp, replikera 1).
- Beräkna summan av de jon räknas för alla metaboliter inom referensprovet. Upprepa denna beräkning för alla prover.
- Dela upp den totala jon räknar av varje prov med det totala jon räknevärdet hos referensprovet för att generera ett förhållande.
- Dela upp jon räkning för varje metabolit i ett prov av provet / referens förhållande för att erhålla en batch-korrigerad jon räkning för varje metabolit.
9. Peptid Normalisering
- Divide satskorrigerade jon räknevärden för varje prov som erhållits i steg 8 av peptidkoncentrationen bestämdes med BCA-analys i steg 6 för att ge ett normaliserat värde för varje metabolit.
OBS: De normaliserade, batch-batch korrigerad ion räknas för varje metabolit som erhållits i steg 9,1 kan jämföras direkt mellan stammar och utsattes för statistisk analys (t ex en Mann-Whitney U-test). Alternativt till en metabolit känd att vara oförändrade, antingen genom behandling eller genetisk bakgrund, kan användas som en normaliserare för att detektera förändringar på grund av metabolit sönderdelning. Införlivandet av en känd mängd av L-norvalin eller gluraric syra i extraktionsbufferten kan användas för att korrigera för förluster under provbearbetning 34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har analyserat intracellulära metabolit pooler i S. aureus under in vitro tillväxt i ett rikt, komplext medium. Som bevis på principen, jämförde vi metabolit profiler mellan meticillinkänsliga S. aureus osteomyelit isolera UAMS-1 (vildtyp [WT]) och en isogen stam som saknar den globala transkriptionsregulator Cody (Δ Cody) 26. Steady-state, exponentiella kulturer av stammarna WT och Cody fastställdes i TSB-medium, såsom beskrivits i steg 2 i protokollet. Tillväxtbeteendet hos vildtypen och Cody -null mutantkulturer var liknande, med endast milda skillnader i odlingsutbytet och hastigheten (Figur 1). Användning av RNA-Seq och mikroarrayteknik, vi och andra avslöjade att flera gener som kodar för enzymer involverade i biosyntesen av aminosyror härledda från aspartat var de-undertryckta i Cody -null mutant compared till WT-celler under in vitro tillväxt i TSB (figur 2) 25, 27, 30. Dessutom brnQ1 och brnQ2, som kodar för grenkedjiga aminosyra permeaser, är överuttryckta i codY- null mutant 30, 35.
För att bestämma den utsträckning i vilken steady state intracellulära bestånd av metaboliter som associeras med denna reaktionsväg är förändrade i noll mutanten utförde vi LC-MS-baserade metabolit profilering. WT och codY- null mutanta celler odlades till biologisk steady state och samplades såsom beskrivs i steg 4 i protokollet. Vi bestämde metabolit bestånd genom att integrera toppytan ion intensitet för varje kromatografiskt löst metabolit med hjälp av en analytisk mjukvara (se Material List). Vi korrigerat för differences i biomassa genom att normalisera metabolit abundances till restpeptidkoncentration av varje prov. Vi korrigerade ytterligare dessa värden för potentiella satseffekter mellan prover genom att beräkna den genomsnittliga jonen antalet för alla metaboliter inom varje prov och genom att använda provet vildtyp som referensvärde. Detta tillvägagångssätt möjlig mellan prov jämförelser av metabolit bestånd över förhållanden. Inter-metabolit jämförelser inom ett givet prov kan på liknande sätt uppnås genom att först omvandla normaliserade metabolit abundances från ion counts till molar kvantiteter med användning av metoden enligt standardtillsats.
Vi har jämfört halterna av nyckelmellanprodukter i aspartat väg i UAMS-1 och dess codY- null mutant. Såsom framgår av fig 3, slutprodukterna enligt denna reaktionsväg (t ex treonin och (iso) -leucin) är mer rikligt i Cody -null mutanta celler, medan prekursorer (t.ex.aspartat och o-acetyl homoserin) är mer rikligt i WT-celler. Den kombinerade uppreglering av BrnQ permeaser 36 och ILV biosyntesvägen leder sannolikt att ökningar av isoleucin och leucin 30. Även om skillnaderna är relativt små (<4-faldig), LC-MS-baserad kvantifiering och batch korrigering avslöjar robusta och statistiskt signifikanta förändringar som är förenliga med transkriptionella förändringar som medieras av Cody.
Figur 1: Tillväxt beteende av S. aureus UAMS-1 och en isogen Cody -null mutant i TSB. Att förlänga tiden cellerna bringas i steady-state exponentiell tillväxt, kulturerna tillbaka-späddes till en optisk densitet av 0,05 i färskt medium efter pre-kulturer uppnådde en OD 600 av ~ 1. Prover för LC-MS metabolitanalys uppsamladesfrån experimentella odlingar vid en optisk densitet av ~ 0,5 (pilar). De data som visas är representativa för tre biologiska replikat.
Figur 2: Schematisk av valda metaboliter härrörande från aspartat. Gener och operoner vars produkter katalyserar syntesen av aspartat-family aminosyror är indikerade i kursiv stil; ökningen i transkriptet överflöd i en Cody -null mutant jämfört med vildtyp, enligt bestämning genom RNA-seq analys 29, noteras också. DHP, 2,6-diaminoheptanedioate (2,6-diaminopimelat).
Figur 3: bestånd av metaboliter i aspartat familjen är förändrade i en Cody mutant. De log 2 faldig förändringar i utvalda metaboliter icodY- null mutant jämfört med UAMS-1 (WT) är visade. Förändringen bestämdes genom att dividera den genomsnittliga överflöd av tre biologiska replikat av den codY- null stammen genom den genomsnittliga överflöd av tre biologiska replikat av WT-stammen. Standardfelet mellan biologiska replikat för varje metabolit var <35%. De streckade linjerna indikerar en log 2 1,5-faldig förändring, cutoff användes i detta experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alla småmolekylära metaboliter är anslutna till varandra genom deras gemensamma ursprung i centrala metaboliska vägar. Under exponentiell tillväxt, bakterieceller är på biologisk och metabolisk stabilt tillstånd, vilket ger en ögonblicksbild av det fysiologiska tillståndet under specifika betingelser. Cody följer näringsämnen tillräcklighet genom att svara på ILV och GTP. Som ILV och GTP pooler droppe, är Cody aktivitet sannolikt gradvis sänks, justering av expression av dess målgener att anpassa sig till ökad näringsutarmning 30. En Cody fattiga stammen uppför sig som om ILV och GTP utarmas från omgivningen men endast uppvisar en mycket mild skillnad i tillväxtbeteende i förhållande till Cody-skickliga stam (Figur 1). Således jämförelsen av steady-state pooler av metaboliter i dessa stammar ger oss en unik möjlighet att avslöja vilken utsträckning metabolism konfigureras när näringsämnen är knappa. Det bör noteras att our experiment undersöka metabolit abundances när Cody aktivitet är maximerad (ILV och GTP är mest rikligt förekommande i exponentiell fas). Dock kan andra frågor tas upp i andra faser av tillväxt. Till exempel, i exponentiell fas, är trikarboxylsyra (TCA) cykelaktivitet mycket låg; i post-exponentiell fas, är TCA-cykeln aktiveras 36. Ett antal fenotyper, inklusive metabolit abundances, är beroende av denna aktivering. Dessutom blir agr kvorumregleringssystem aktiv under övergången från exponentiell tillväxt till stationär fas 37. Insamling av prov i post-exponentiella eller stationära fasen kan vara mer relevant för studier som behandlar dessa ämnen. Oavsett när proverna skördas, är det viktigt att samla in, tvätta, och överföra proven till extraktionsbufferten så snabbt som möjligt (dvs inom s) för att minimera metaboliten omsättning som uppstår när stationärt tillstånd är störd.
Den kromatografiska metod som beskrivs här är särskilt lämplig för att analysera polära och icke-polära aminosyror och centrala kol metabolism föreningar. Emellertid kan ytterligare klass-specifika metoder användas för att kvantifiera specifika föreningar av intresse inte kromatografiskt lösas med detta förfarande. Till exempel, att ändra pH hos den kromatografiska mobila fasen genom att ersätta myrsyra med ättiksyra som tillsats har rapporterats för att möjliggöra upplösning av isoleucin och leucin 38. Ändra utvinning förfarandet kan på samma sätt möjliggör återvinning och kvantifiering av labila metaboliter som är känsliga för utvinning metod som används här. Till exempel, kan föreningar såsom cystein som är benägna att disulfidbindningsbildning potentiellt utvinnas efter derivatisering med Ellmans reagens 39. Blåsan extraktionsbuffertar med kvävgas kan bevara NAD * och NADHförhållanden, vilket möjliggör en bedömning av den cellulära redoxtillståndet 40. Nukleosidtrifosfaterna kan sönderdelas i basiska eller obuffrade lösningar; surgöring av extraktionslösningen kan förbättra återvinningen av dessa molekyler 41.
I en exponentiellt växande bakteriekultur, utarmning av ett eller flera näringsämnen leder till övergången till de post-exponentiella och stationära faser av tillväxt. Dessa tillväxtfaserna kännetecknas av distinkta metaboliska tillstånd 42. Kemostat-baserade kulturerna generera en praktiskt taget kontinuerlig biologisk stationärt tillstånd idealisk för genexpression och fysiologiska studier. Emellertid kräver metoden specialiserad utrustning, är tekniskt krävande, och nödvändiggör att en näringsbegränsning tas ut för att upprätthålla en stabil population av celler under flöde. Det sistnämnda kravet medför transkriptionella och fysiologiska störningar som beror på andra än variabeln eller re faktorergulator som analyseras. För att säkerställa att våra kolv baserade resultaten är representativa för celler som växer exponentiellt vid steady state och inte av en övergång mellan två faser, använder vi en dubbel-back utspädningsstrategi med en konsekvent kolv: volymförhållande (små förändringar i syrenivåer kan leda till förändrad metabolism 36, 42). Efter en initial utspädning av övernattskulturer, är dessa celler odlades till en OD 600 av ~ 1,0, back-späddes till ett OD 600 på ~ 0,05, och skördades när de når ett OD 600 av ~ 0,5. En sådan metod späder också cytoplasmiska molekyler som ansamlas under tillväxt över natten, inklusive stabila RNA. Indeed, är RNAIII, effektorn av agr kvorumregleringssystem, en sådan RNA och reglerar uttrycket av några av samma genmål som Cody 25, 43, 44. Ackumulerade RNAIII kan maskera Cody-DEPendent reglering, vilket leder till en underskattning av styrkan i förtryck eller stimulering genom Cody (Sharma och Brinsmade, opublicerade resultat).
En begränsning av denna analys är att det ger en omedelbar glimt av metabolit bestånd i cellen; Inga slutsatser kan dras av resultaten när det gäller förändringar i flödet genom en given väg. Till exempel, bestånd av lysin och metionin mellan de två stammarna undersöktes förändrades inte, trots de-repression av biosyntetiska enzymer i codY- null-stam (fig 2 och 3). The Cody -null stammen kan i själva verket vara att generera mer lysin och metionin, men de kan snabbt omvandlas till andra föreningar; således, behöver dessa molekyler inte ackumuleras. Med användning av 13 C- eller 15 N-märkta kol- eller kvävekällor skulle tillåta oss att följa kol- och kväve skelett genom stora metaboliska korsningar 45 <sup>, 46.
Vi har använt den beskrivna metoden för att belysa förändringar i metabolit pooler i S. aureus, B. subtilis 29, Mycobacterium tuberculosis 47, och Enterococcus faecium 48, men metoden kan tillämpas på andra grampositiva och gramnegativa bakterier, inklusive andra humana patogener lätt odlas i laboratoriet. I själva verket kan integrera metabolomic och transcriptomic informationen avslöja oväntade kopplingar mellan metabolism och virulens, som kan leda till nya strategier för att behandla infektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats delvis av en NIH Pathway to Independence Award (bevilja GM 099.893) och fakultets start medel till SRB, liksom ett forskningsprojekt Grant (Grant GM 042.219). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och tolkning, eller beslutet att lämna arbetet för publicering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipmenta | |||
| DeLong Culture Flask (250 mL) | Belco | 2510-00250 | |
| Sidearm Flask, 500 mL | Pyrex | 5340 | |
| 3-hole Rubber Stopper, #7 | Fisher | 14-131E | |
| Stainless Steel Filter holder/frit | VWR | 89428-936 | |
| Petri Dish, 35 mm | Corning | 430588 | Not tissue culture treated |
| Mixed cellulose ester membrane, 0.22 μm pore size | Millipore | GSWP02500 | |
| Impact-resistant tubes, 2 mL | USA Scientific | 1420-9600 | |
| Silica Beads, 0.1 mm | Biospec Products Inc | 11079101Z | |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Instruments | EQ03119-200-RD000.0 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce (Thermo Scientific) | 23235 | |
| Cogent Diamond hydride type C column | Agilent | 70000-15P-2 | |
| Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series | Agilent | G6230B | |
| Quat Pump, 1290 Series | Agilent | G4204A | |
| Bin Pump, 1290 Series | Agilent | G4220A | |
| Valve Drive, 1290 Series | Agilent | G1107A | |
| Isocratic Pump, 1290 Series | Agilent | G1310B | |
| TCC, 1290 Series | Agilent | G1316C | |
| Sampler, 1290 Series | Agilent | G4226A | |
| Thermostat, 1290 Series | Agilent | G1330B | |
| Chemical | |||
| Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211825 | |
| Difco Agar, Granulated | Becton Dickinson | 214530 | Solid media contains 1.5% [w/v] agar |
| Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10x | Ambion | AM9624 | Dilute fresh to 1x with ultra-pure water |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-500 | Optima LC-MS |
| Methanol | Fisher Scientific | A456-500 | Optima LC-MS; toxic |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318 | For mass spectrometry, 98% |
| Software | |||
| MassHunter | Agilent | G3337AA | |
| Bacterial Strain | Species | Strain | Genotype |
| SRB 337 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | wild type |
| SRB 372 | Staphylococcus aureus | USA200 MSSA UAMS-1 | ΔcodY::erm |
| aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies. | |||
References
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
- Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
- Ibberson, C. B., et al. Staphylococcus aureus hyaluronidase is a CodY-regulated virulence factor. Infect. Immun. 82 (10), 4253-4264 (2014).
- Lee, C. Y., Iandolo, J. J. Mechanism of bacteriophage conversion of lipase activity in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 164 (1), 288-293 (1985).
- Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infect. Immun. 81 (4), 1316-1324 (2013).
- Somerville, G. A., Proctor, R. A. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 (2), 233-248 (2009).
- Seidl, K., et al. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (4), 1183-1194 (2006).
- Richardson, A. R., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Regulating the intersection of metabolism and pathogenesis in Gram-positive bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (3), 1-27 (2015).
- Geiger, T., et al. Role of the (p)ppGpp synthase RSH, a RelA/SpoT homolog, in stringent response and virulence of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78 (5), 1873-1883 (2010).
- Gaupp, R., et al. RpiRc is a pleiotropic effector of virulence determinant synthesis and attenuates pathogenicity in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 84 (7), 2031-2041 (2016).
- Serror, P., Sonenshein, A. L. Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol. Microbiol. 20 (4), 843-852 (1996).
- Sonenshein, A. L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 8 (2), 203-207 (2005).
- Brinsmade, S. R. CodY, a master integrator of metabolism and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Genet. , [Epub ahead of print] (2016).
- Molle, V., et al. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis. J. Bacteriol. 185 (6), 1911-1922 (2003).
- Moses, S., et al. Proline utilization by Bacillus subtilis: Uptake and catabolism. J. Bacteriol. 194 (4), 745-758 (2012).
- Lobel, L., Herskovits, A. A. Systems level analyses reveal multiple regulatory activities of CodY controlling metabolism, motility, and virulence in Listeria monocytogenes. PLoS Genet. 12 (2), 1-27 (2016).
- Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. CodY-mediated regulation of guanosine uptake in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 193 (22), 6276-6287 (2011).
- den Hengst, C. D., Buist, G., Nauta, A., Van Sinderen, D., Kuipers, O. P., Kok, J. Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. Microbiol. 187 (2), 512-521 (2005).
- Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la différence. Mol. Microbiol. 32 (2), 223-232 (1999).
- Dineen, S. S., McBride, S. M., Sonenshein, A. L. Integration of metabolism and virulence by Clostridium difficile CodY. J. Bacteriol. 192 (20), 5350-5362 (2010).
- Dineen, S. S., Villapakkam, A. C., Nordman, J. T., Sonenshein, A. L. Repression of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol. 66 (1), 206-219 (2007).
- Hendriksen, W. T., et al. CodY of Streptococcus pneumoniae: Link between nutritional gene regulation and colonization. J. Bacteriol. 190 (2), 590-601 (2008).
- Bennett, H. J., et al. Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes: Identification of the CodY regulon and its role in virulence. Mol. Microbiol. 63 (5), 1453-1467 (2007).
- Stenz, L., Francois, P., Whiteson, K., Wolz, C., Linder, P., Schrenzel, J. The CodY pleiotropic repressor controls virulence in Gram-positive pathogens. FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 62 (2), 123-139 (2011).
- Majerczyk, C. D., et al. Direct targets of CodY in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 192 (11), 2861-2877 (2010).
- Majerczyk, C. D., Sadykov, M. R., Luong, T. T., Lee, C., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. J. Bacteriol. 190 (7), 2257-2265 (2008).
- Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: A regulatory link between metabolism and virulence gene expression. J. Bacteriol. 191 (9), 2953-2963 (2009).
- Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 5 (12), 917-927 (2007).
- Brinsmade, S. R., et al. Hierarchical expression of genes controlled by the Bacillus subtilis global regulatory protein CodY. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111 (22), 2-7 (2014).
- Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 101 (3), 495-514 (2016).
- Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W.
- Somerville, G. A., et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival. Infect. Immun. 70 (11), 6373-6382 (2002).
- Somerville, G. A., Said-Salim, B., Wickman, J. M., Raffel, S. J., Kreiswirth, B. N., Musser, J. M. Correlation of acetate catabolism and growth yield in Staphylococcus aureus: Implications for host-pathogen interactions. Infect. Immun. 71 (8), 4724-4732 (2003).
- Brinsmade, S. R., Kleijn, R. J., Sauer, U., Sonenshein, A. L. Regulation of CodY activity through modulation of intracellular branched-chain amino acid pools. J. Bacteriol. 192 (24), 6357-6368 (2010).
- Kaiser, J. C., Omer, S., Sheldon, J. R., Welch, I., Heinrichs, D. E. Role of BrnQ1 and BrnQ2 in branched-chain amino acid transport and virulence in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 83 (3), 1019-1029 (2015).
- Ledala, N., Zhang, B., Seravalli, J., Powers, R., Somerville, G. A. Influence of iron and aeration on Staphylococcus aureus growth, metabolism, and transcription. J. Bacteriol. 196 (12), 2178-2189 (2014).
- Novick, R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Micorbiol. 48 (6), 1429-1449 (2003).
- Pesek, J. J., Matyska, M. T., Fischer, S. M., Sana, T. R. Analysis of hydrophilic metabolites by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry using a silica hydride-based stationary phase. J. Chromatog. A. 1204 (1), 48-55 (2008).
- Guan, X., Hoffman, B., Dwivedi, C., Matthees, D. P. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 31 (2), 251-261 (2003).
- Sporty, J. L., Kabir, M. M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Lin, S. J., Bench, G. Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae. J. Sep. Sci. 31 (18), 3202-3211 (2008).
- Rabinowitz, J. D., Kimball, E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli. Anal. Chem. 79 (16), 6167-6173 (2007).
- Somerville, G. A., Powers, R. Growth and preparation of Staphylococcus epidermidis for NMR metabolomic analysis. Methods Mol. Biol. 1106, 71-91 (2014).
- Roux, A., Todd, D. A., Velazquez, J. V., Cech, N. B., Sonenshein, A. L. CodY-Mediated regulation of the Staphylococcus aureus Agr system integrates nutritional and population density signals. J. Bacteriol. 196 (6), 1184-1196 (2014).
- Guillet, J., Hallier, M., Felden, B. Emerging functions for the Staphylococcus aureus RNome. PLoS Pathog. 9 (12), 1003767 (2013).
- Sauer, U., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J. Bacteriol. 181 (21), 6679-6688 (1999).
- Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., Frommer, W. B. Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics. Methods Mol. Biol. 553 (1), 355-372 (2009).
- de Carvalho, L. P. S., Fischer, S. M., Marrero, J., Nathan, C., Ehrt, S., Rhee, K. Y. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17 (10), 1122-1131 (2010).
- Weisenberg, S. A., Butterfield, T. R., Fischer, S. M., Rhee, K. Y. Suitability of silica hydride stationary phase, aqueous normal phase chromatography for untargeted metabolomic profiling of Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. J. Sep. Sci. 32 (13), 2262-2265 (2009).
