Summary
蜜蜂殖民地的丧失对作物授粉服务构成挑战。目前的传粉者保护措施需要采取替代方法，以尽量减少蜂蜜与使用驱虫剂的有害农药的接触。在这里，我们提供了一个可视化跟踪协议的详细方法来筛选蜜蜂的威慑。
Abstract
欧洲蜜蜂Apis mellifera L.是一种经济上和农业上重要的传粉媒介，每年产生数十亿美元。蜜蜂殖民地数量自1947年以来一直在美国和许多欧洲国家逐渐下降。许多因素在这种衰退中起着重要的作用，包括蜜蜂无意中暴露于农药。制定新的方法和法规有必要减少这些授粉者的农药暴露。一种方法是使用驱避剂化学物质，从最近的农药处理作物中阻止蜂蜜蜜蜂。在这里，我们描述了一个方案，以辨别蜂蜜蜜蜂暴露于选择的驱虫剂化学物质的威慑。蜜蜂饲养员在测试前15小时在培养箱中收集和饿死。将单个蜂蜜蜜蜂放入具有糖琼脂糖立方体（对照处理）或糖琼脂糖复合立方体（驱避剂处理）的培养皿中到盘中间培养皿作为竞技场，放置在灯箱内的照相机下，使用视频跟踪软件记录蜜蜂运动活动。分析总共8个对照和8个驱虫剂处理10分钟，每次处理用新的蜂蜜蜜蜂复制。在这里，我们证明蜂蜜蜜蜂通过复合处理从糖琼脂糖方块中被阻止，而蜂蜜蜂蜜被吸引到糖琼脂糖立方体而没有添加化合物。
Introduction
欧洲蜜蜂， Apis melliferaL。是一种经济和农业上重要的昆虫，提供全球超过2000亿美元的授粉服务1 。在美国和欧洲，蜂蜜的数量一直在减少。美国已经失去了1947-2008年管理的蜂蜜殖民地的60％，而欧洲已经失去了ca。 1961-2007年的27％ 2，3 。有许多因素可能导致殖民地损失数量增加，包括但不限于寄生虫侵袭，病原体感染，养蜂行为和农药使用2-4 。
蜂蜜可能通过两个主要途径暴露于农药。当觅食者接触作物时，可能发生蜂巢外的农药暴露已经喷洒了化学物质以防止害虫。蜂巢中的农药暴露可以发生在养蜂人利用化学物质来控制螨虫，细菌和微孢子虫等害虫和病原体时。在美国和加拿大的5,6个蜂巢中，已经在蜡，花粉和蜂蜜样品中鉴定了农药残留。农药与蜂蜜接触的影响包括急性毒性以及亚致死作用，如麻痹，定向障碍，行为和健康变化1，7 。由于现代农业需要使用农药来维持高产量，这些化学品将来将继续得到依赖2 。为了更好地保护蜂蜜免受农药暴露，需要制定新的议定书和条例5 。一种可能的保护方法是使用驱避剂来减少蜂蜜在杀虫剂中的暴露，同时觅食食物。
驱虫剂（IRs）通常被用作针对节肢动物疾病载体的个人叮咬保护措施8 。超过60年前开发的最广泛使用和成功的IR是DEET 8,9 。被认为是驱虫剂测试的黄金标准，被世界卫生组织和环境保护署用作新型驱虫剂筛选的阳性对照10 。此外，DEET已被发现分散蜂蜜从威胁到他们的殖民地11 。与个人IR相关的当前属性包括：（1）对大量节肢动物的持久影响; （2）用于皮肤或衣服时对使用者无刺激性; （3）无臭或令人愉快的气味（4）对服装无影响; （5）施用于皮肤时不产生油性外观，并能够经受使用者的出汗，洗涤和擦拭; （6）对常用塑料无影响;和（7）化学稳定和价格适中广泛使用12 。用于蜜蜂的驱虫剂只需要一些这些属性，如持久的效果，对施用器无刺激性，无臭或令人愉快的气味，化学稳定且价格实惠，广泛使用，对蜂蜜无毒。然而，在深入探索这些属性之前，需要一种以高通量方式筛选化合物排斥/威慑的方法。在这里，我们描述了实验室测定方法，筛选化合物以抑制蜂蜜蜜蜂，这是确定排斥性的重要步骤。以前的研究修改了以前的研究，描述了一种视觉跟踪方法来评估农药对蜜蜂的亚致死效应13 。豪这个方案的不同之处在于，它旨在测量可能阻止蜂蜜从农药处理的作物中的候选驱虫剂的影响。没有推荐的蜂蜜蜜化学威慑实验室测试方案，因此，该方案提供了一种简单的筛选方法。
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Protocol
1.准备糖琼脂糖立方体
- 称取8克糖并置于50mL锥形瓶中。
- 向锥形瓶中加入20mL去离子水。通过旋转烧瓶来溶解糖。
- 称量170 mg琼脂糖，并加入糖溶液。
- 将糖 - 琼脂糖溶液在微波炉中加热25秒。将琼脂糖溶解在糖溶液中。
- 让烧瓶和糖琼脂糖溶液冷却。
注意：烧瓶应该是凉爽的接触，但不要让溶液凝固。- 为了制备用于对照处理的糖琼脂糖立方体，将半冷糖 - 琼脂糖溶液倒入称重模具中。
注意：称重模具的尺寸为1.5 x 1.5 x 0.3 cm 3 。 - 为了制备用于驱避剂处理的糖 - 琼脂糖复合立方体，向半冷却溶液中加入所需量的化合物（ 例如 ，1％DEET in sugar-agarose溶液（v / v））。旋转烧瓶以混合化合物，然后将溶液倒入称重模具中。
注意：此时将准备八个控制模具和八个测试模具。控制模具不含驱避剂。
- 为了制备用于对照处理的糖琼脂糖立方体，将半冷糖 - 琼脂糖溶液倒入称重模具中。
- 将糖琼脂糖立方体放入冰箱中的模具中5-10分钟。从称重船模具中取出固化的糖 - 琼脂糖立方体，并将其放入带有湿纸巾的塑料容器中。
- 将容器放入冰箱保存。糖琼脂糖立方体应在制备后7天内使用。
2.编程视频跟踪软件和实验设置
- 在实验资源管理器栏中的实验设置栏（在跟踪软件中，请参阅材料表），位于屏幕左侧，确保选择了正确的摄像头，并将视频录制以培养皿为中心。
- 如果视频录制需要居中，请进入摄像机的设置，并在AOI控制下，选择中心X和中央Y选项。
- 在实验设置下，将场地数量更改为16.在跟踪功能下，选择中心点检测。
- 选择竞技场设置来设置测试所需的竞技场。
- 将16个陪替氏培养皿放置在灯箱顶部的4 x 4图案上，位于相机下方（ 图1 ）。
注意：这些菜肴用于创建录音舞台，并且是空的。
- 将16个陪替氏培养皿放置在灯箱顶部的4 x 4图案上，位于相机下方（ 图1 ）。
图1：灯箱上的培养皿配置。灯箱顶部放置4×4块培养皿。这种安排提供了对v的控制和驱避治疗的简单识别实时跟踪协议。 请点击此处查看此图的较大版本。
- 在“竞技场设置”中，使用位于右侧工具面板上的抓取背景按钮拍摄16种培养皿。这将用作设置舞台的模板。
- 从“竞技场设置”屏幕顶部的工具栏中选择“创建椭圆”，并创建一个圆圈，该圆圈与抓取图像中的一种培养皿的直径相匹配。将Arena 1标记放入圆圈（ 图2 ）。
图2：可视化跟踪软件竞技场设置的屏幕快照。圆内的对角条纹的观察提供了圆圈中检测区域的确认。一个为每个正方形提供1区标记，并定义每个培养皿的目标区域。 请点击此处查看此图的较大版本。
- 选择位于右侧工具面板“Arena 1”下方的“Zone Group 1”。从屏幕顶部的工具栏中选择“创建矩形”。使用此方法创建一个30 x 30像素的正方形，然后将其放置在上一步中创建的圆的中心。从顶部工具栏中选择“添加区域”，然后单击正方形中间。移动Zone 1标记，使其位于正方形中。
注意：创建的正方形是进料区域，不要求进料区域与所列的尺寸完全相同，只要其略大于糖琼脂糖立方体。
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图3：完成竞技场设置的屏幕截图。完成的竞技场设置应该是这个例子。 请点击此处查看此图的较大版本。
- 在右侧工具面板中选择“竞技场1”，然后单击重复的完整竞技场。从下拉菜单中选择“All Other Arenas”，然后单击“确定”。将重复的竞技场设置移到残留的陪替培养皿中（图3）。
- 选择“Arena 1”，然后在顶部工具栏上选择“Calibrate Scale”。绘制校准线穿过竞技场1培养皿的直径。将直径测量值更改为9厘米（正在使用的培养皿的直径）。在右侧工具面板上选择“验证竞技场设置”。
- 选择 ”检测设置“在左边的控制栏上。
- 选择“检测设置1”，然后在右侧工具箱的下拉菜单中选择“灰度调整”。在检测下，设置范围为0到83（ 图4A ）。
- 右键单击“检测设置”，并创建一个名为“检测设置2”的新设置。确保“灰度调整”仍然被选中，但不要更改其他参数。
注意：在场景的视频窗口中将会有大的黄色圆圈。这将有助于在记录之前将培养皿排列在正确的位置（ 图4B ）。
图4：检测设置1和2的屏幕截图。 （ A ）显示了对a进行灰度比例校正的场景蜜蜂在培养皿中摄取。 （ B ）显示竞技场检测区域，以便在试验之间进行培养皿的定位。 请点击此处查看此图的较大版本。
- 在“实验资源管理器”中选择“试用列表”，然后单击顶部工具栏中的“添加变量”。将用户定义的变量命名为“处理”。在用户定义的“治疗”列中选择“预定义值”下拉列，并将C（控制）和T（治疗）添加为预定义值。选择顶部工具栏上的“添加试验”按钮。添加两个试验，然后为每个竞技场选择是否是控制竞技场（C）或治疗竞技场（T）（ 图5 ）。
网络连接gure 5：试用列表的屏幕截图。因为程序使用这里的信息来分离数据以对其进行统计分析，所以正确标记场地是很重要的。 请点击此处查看此图的较大版本。
- 选择“实验资源管理器”面板下的“数据配置文件”。在左侧列中，选择“用户自定义独立变量”标题下的“处理”。这将在流程图的区域中添加一个“过滤器”框。在弹出框中选择“C”，然后将新创建的过滤器放在“开始”框和“结果1”框之间。流程图箭头应该调整，以便它们从起始框指向过滤器，最后到结果1。
- 重复步骤2.12，但是这次为过滤器选择“T”，然后选择“结果”在“共同元素”部分。将新创建的框移动到流程图区域并用箭头连接框（ 图6 ）。
图6：数据配置文件的屏幕快照。这显示了如何设置流程图以在统计分析中获得适当的分离。 请点击此处查看此图的较大版本。
- 保存文件。
收集蜜蜂个人
- 穿上防护服，选择蜂蜜收集蜜蜂（主要是牧民）。
- 拆下蜂巢的外盖和内盖。使用蜂巢工具从顶部的蜂巢体中选择一个不包含巢的框架。轻轻地将框架从蜂巢盒中取出。
- 检查蜂巢蜜蜂的框架。如果她不在那里，将蜜蜂工人从框架上扫出一个容器运输。收集足够的个人能够对每个要测试的化合物进行两次完整的试验（每个试验使用16个对照）。
注意：所收集的个人应主要为牧师;然而，可能还有其他老年人，如收集中包括的护士蜜蜂。 - 记下蜜蜂被去除的时间。将它们转移到装有空气孔的9cm×7cm×9cm塑料盒中，并将它们放入32℃和70％相对湿度的培养箱中。
- 蜜蜂蜜蜂15小时。
注意：如果蜜蜂在被测试之前的晚上被收集，通常效果最佳。
4.进行视觉跟踪测定
- 启动视觉跟踪程序并打开保存d实验文件是为此测定创建的。
- 选择“检测设置2”。
- 将控制糖琼脂糖立方体放入16种培养皿中8种的中心。在剩下的8道菜中用糖琼脂糖复合物（威慑）重复此过程。
- 使用镊子从塑料盒中取出一只蜂蜜，将其放入控制培养皿中。
- 对剩余的15种培养皿重复步骤4.4。
- 将所有的菜肴放在灯箱上并定位，使得竞技场检测区域（选择检测设置2时在计算机屏幕上显示）适合每个培养皿场地。通过设置为红色光谱的LED灯阵列从下面照亮灯箱。将整个盒子和相机用黑色塑料片包围，以消除外部光线并减少场内阴影。
- 设置培养皿后，确保“检测设置1”为选择设置。
注意：在这一点上，视觉跟踪软件应该只拾取培养皿中蜂蜜。 - 从实验资源管理器中选择“采集”。按右侧的采集控制弹出框中的绿色“开始试用”按钮开始录制。
- 运行测定10分钟，然后单击采集控制弹出框上的红色“停止试验”按钮停止录制。
- 从培养皿中取出个体，将其放入一个独立的容器中，以免两次测试。
- 对同一化合物的第二次试验重复步骤4.4-4.10。
注意：该方法可以修改，以增加用户根据需要处理的蜂蜜数量。 - 在“实验资源管理器”中选择“统计”，然后单击“计算”。
- 将数据导出到数据管理器软件，然后使用one-w分析数据的重要性使用Tukey的后测试进行方差分析，使用优选的统计软件程序进行不配对的t检验。
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Representative Results
开发了一个视觉跟踪方案，用糖琼脂糖（对照处理）或糖 - 琼脂糖复合立方体（威慑处理）记录蜂蜜在目标区域消耗的时间。使用统计软件程序分析记录的时间，并将目标区域的平均消耗时间±标准误差报告为条形图。作为驱虫/威慑试验的黄金标准DEET在本协议中被用作阳性对照。蜂蜜蜜蜂提供糖琼脂糖立方体（阴性对照）在目标区域花费343±26秒，而蜂蜜蜜蜂提供了糖 - 琼脂糖DEET（驱避剂），在目标区域消耗16±4秒（ 图7 ）。 DEET显着减少蜜蜂在目标区域花费的时间。 95％与对照治疗相比。
然后通过该方案筛选出确定蜂蜜蜜蜂威慑感兴趣的化合物。图8A表示不抑制蜂蜜从目标区域中的食物来源的化合物。蜂蜜蜜蜂在对照菜肴的目标区域花费的平均时间约为 352±60秒， 较大约 282±43秒，在含有化合物A的糖琼脂糖块的培养皿内的蜂蜜蜜蜂。 图8B表示除了DEET之外的化合物，其具有类似的对蜂蜜蜜的威慑效果。在控制培养皿内的蜜蜂保持在目标区域，平均时间约为 493±31秒，比较。在含有混合B的糖琼脂糖立方体的培养皿内的蜂蜜中为23±3秒。这些结果验证了该方案的用途，以筛选蜂蜜的化学阻遏物。在使用本方案之前，可以使用化合物有必要进行时间过程试验，以确定蜜蜂的饥饿时间。
图7： 视觉跟踪软件的结果示例Detections Protocol Positive Control DEET。蜜蜂在晚上从蜂巢中收集，并记录清除时间。然后将它们转移到含有空气孔的塑料容器中。将箱子放入设置在32℃的培养箱中并保持过夜15小时。第二天早晨，将个体放入含有对照糖琼脂糖立方体或DEET-输入的糖 - 琼脂糖立方体的培养皿中。然后运行描述的威慑协议。该图所示的结果是防水黄金标准DEET的典型值。从这个数字可以看出，饥饿的蜜蜂在喂食z中平均花费的时间具有对照立方体（ 约 343s）的个体比使用DEET浸渍的立方体（ 约 16s）在进料区域平均花费的平均时间显着更大（P <0.0001）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图8： 视觉跟踪软件测试化合物的结果示例。 （ A ）表示显示对照菜肴中目标区域中个体所花费的平均时间（ 约 352秒）的数据与在化合物A（ 约 282秒）的测试盘中在目标区域中消耗的平均时间没有显着差异）。 （ B ）表示在对照幼崽之间的目标区域花费的平均时间的显着差异的数据（ 约 493秒）和化合物B注入的立方体（ 约 23秒）。进行非配对t检验以确定显着性（P <0.0001; DF 15）。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这种视觉跟踪协议提供了一种以相对快速和容易的方式筛选蜜蜂的化学阻止剂的简单方法。蜂蜜蜜蜂的化学阻碍实验室测试没有推荐的方案。以前的半场和全场研究已经检查了蜂蜜驱虫剂14,15 ;然而，所描述的协议是耗时的，劳动密集的，并且需要在一般实验室之外的附加设备资源。该方案被设计为对这种化合物与蜂蜜蜜蜜进行半场或全场测试之前对化学威慑进行先决条件的评估。
在筛选个体以评估蜂巢以外的蜂蜜蜜蜂的化学威慑时，面临挑战。例如，蜜蜂是依赖于蜂巢内的信息素影响行为的社会昆虫14 。这个协议要求除了饥饿之外，还可以使用不再接受信息素提示的个人。需要饥饿来规范个别蜜蜂的喂养反应。饥饿时间由24小时课程研究确定。应该注意的是，饥饿对蜂蜜蜜蜂有不利影响。例如，蜜蜂从蜂巢收集后18小时变得昏睡。根据这些观察结果，蜜蜂从蜂巢收集后饥饿15小时。
本协议涉及避免不成功筛选的关键步骤包括：（1）至少12小时的饥饿后进行测试; （2）避免饥饿后进行测试超过18-19小时，因为这样会降低蜂蜜的活力; （3）每个试验取代对照个体; （4）管理外部光线并控制场内阴影。此外，在筛选新的化合物sc之前，应更换培养皿颖。有时，蜜蜂会在记录期间在培养皿内排便。这通常不会干扰记录或数据收集。每个筛网后，所有培养皿应彻底清洗，以除去糖琼脂糖和化合物残留物以及蜂蜜蜂粪。
该方案主要设计用于筛选化合物用于威慑蜂蜜，但可以容易地适应于辨别其他昆虫物种的威慑。使用视觉跟踪软件的主要优点 是为了进行每个化合物的筛选而进行完整的录像。如果需要检查和分析每个记录，调查员可以选择感兴趣的文件，并使用相同或新的参数快速地进行屏幕显示。视觉跟踪软件还具有检测小于蜂蜜的个别昆虫的能力。然而，这可能需要相机领域的减少的视野和较少的竞技场s被记录在一个屏幕上。该方案的强度是在几分钟内筛选化合物在实验室环境中的威慑作用的能力。因此，可以通过将选定的候选人的感兴趣的复合库减少到现场测试来节省时间和金钱。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
我们要感谢Thomas Kuhar博士使用视觉跟踪软件和设备。我们感谢詹姆斯·威尔逊和斯科特·奥尼尔的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Kimax | 26500-50 | used for making the sugar/agarose cubes |
| Sugar | Kroger | any similar product will sufffice | |
| Deionized water | acquired in house | ||
| Agarose | Apex | 20-102 | used for making the sugar/agarose cubes |
| Mold for agarose cubes (Weigh Boat) | any mold that will provide the researcher with a 1.5 cm x 1.5 cm x 0.3 cm sugar/agarose cube will suffice | ||
| EthoVision XT | Noldus | visual tracking software | |
| 633 nm LEDs | Cyron | HTP904E | These lights were placed into a constructed light box to illuminate the arenas from below. The box was a simple wooden structure with a frosted plastic/plexi glass cover that allowed the light to disperse upwards without any glare. |
| Laptop or PC | Dell | Inspiron One 2305 | necessary for video tracking software. Any pc device capable of runnin tbe visual tracking software will suffice |
| Bee Keeping protective clothing | Dadant & Sons Inc | V0126 | any protective hood and jacket will suffice |
| Hive tool | Dadant & Sons Inc | M00757 | used to open honey bee hive |
| Container for honey bees | any container suitable for housing and storing honey bees will suffice | ||
| Featherweight forceps narrow tip | Bioquip | 4748 | used to select individual honey bees |
| 9 cm (diameter) Petri dish | Fisher Scientific | S01778 | arena used to contain individual honey bees during video tracking |
| Recording Device (Camera) | Basler | acA-1300-60gm | any device that can record the subject clearly and transfer the file to a computer will suffice |
| GraphPad Prism | Graphpad | any statistical software package will suffice |
References
- Gallai, N., Salles, J. M., Settele, J., Vaissière, B. E. Economic valuation of the vulnerability of world agriculture confronted with pollinator decline. Ecol Econ. 68 (3), 810-821 (2009).
- van Engelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, Suppl 1. S80-S95 (2010).
- Aizen, M. A., Harder, L. D. The Global Stock of Domesticated Honey Bees Is Growing Slower Than Agricultural Demand for Pollination. Current Biol. 19 (11), 915-918 (2009).
- Smith, K. M., Loh, E. H., Rostal, M. K., Zambrana-torrelio, C. M., Mendiola, L., Daszak, P. Pathogens, Pests, and Economics Drivers of Honey Bee Colony Declines and Losses. Ecohealth. 10, 434-445 (2014).
- Mullin, C. A., Frazier, M., et al. High Levels of Miticides and Agrochemicals in North American Apiaries: Implications for Honey Bee Health. PLoS ONE. 5 (3), (2010).
- Li, Y., Kelley, R. A., Anderson, T. D., Lydy, M. J. Development and comparison of two multi-residue methods for the analysis of select pesticides in honey bees, pollen, and wax by gas chromatography - quadrupole mass spectrometry. Talanta. 140, 81-87 (2015).
- Kakumanu, M. L., Reeves, A. M., Anderson, T. D., Rodrigues, R. R., Williams, M. A., Williams, M. A. Honey Bee Gut Microbiome Is Altered by In-Hive Pesticide Exposures. Front Microbiol. 7, 1-11 (2016).
- Katz, T. M., Miller, J. H., Hebert, A. A. Insect repellents: Historical perspectives and new developments. J Am Acad Dermatol. 58 (5), 865-871 (2008).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents. Pestic Biochem Phys. 106 (3), 149-155 (2013).
- Lawrence, K. L., Achee, N. L., Bernier, U. R., Mundal, K. D., Benante, J. P. Field Evaluations of Topical Arthropod Repellents in North, Central, and South America. J Med Entomol. 51 (5), 980-988 (2014).
- Collins, A. M., Rubink, W. L., Cuadriello Aguilar,, I, J., Hellmich Ii,, L, R. Use of insect repellents for dispersing defending honey bees (Hymenoptera Apidae). J Econ Entomol. 89 (3), 608-613 (1996).
- Brown, M., Hebert, A. A. Insect repellents: An overview. J Am Acad Dermatol. 36 (2), 243-249 (1997).
- Teeters, B. S., Johnson, R. M., Ellis, M. D., Siegfried, B. D. Using video-tracking to assess sublethal effects of pesticides on honey bees (Apis mellifera L.). Environ Toxicol Chem. 31 (6), 1349-1354 (2012).
- Vallet, A., Cassier, P., Lensky, Y. Ontogeny of the fine structure of the honeybee (Apis mellifera L.) workers and the pheromonal activity of 2-heptanone. J Insect Physiol. 37 (11), 789-804 (1991).
- Free, J. B., Ja Pickett,, Ferguson, aW., Simpkins, J. R., Smith, M. C. Repelling foraging honeybees with alarm pheromones. J Agr Sci. 105 (2), 255 (1985).
